小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定
小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定
摘要：
过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，是过氧化物酶体的标志酶尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。
过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶。建立了一套适合一般实验室分离纯化过氧化氢酶的方法，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。
现报告如下：
一、实验器材
1、实验动物：成年雄性小鼠（河北医科大学实验动物中心提供）
2、主要器材：托盘天平，组织捣碎机，离心管，H2050R高速冷冻离心机，CU600型电
热恒温水箱，DYY-8L型电泳仪（北京市六一仪器厂），H2S-H水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），垂直板型电泳装置，制冰机，4℃冰箱
二、实验方法
来
6g；按1：
pH4.0）,
是在过氧化氢酶中加入适当浓度的中性盐溶液，破坏其水化膜，使其成盐析状态而沉淀下来，离心后可除去部分杂蛋白。
盐析法粗提过氧化氢酶：缓慢加入上清液体积0.06倍的0.5mol/L的硫酸钠溶液，冰浴搅拌1h，离心（4℃, 6500rpm, 10min），保留离心沉淀；加入4倍肝重（0.1mol /L pH7.8）的磷酸缓冲液手动玻璃匀浆器使沉淀溶解,离心（4℃, 4000rpm, 10min）,保留上清备用。
●透析
是利用透析袋的半透过性，在一定透析条件下，使过氧化氢酶以不变性的沉淀形式析出，复溶后，可除去部分杂蛋白。
透析法纯化过氧化氢酶：将上清液置于透析袋，透析两周（透析液：20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L氯化钠）中途更换一次透析液；透析后取出浊溶液，离心（4℃, 6500rpm, 10min），取沉淀，溶于0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液中,离心（4℃,4500rpm, 10min）收获上清，得到小鼠肝脏过氧化氢酶溶液。将收获的上清液（3组合并为一组）放入处理过的透析袋中，置于50%的甘油中包埋浓缩24小时后放冰箱保存，
制备过程中各阶段产物用比色测定法测定酶活，分析制备效率。分离纯化产物酶活性回收率用各步产物的酶活占匀浆上清液酶活的百分比来表示。
●层析
是根据混合物中各种物质分子大小不同，在凝胶层柱的扩散移动速度不同使混合物分离的方法。
分别在280nm和407nm波长下测光吸收值，合并收集峰值重合管，得到纯化过的过氧化氢酶。
取出装柱好的层析柱，打开出口使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床面平齐时，沿柱口旋转加样，同时开始收集层析柱的流出液，每管收集约25滴，一次在407nm和280nm波长下，测定各管吸光度值。并绘制曲线。
2、过氧化氢酶的性质测定
制作标准蛋白的选择：选择与待测样品相同组成的蛋白质作为标准蛋白溶液。
标准蛋白溶液的配制：将标准蛋白经凯式定氮法准确测定其蛋白含量，再用无离子水配成0.1mg∕mL储存液。
按照表（如下）配成不同浓度的标准蛋白组，编上号码，以第一管为空白管，在分光度计上测定650mn处的光密度值。
以各标准浓度为横坐标，各管密度值为纵坐标作图，绘制标准曲线。
米式常数值测定
滴定法：以H2O2 为底物，用过氧化氢酶催化其分解10min，加入硫酸终止催化反应，并用已知浓度高锰酸钾滴定剩余的H2O2，换算出减少的H2O2的量，进而计算出酶的活力。在Km值测定中采用此法测定酶活力。
过氧化氢酶活力单位定义为：以每分钟催化1μmolH2O2减少所需的过氧化氢酶的量作为一个酶活性单位（U）。样品的比活以每毫克样品蛋白所含的酶活性单位数表示。
三、实验结果
图如下：
相对迁移率Rf=样品迁移距离/BPB的迁移距离
LgMr（层析蛋白）=4.78 Mr（层析蛋白）=60255.9
Mr（过氧化氢酶）=4* Mr（层析蛋白）
=241.024KD
图如下：
lowry法测定纯化的过氧化氢酶浓度
图如下：
Km值的测定：
酶活=消耗底物量 /时间
酶体积
图如下：
小鼠肝脏过氧化氢酶分离纯化
总酶活力105 = 酶活力×溶液体积
酶活力(U/ml) = (H2O2 的浓度×加入H2O2 的ml数—2.5×KmnO4 ml数×KmnO4浓度/ 加入样品的ml数) ×105
回收率% = 用各步产物的酶活力占匀浆离心上清液酶活力的百分比来表示
四.实验讨论
1.为什么选择雄性小鼠的肝脏做实验？
答：因为雄性小鼠的身体健康指标比雌性小鼠要好。实验要减少偶然，就必须保证在实验过程中引起某个症状的原因是客观的，而不是由于小鼠本身的原因造成的，所以用雄性小鼠会好一点。过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。所以用雄性的小鼠的肝脏做实验。
2.组织匀浆法的目的是什么？
答：在保证过氧化氢酶天然活性的状态下，把肝脏细胞打碎，释放出过氧化氢酶
3．为什么匀浆缓冲液中加23.5％乙醇？
答：因为乙醇可以溶解酯质的物质，而过氧化氢酶在乙醇中溶解度很小。
4.匀浆法中，为什么加氯仿，而且要边加边搅拌？
答：加氯彷是让除过氧化氢酶以外的蛋白质变性。因为氯仿能使蛋白质变性，但过氧化氢酶遇氯仿不变性。边加边搅拌是防止因局部氯仿浓度过高，将过氧化氢酶也氧化。
5.盐析时，为什么选择硫酸钠？
答：盐能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质沉淀。硫酸钠是中性盐，对溶液的pH影响小。氯化钠也行。
6.盐析时，为什么要在冰浴搅拌的状态下，且要缓慢滴加？
答：常温下，酶的活性有损伤。搅拌和缓慢滴加，是防止局部盐浓度过高，使杂蛋白析出。
7.为什么匀浆、透析中用醋酸缓冲液，而盐析、凝胶层析中用的都是磷酸缓冲液？
答：醋酸缓冲液的缓冲范围的pH值在4.7左右，过氧化氢酶在pH为4.7左右的溶液中溶解度极小，而磷酸缓冲液的缓冲范围的pH值在7.8左右，过氧化氢酶在7.8左右的溶解度很大，醋酸缓冲液是使过氧化氢酶沉淀，而磷酸缓冲液是使过氧化氢酶溶解，这两种缓冲液的作用目的不一样。
8.为什么透析袋要煮沸后才能使用？
答：为防干裂，透析袋出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L 碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN3，以防长菌。洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。
9.为什么透析时透析液的pH要维持在4.7左右？
答：过氧化氢酶在pH为4.7的时候溶解度小，容易沉淀。而杂蛋白不易沉淀，溶解在其中，易于分离。
10.透析后，为什么要将装有样品的透析袋置于50%的甘油中包埋浓缩？而不能用干燥剂？
答：50%的甘油起到一种类似吸水的作用。干燥剂对酶有损伤。
11.为什么用小分子物质甘油中包埋浓缩透析液？
答：虽然甘油是小分子物质，可以自由透过透析袋，但甘油与水分子不是一
比一的进出，往往甘油进入的少，相比其他试剂，甘油是较经济、实用的。
12．为什么在凝胶层析法中要转着加样？
答：因为沿着层析柱边缘转着加样，可保持胶面平整，有不平整可用玻璃棒在胶表面轻轻搅拌，使胶粒浮起，沉淀，让胶层重新平整。
13.层析时为什么用OD280与OD407双重比色？
答：OD280是普遍蛋白质的紫外吸光峰值，OD407是过氧化氢酶的特异紫外光吸收峰值。两次比色双重保证了能准确选择含有过氧化氢酶的收集管。
14．在SDS-PAGE中，为什么用甲醇和冰醋酸做缓冲液？
答：染色液中的甲醇和冰醋酸，在染色过程中，还起固定蛋白质的作用，此法的检测灵敏度为0.2 ~1μg，虽然不如银染色法的灵敏度高，但是操作简便，背景干净清楚，显色带的颜色深浅一般与蛋白质的量成正比，可用于蛋白质的定量测定。
15.通过该实验，酶作为生物催化剂的特点有什么进一步的认识？
答：酶的特性
⑴高效性：酶的催化效率比无机催化剂更高，使得反应速率更快；
⑵专一性：一种酶只能催化一种或一类底物，如蛋白酶只能催化蛋白质水解成多肽；
⑶多样性：酶的种类很多，大约有4000多种；
⑷温和性：是指酶所催化的化学反应一般是在较温和的条件下进行的。
⑸活性可调节性：包括抑制剂和激活剂调节、反馈抑制调节、共价修饰调节和变构调节等。
⑹.有些酶的催化性与辅因子有关。
⑺易变性，由于大多数酶是蛋白质，因而会被高温、强酸、强碱等破坏。
16.过氧化物酶与过氧化氢酶作用机制有什么不同？
答：过氧化氢酶存在于过氧化物酶体中,可对细胞起保护作用，使细胞免受过氧化氢的危害。过氧化氢酶，是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶, 约占过氧化物酶体酶总量的40%。过氧化氢酶存在于所有已知动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。过氧化氢酶在食品工业中被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。过氧化氢酶也被用于食品包装，防止食物被氧化。
五．注意事项
1)取雄鼠肝脏时，尽量把肝脏取尽，避免取肝脏以外的组织。
2)使用离心机要注意平衡，平稳，对称，牢固，缓慢，以防止损伤离心机。
3)手动玻璃匀浆器助溶时，要注意缓慢旋转推移，时间稍微长一些，使溶
解的更充分。
4)每次离心试验后，不要晃动，避免有少量沉淀溶解，对实验结果造成影
响。
5)使用分光光度计前，要记得调零。
6)装柱时，避免出现断层，干胶。
7)层析时，加样品和缓冲液时要旋转加入，并及时补充缓冲液，要避免干
胶。
8)加样时，要加在加样口里，不要加到样品槽外。
9)拔样品槽模板（梳子）时要小心，注意不要破坏胶。
六．结果误差分析
本次实验结果与理论数值基本符合，但稍有误差。可能因为：
a)使用的仪器内有杂质，仪器老化
b)滴加的试剂与酶没有充分接触
c)酶因为操作时温度稍高部分会失活
d)拿出离心管时稍微晃动使沉淀与上清液混合
e)层析时收集的液滴大小不均造成吸光度测量误差
f)滴定时计时不准确，滴定终点人为判断不一致
g)滴定前过氧化氢分解或稍被硫酸污染
h)周围环境中的杂蛋白影响，
i)可能因为实验时间过长造成酶活性降低
六．结语
据文献资料，目前商品化过氧化氢酶多以家畜家禽的血液，肝脏为原料，利用离子交换、凝胶层，纤维固定化等技术制备，但是操作多杂，成本极高8000元/kg,且酶活性回收率极低（约30%左右）故不适合实验室的一般使用。
本次实验以小鼠肝脏为原料，采用实验室常用的盐析，透析，离心等简单技术，即可获得少量纯度较高，回收率高的过氧化氢酶，成本相对低廉，是实验室的理想选择。
【参考文献】
《现代医学实验技术（下）》--------------人民卫生出版社段惠军主编
《生物化学实验原理和方法》-------------北京大学出版社.余瑞元等主编《生物化学实验技术》-------------------化学工业出版社.何晓钟主编
《实用化学提纯技术指南》---------------科学技术出版社郑阳科主编
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小鼠肝脏过氧化物酶制备与测定
小鼠肝脏过氧化物酶制备与测定
摘要目的分离纯化过氧化氢酶，测定其相关性质。方法采用匀浆、盐析、透析、层析等方法分离纯化过氧化氢酶，采用Lorry 法测定蛋白含量，SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子质量，双倒数法测定酶的米氏常数。结论相对分子质量为60.25kD，以过氧化氢为底物时酶的Km值为0.133mol/L，酶层析后的比活为0.686IU/mg。 关键词小鼠过氧化氢酶纯化米氏常数SDS-PAGE 前言过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase)又名触酶(Catalase，CAT),是一种广泛存在于生物组织的氧化还原酶[1]。过氧化氢酶是一种四聚体血晶素酶, 由四个相同四面体排列的亚基组成,每一个亚基相对分子质量约60000，每一个分子都包含有四个高铁血红素基团,分子量在240000左右[2]。 在人体内以肝和肾脏所含过氧化氢酶活性最高, 结缔组织活性最弱,其它组织如红细胞、脾、小肠、肌肉等均含有过氧化氢酶。过氧化氢酶在细胞内主要与线粒体及过氧化物酶体结合, 在红细胞内呈溶解状态。过氧化氢酶是一种与D－氨基酸氧化酶等一系列需氧脱氢酶相偶联的酶, 具有重要的生理功能。过氧化氢酶能将细胞代谢所产生的毒性物质迅速加以清除, 从而起到和谷胱肽过氧化酶共同保护琉基酶、膜蛋白和解毒的作用。近年来, 过氧化氢酶的活性测定被作为与肿瘤和抗衰老有关的酶学指标而受到关注。[3] 近年来，过氧化氢酶活性的测定被作为与肿瘤和抗衰老有关，蛋白质的分离纯化方法是生命科学领域关注的热点之一。[4] 1实验器材 1.1实验动物 昆明小鼠6只，雌雄不限，由河北医科大学动物实验中心提供。 1.2主要仪器 5200型紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司），UV-5200 冷冻离心机(湖南相依实验仪器开发有限公司)，BCD-185冰箱（青岛海尔公司），微量移液器，40W匀浆器（江苏国华仪器厂），电泳仪（北京六一） 2实验方法
大鼠系统解剖简述
第一章皮肤 一、皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成。 二、皮肤腺有皮脂腺、汗腺和乳腺。 1、皮脂腺分布在毛囊周围。口角部、肛门、包皮和乳头周围有特化的皮脂腺。 2、汗腺，大鼠的汗腺只局限于足垫的皮肤。 3、乳腺 数量大鼠的乳腺共有6对，胸部3对，腹部1对，鼠蹊部2对。个别的大鼠有5对或者7对。 大小和形态随大鼠的年龄和性周期有明显的变化。 部位包埋在皮下组织中，由结缔组织隔与胸壁和腹壁松松地相连。 第二章骨 一.脊柱大鼠的脊柱由57 —61块脊椎骨组成，包括颈椎7、胸椎13、腰椎& 荐锥 4、尾锥27 —31块。锥式C7T13L6S4Cy27—31。骨性标志为第二胸椎，其棘突最高，超过其它脊椎骨。 1、颈椎和其它哺乳动物一样，恒为7块，全无肋骨相连，横突上具有横突孔，供锥动脉通过。 2、胸椎13块，椎骨的长度由前向后逐渐增加（由2毫米增加到4毫米），锥管的直径平均为3.3毫米，较颈部的锥管为狭窄。 3、腰椎6块，每块锥体的长度比较一致，约 6 —7毫米。锥管直径由前面的 4 毫米向后逐渐缩小至2毫米。 二、胸骨 共分为6节，最前一节为胸骨柄，第二到第五节称为胸骨体，最后一节为剑突，棒状的剑突后面接一盘状的剑状软骨。胸骨柄长约10毫米。 第三章肌肉系统（省略） 第四章消化系统 消化系统包括消化管及附属消化器官。消化管可分为口腔、食管、胃、小肠和大肠等部。附属消化器官有齿、舌、唾液腺、肝和胰。 第一节消化管
、口腔1、舌全长约30毫米，不具有正中系带，但是有两条侧系带。 一、食管 分为颈、胸、腹三部。成年大鼠食管的颈-胸段长度约75毫米，腹段通过膈的食管裂孔在膈后的长度约15毫米，食管外径约2毫米。 位置：食管主要是沿气管背侧走行，仅在颈部稍偏左侧。 一、胃 位置：横位于腹腔的左前部，其壁面几乎完全为肝的左叶所覆盖。 大小：胃重为体重的0.5% ,属单室胃。 形态：胃小弯朝向背前方，食管在其中部入胃。胃大弯朝向腹后方，其边缘 有双层的口袋状大网膜。贲门部外观呈半透明状，内壁有粘液腺。 三、小肠 1、十二指肠 长度：长约100毫米。 位置：从幽门发出向右后行，再折向前终于右侧。可分为降支（向右后行）、横支（水平部）、升支（向前行），它们构成一个不完全的环，包围着部分胰腺。 颜色：淡红色。 2、空肠 长度：为小肠的最长部分，大约有700—1000毫米。 位置形态：盘旋在腹腔的右方腹侧部。 3、回肠 长度：较短，约有40毫米。 位置形态：以三角形的系膜回盲褶与盲肠的末端相连，向盲肠的开口与结肠的起始部紧密相接。 二、大肠 1、盲肠 长度：是介于小肠与盲肠之间的一个大的盲囊。长约60毫米，直径约10毫米。位置：通常位于腹腔的左后部。盲肠呈锥体形，分为基部、体部和尖端。 2、结肠 长度：长约100毫米。
肝切片的实验报告
肝切片的实验报告 篇一：肝切片实验报告？ 实验九显微摄影――小鼠肝脏结构年级专业 *班 *组学号姓名αβ 500μm 1 m 2 100μm i 100μm 4 50μm 图版说明： 图1：小鼠肝脏横切部分结构，示肝小叶（a），静脉血管（b）。图2：图1（α部位）的放大，示肝小叶（c）。图3：示肝小叶（d）。图4：示静脉血管（e）。 图5：示肝细胞（f），肝细胞细胞核（g）。图6：图2（β部位)的放大，示上皮细胞（h），上皮细胞细胞核（i），肝血窦（j），中 央静脉（k），肝动脉（l），血细胞（m）。结构说明：肝脏是脊椎动物身体内以代谢功能为主的一个器官，并在身体里面扮演着氧化，储存肝 糖，解读等功能。肝脏由肝小叶组 成，肝小叶是肝脏的基本组成成分，它来执行肝脏的基本职能。而肝小叶又是由肝细胞组成，当肝细胞大量损坏时，肝小叶不能正常工作，影响肝脏 正常生理功能，而出现各种各样的症状。肝小叶成棱柱状，中央有一条中央静脉穿过，肝细 胞围绕中央静脉成放射状排列。肝细胞是一种高度分化并具有多种功能的细胞，胞质内各种细胞器丰富而发达，并
含有 糖原，脂滴等内涵物。细胞器和内涵物的含量与分布常因细胞的功能状况或饮食变化而变动。 一般肝细胞里线粒体含量都比较多，遍布于胞质内，为肝细胞的功能活动不断提供能量。肝细胞核大而圆，居中央，染色质丰富色浅，核膜清楚，核仁1至数个。部分肝细胞（约 25%）有双核，有的肝细胞的核体积较大，为多倍体核。肝血窦位于肝板之间，互相吻合成网状管道。血窦腔大而不规则，血液从肝小叶的周边 经肝血窦流向中央，汇聚到中央静脉。 5 50μm篇二：实验报告(一) 实验名称：实验性空气栓塞实验时间：成绩：实验目的：了解空气栓塞对机体的影响实验材料：家兔，20ml注射器及针头，解剖刀，剪，镊子，面盒，浸有二甲苯的棉球若 干 等实验方法（简要说明）： 1. 先观察家兔的一般状况：活动状态、呼吸频率、嘴唇颜色及瞳孔大小等。 2. 用浸有二甲苯的棉球涂擦一侧耳廓，使局部血管扩张，便于穿刺注射。 3. 用注射器经耳缘静脉注入空气10～15ml，记录时间，
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二、实验方法 ●匀浆 是根据过氧化氢酶的性质，利用有机溶剂将组织细胞捣碎，使其释放出来的方法。 小鼠肝脏匀浆液制备：用颈椎脱臼法处死小鼠，取出肝脏，称重 6g；按1：8.5的比例加入匀浆缓冲液51ml（0.05mol/L醋酸-23.5%乙醇缓冲液， pH4.0）,匀浆机捣碎3-5min；缓慢滴加匀浆液体积0.5倍的氯仿（边加边快速搅拌）再次匀浆1min；匀浆液离心（4℃, 6500rpm, 30min）后保留上清液备用。 ●盐析 是在过氧化氢酶中加入适当浓度的中性盐溶液，破坏其水化膜，使其成盐析状态而沉淀下来，离心后可除去部分杂蛋白。 盐析法粗提过氧化氢酶：缓慢加入上清液体积0.06倍的0.5mol/L的硫酸钠溶液，冰浴搅拌1h，离心（4℃, 6500rpm, 10min），保留离心沉淀；加入4
取小鼠脑组织
丁香园上面总结的方法，排版有点乱。 其实过程与大鼠近似，我的经验是： 1. 材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等； 2. 步骤：处死小鼠，取头颅； 剪开皮肤，漏出颅骨； 用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线； 再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨； 当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管； 然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。 3. 注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部； 用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部； 去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑； 取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高； 若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。 做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。先麻醉小鼠 剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳 先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了 再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬 小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。 具体操作如下： 实验操作步骤： 1) 小鼠称重，以每克小鼠0.0025ml 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g腹腔注射麻醉。 2) 将麻醉的小鼠仰放在操作台上，去毛。 3) 解剖小鼠，暴露心脏。 4) 找到心尖部，左手用镊子提起心尖部，右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约0.5cm（最好是用小点的针头，用止血钳固定针尖，剪开右心耳。 5) 将灌流器的导管部开口放到生理盐水中里，打开灌流器灌流，直到从右心耳流出的液体为无色，同时小鼠肝脏色淡，肠管肿胀为止，停止灌流。没有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。
小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定
小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定 摘要： 过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，是过氧化物酶体的标志酶尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。 过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶。建立了一套适合一般实验室分离纯化过氧化氢酶的方法，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。 现报告如下： 一、实验器材 1、实验动物：成年雄性小鼠（河北医科大学实验动物中心提供） 2、主要器材：托盘天平，组织捣碎机，离心管，H2050R高速冷冻离心机，CU600型电 热恒温水箱，DYY-8L型电泳仪（北京市六一仪器厂），H2S-H水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），垂直板型电泳装置，制冰机，4℃冰箱 二、实验方法 来 6g；按1： pH4.0）,
是在过氧化氢酶中加入适当浓度的中性盐溶液，破坏其水化膜，使其成盐析状态而沉淀下来，离心后可除去部分杂蛋白。 盐析法粗提过氧化氢酶：缓慢加入上清液体积0.06倍的0.5mol/L的硫酸钠溶液，冰浴搅拌1h，离心（4℃, 6500rpm, 10min），保留离心沉淀；加入4倍肝重（0.1mol /L pH7.8）的磷酸缓冲液手动玻璃匀浆器使沉淀溶解,离心（4℃, 4000rpm, 10min）,保留上清备用。 ●透析 是利用透析袋的半透过性，在一定透析条件下，使过氧化氢酶以不变性的沉淀形式析出，复溶后，可除去部分杂蛋白。 透析法纯化过氧化氢酶：将上清液置于透析袋，透析两周（透析液：20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L氯化钠）中途更换一次透析液；透析后取出浊溶液，离心（4℃, 6500rpm, 10min），取沉淀，溶于0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液中,离心（4℃,4500rpm, 10min）收获上清，得到小鼠肝脏过氧化氢酶溶液。将收获的上清液（3组合并为一组）放入处理过的透析袋中，置于50%的甘油中包埋浓缩24小时后放冰箱保存， 制备过程中各阶段产物用比色测定法测定酶活，分析制备效率。分离纯化产物酶活性回收率用各步产物的酶活占匀浆上清液酶活的百分比来表示。 ●层析 是根据混合物中各种物质分子大小不同，在凝胶层柱的扩散移动速度不同使混合物分离的方法。 分别在280nm和407nm波长下测光吸收值，合并收集峰值重合管，得到纯化过的过氧化氢酶。 取出装柱好的层析柱，打开出口使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床面平齐时，沿柱口旋转加样，同时开始收集层析柱的流出液，每管收集约25滴，一次在407nm和280nm波长下，测定各管吸光度值。并绘制曲线。 2、过氧化氢酶的性质测定 制作标准蛋白的选择：选择与待测样品相同组成的蛋白质作为标准蛋白溶液。 标准蛋白溶液的配制：将标准蛋白经凯式定氮法准确测定其蛋白含量，再用无离子水配成0.1mg∕mL储存液。
大鼠解剖图
图Ⅷ-31左心房与左心室The left atrium and left ventricle 11左心房left atrium 12左心室left ventricle 13肺动脉右支right branch of pulmonary artery 14肺静脉pulmonary vein 15前腔静脉precavalvein 16肺动脉左支left branch of pulmonary art 7tery 17后腔静脉postcaval vein 18心中静脉 middle cardiac vein 19头臂动脉brachiocephalic artery 20主动脉弓aortic arch 21乳头肌papillary muscles 22左颈总动脉left common carotid artery 23左锁骨下动脉left subclavian artery 24右前腔静脉right precaval vein 25心外膜extracardium
图Ⅷ-56前肢内侧面The anterior limb. Medial aspect
图Ⅷ-57后肢内侧面(1)The posterior limb. Medial aspect（1） 1腋神经axillary nerve 2桡神经radial nerve 3头静脉cephalic vein 4正中神经median nerve 5正中动脉median artery 6肌支muscular branch 7尺神经ulnar nerve 8臂动脉brachial artery 9胸长神经long thoracic nerve 10胸外侧动脉external thoracic artery I1颈总动脉common carotid artery 12主动脉弓aorta arch 13左心耳left auricle 14右心耳right auricle 15食管esophagus 16胸主动脉thoracic aorta 17腹壁浅动脉superficial epigastric artery 18腹壁浅静脉superficial epigastric vein 19隐动脉saphenous artery 20隐大静脉great saphenous vein
大鼠肝脏组织病理切片的制作和 HE 染色
大鼠肝脏组织病理切片的制作和HE 染色 步骤如下： （一）固定与修块 取组织块放入Bouin氏液中，组织块的直径应小于7mm。6小时左右后用双面 刀片将组织块修剪成3-5mm3大小。 （二）脱水与透明 1．75%乙醇50分钟 2．85%乙醇50分钟 3．95%乙醇（I）30分钟 4．95%乙醇（II）30分钟 5．100%乙醇（I）30分钟 6．100%乙醇（II）30分钟 7 1/2 二甲苯（乙醇与二甲苯等体积）20分钟 8．二甲苯（I）20分钟 9．二甲苯（II）10分钟（可依据透明效果而定） 若脱水不好，二甲苯溶液颜色会变混浊。在每一步骤之后，要充分滤干组织 块，一般用筒纸吸干组织块上的液体，以免影响其他液体的浓度，但也要防止组织块干燥。全过程约需要5h。 （三）浸蜡、包埋与修蜡块 1．浸蜡：将60℃恒温箱打开，使石蜡充分溶解，待脱水与透明结束后，将 组织块转入石蜡里，放置于60℃恒温箱120分钟。 2．包埋：将60℃的石蜡倒入纸盒内，然后用小镊子将各组织块按一定的顺 序排列好，使切面朝下。不同组别的同一组织包埋于一个蜡块中，以保证切片和染色条件相同。为防止倒入纸盒内的石蜡底部立刻凝固，可将纸盒置于一玻璃板上（或大培养皿内），然后将玻璃板置于80-90℃左右热水上，包埋时蜡盒底部 要放平，做蜡块的蜡要反复冻融较好。 3．修蜡块：待纸盒内蜡凝固后，用刀片将其修成梯形，组织块与蜡块边缘 之间的距离不得小于2mm。 （四）切片 在载玻片上擦少量甘油蛋白。可滴半滴甘油蛋白于载玻片上，用手指充分抹 匀，呈半干状为佳。切片厚约4-8μm，将切片在55℃左右水浴中展开，展开程度以带黄颜色的组织完全摊平为准。用涂有甘油蛋白的载玻片从水浴中捞取切片，放入37℃烘箱中过夜。每个组织块捞片2张。过夜后，将载玻片置于玻片架上，进行下面的实验。 （五）脱蜡、染色与脱水 倾斜玻片架，将玻片架和载玻片下缘的试剂用筒纸吸干，减轻对其他试剂浓 度的影响。全过程约需要60分钟。 1．脱蜡 （1）二甲苯（I）15分钟 （2）二甲苯（II）15分钟 （3）100%乙醇2分钟 （4）95%乙醇（I）1分钟 （5）95%乙醇（II）1分钟 （6）蒸馏水浸洗1分钟
过氧化氢酶产生菌的研究
过氧化氢酶产生菌的研究 摘要：过氧化氢酶一类以过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气的酶。 关键字：过氧化氢酶发酵调控 过氧化氢酶简介 过氧化氢酶(Hydrogen peroxide oxidoreductase，catalase EC 1.11.1.6.) 是一类以过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气的酶。研究表明几乎所有的需氧微生物中都存在过氧化氢酶，只有少数好氧菌如过氧化醋杆菌Acetobacter peroxydas 不存在过氧化氢酶。除谢氏丙酸杆菌Propionibacterium shermanji 和巨大脱硫弧菌Desulfovibrio gigas 等微生物外，绝大多数厌氧微生物体内不存在过氧化氢酶。根据过氧化氢酶在结构和序列水平上的异同将其划分为 3 个亚群，即单功能过氧化氢酶(Monofunctional catalase or Typicalcatalase)、双功能过氧化氢酶(Catalase-peroxidase) 和假过氧化氢酶(Pseudocatalase or Mn-catalasee)。大多数的过氧化氢酶由4 个相同的亚单位组成，分子量在240 kDa 左右，在亚基的活性部位各含一个血红素基团。来自哺乳动物以及某些真菌和细菌的过氧化氢酶还含有 4 个紧密结合的NADPH 分子。过氧化氢酶可被氰化合物、苯酚类、叠氮化物、过氧化氢、尿素及碱等物质所阻抑。过氧化氢酶主要集中存在于细胞的过氧化物酶体中，另外线粒体和细胞质中也含有少量的过氧化氢酶。过氧化氢酶能及时分解细胞内产生(主要为SOD 歧化产物) 或由胞外进入细胞的过氧化氢。避免了过氧化氢通过Fenton 和Harber-weiss 反应产生·OH。同时过氧化氢酶还能对血红蛋白及其他含巯基蛋白质起到保护作用，使它们不被氧化。人们研究过氧化氢酶的历史可追溯到100 多年前，早在1811 年就已发现动植物组织可以分解过氧化氢产生氧气，到1892 年Jacobson 证明了在动植物组织内有专一分解过氧化氢的酶，即过氧化氢酶的存在。1901 年Loew 第一次报道了过氧化氢酶的生物化学特性。到1937 年，Sumner 和Dounce 首次从牛的肝脏中分离得到过氧化氢酶的结晶，这是最早分离得到的高纯度酶之一。随后相继报道了哺乳动物的肝脏、红细胞及大多数微生物体内均含有此酶，其中哺乳动物组织中过氧化氢酶的含量差异很大，肝脏中含量最高，
大鼠和小鼠解剖图谱(照片版)
图Ⅷ-1整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral View 图Ⅷ-2整体骨骼左前面观The skeleton. Left anterior view 1肋骨rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cervical vertebra 4颅骨cranium 5肩胛骨scapula 6肱骨hiimeius 7桡骨radius 8尺骨ulna 9掌骨metacarpal bone 10指骨digital bone 11腰椎lumbar vertebra 12髂骨ilium 13尾骨coccyx 14股骨femur 15髌骨patella 16腓骨fubula 17胫骨tibia 18跖骨metatarsal bone 19趾骨digital bone
图Ⅷ-4头骨侧面The skull. Lateral aspect
图Ⅷ-6下颌骨侧面The mandible. Lateral aspect
1枕骨occipital bone 2顶间骨interparietal bone 3矢状缝sagittal suture 4颧骨malar bone 5上颌骨maxillary bone 6前颌骨premaxillary bone 7枕外嵴external occipital creat 8顶骨parietal bone 9额骨frontal bone 10鼻骨nasal bone 11鼻间缝internasal suture 12前筛孔preethmoid pore 13蝶腭孔sphenopalatine foramen 14门齿 incisor tooth 15下颌骨mandible 16视神经孔optic foramen 17枕骨occipital bone 18茎突styloid process 19外耳道external acoustic meatus 20颞骨temporal bone 21 腭裂patoschisis 22臼齿molar tooth 23腭骨palatine bone 24翼孔pterygoid apertures 25破裂孔foramen lacerum 26枕大孔foramen magnum 27腭后孔posterior palatine foramen 28鼻后孔posterior nasal apertures 29卵圆孔foramen ovale 30鼓骨tympanic bone 31舌下神经孔hypoglossal foramen 32下颌联合mandibular symphysis 33颏孔mental foramen 34冠状突coronoid process 35下颌支ramus of mandible 36角状突process of horn 37下颌孔mandibular foramen 38翼肌窝pterygoid fossa 39髁突condylar process
小鼠肝脏取材步骤
小鼠肝脏组织取材步骤 小鼠肝脏组织取材步骤，并列出完成此次实验所需要的试剂、仪器、材料等相关物品及实验人员安排情况。 材料：小鼠 试剂：DMEM 戊巴比妥钠 75%酒精 PBS 器械消毒液戊二醛 仪器：解剖台备皮刀弯盘组织剪眼科剪手术刀柄刀片血管钳眼科镊 培养皿无菌手套 实验人员安排：小鼠养殖管理组准备工作组实验操作组 实验步骤: 1. 取材前夜禁食，自由饮水。 2. 小鼠称重，按照50mg/kg的比例用5ml的注射器配合针头抽取戊巴比妥钠备用。 3. 正左手的小指和无名指抓住大鼠的尾巴，另外三个手指抓住大鼠的颈部，使大鼠头部向向下。这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。右手持注射器，从腹部近腿根处刺入后再腹部皮下穿行深入，动作轻柔，缓慢注射。注射完药物后，缓缓拔出针头，手指按住针口对小鼠腹部轻柔按摩，促进麻醉药物的吸收，掐小鼠尾部检测小鼠麻醉程度。 4.将小鼠四肢固定于解剖台上，暴露小鼠整个胸部和腹部，修剪去腹部毛发，75%酒精消毒。 5.沿腹侧正中线自阴茎上源由下而上剪开腹部皮肤直至剑突，向两侧钝性剥开皮肤与皮下组织，暴露腹壁浅肌层。沿白线钝性分离腹壁肌肉，剪开腹膜，暴露腹腔，将肝脏向上翻起，显露肝门，眼科剪剪除肝脏周围结缔组织和血管。 6.结扎剪断肝门管道系统，钝锐结合完整取出大鼠肝脏，放置于无菌培养皿，生理盐水冲洗，称重并记录。①切取肝左叶约1mm×1mm×1mm组织3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH 7.4)或4-戊二醛固定；②左叶肝组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；③右叶肝组织称重记录分装后全部放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。 7.切取肝左叶约1mm×1mm×1mm组织3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7.4)或4-戊二醛固定；左叶肝组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；右叶肝组织称重记录分装后全部放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。
肝脏切片
大鼠肝脏脂肪组织石蜡包埋切片 本实验室现提供整体实验课题外包服务，如大鼠肝脏，脂肪组织石蜡切片，免疫组化整体实验代做，小鼠心肌细胞培养，后续Western blot,荧光定量PCR 检测等，因本实验室自己课题量也较多，所对外承接课题数量有限，如有需要的同学请在线提前预约（即将毕业研究生优先）。 制作优质大鼠各器官石蜡切片 1.1标本：大鼠各个脏器———心、肝、脾、肺、肾、大脑、脊髓、胃肠、垂体、胸腺、淋巴结、肾上腺、卵巢、睾丸、子宫、膀胱、附睾。 1.2固定液：中性甲醛溶液，固定时间为24h。 1.3取材：心脏：最大纵断面取1块，厚度为2mm肝脏：右叶纵断面取1块，厚度为2mm；脾脏：纵断面取1块，厚度为2mm肺脏：纵断面取1块，厚度为2mm；肾脏：最大面剖开取一半，包括皮质、髓质和肾盂；大脑：最大面剖开取一半；脊髓：横断面剖开取1块，厚度2~3m;胃：沿大弯侧剪开，纵切一长条，长1cm，宽2mm；肠：横断面切取一段，约2mm；垂体：全包；胸腺：全包；淋巴结：全包；肾上腺：全包；卵巢：全包；子宫：横断面剖开取一段，厚度2mm；睾丸：最大面剖开，取半；附睾：纵断面剖开取半；膀胱：剖开取半。 1.4包埋：胃肠、子宫、膀胱立埋，其余脏器平埋，蜡温为65~70℃。 1.5切片：厚度4μm，摊片水温56℃左右，选取无皱折的4片。 动物组织石蜡切片苏木素-伊红（HE）染色切片置70℃的烤箱中30min 入二甲苯脱蜡20min；入梯度乙醇100%→95%→85%→75%，自来水冲洗2min；入苏木精30min，取出自来水冲洗2min；入盐酸乙醇分化5s，自来水冲洗2min；入伊红5s，自来水冲洗2min；入梯度乙醇75%→85%→95%Ⅰ→95%Ⅱ→100%入二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ；中性树胶封片。
实验一 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定
实验一小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定实验方案： （一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液 一、实验目的：掌握组织匀浆法和低温离心机的使用 二、实验原理： 1、在肝内过氧化氢被过氧化氢酶水解为水和氧 2、组织匀浆法: 机械切碎，破碎细胞 匀浆缓冲液:pH4.0醋酸缓冲液（水溶性物质），23.5%乙醇（脂溶性物质） 3、氯仿; Pr沉淀剂，CA T由于对氯仿的沉淀性大而不沉淀 4、离心：离心机分离固液 三、实验步骤： 1、颈椎脱臼法处死6只小鼠，去肝脏，用滤纸洗干净血液后，每组称重6g 2、加入肝重8.5倍体积的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L pH4.0醋酸缓冲液，23.5%乙醇）, 组织捣碎机匀浆3-5min 3、慢慢滴加肝重0.5倍体积的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆1min 4、匀浆夜离心，4℃6000rpm，30min后，弃沉淀，获上清液 5、【留样】取匀浆上清液60ul，加入20ul4×电泳上样Buffer，沸水浴3-5min，备SDS-PAGE 检测，-20℃冰箱保存。另取60ul匀浆后的上清液-20℃冰箱保存，用于酶活的测定和蛋白定量。 （二）盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶
一、实验目的：掌握盐析与透析法的方法与原理 二、实验原理： 1、在Pr溶液中加入中性盐使Pr沉淀析出过程 2、盐酸沉淀原理：中性盐破除水化膜、中和表面电荷，Pr溶解度降低而沉淀析出 3、透析:利用具有一定孔径的高分子物质不能透过的半透膜，分离生物大分子和小分子 的一种分离纯化技术 三、实验步骤： 1、向肝匀浆上清液中缓慢滴加0.06倍体积的0.5M Na2SO4溶液，继续冰冰浴搅拌状态 下浴搅拌1h； 2、将盐析溶液离心（4℃，6000rpm，10min）后弃上清液，保留沉淀； 3、用肝重4倍体积的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀（用手动玻璃匀浆器助 溶）10min，离心10（4℃4000rpm，10min）后，弃去沉淀，保留沉淀； 4、留样：取盐析后上清液样品60ul，用20ul4*电泳Buffer制样，备用于SDS-PGE检 测，-20℃冰箱保存。 5、将透析袋（截流量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用。 6、将上清液放入透析袋，（截流量10-20KD，直径2公分）内，置于透析液（20%乙 醇，0.1mol/L，pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/LNaCl溶液）中透析一周，中途更换一 次透析液； 7、一周后，取出透析袋内混浊溶液，离心（4℃6000rpm，10min）后，弃上清，收集 沉淀； 8、用2ml~3ml的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH4.8）溶解沉淀15min（用手动玻璃匀浆器 助溶），离心（4℃4000rpm，10min）后，弃去沉淀，收获上清液。（测OD280，若 蛋白浓度小于1mg/ml） 9、留样：取透析后上清样品60ul，用20ul4*电泳Buffer制样，备用于SDS-PGE检测， -20℃冰箱保存。 10. 将透析袋置于沸水中煮沸15min，清洗晾凉后备用 11 .将收获的样品液放入处理后的透析袋中，置于50%的甘油中包埋浓缩两个小时将样 品浓缩至400-500ul收样，放置4℃ （三）凝胶层析法进一步纯化过氧化氢酶 一、实验目的： 二、实验原理： 三、实验步骤： 1、凝胶的处理：每组取2.5g sepadexG-200葡聚糖凝胶干粉，浸泡与蒸馏水充分膨胀倾 斜法除去表面的悬浮小颗粒，替换等体积磷酸缓冲液（0.1mol／L,pH7.8），继续浸泡一天 2、装柱：取层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填上一层海绵垫。将层 析柱将垂直夹与铁架上，将层析柱下端额止水架夹紧，向柱中加入约5-7cm高的缓 冲液，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱。当凝集颗粒沉 积约2cm高时，开启止水夹子使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高达35cm时为止。关闭止水夹子，要求凝胶床要均匀，中间要连续，不得有气泡，表面要平整。 3、平衡：打开层析柱口，控制流速为0.3-0.5mL／min（约5-10滴／min），用磷酸缓冲 液（0.1mol／L,pH7.8）流洗平衡20min。凝胶管柱上端平衡液应始终不少于10cm 的
利用石蜡切片对小鼠肝脏组织器官细微结构的观察
摘要：本文采用石蜡永久制片和光学显微摄像的方法对经过环磷酰胺处理过的小鼠肝脏的显微结构进行了研究，分析环磷酰胺对小鼠肝脏的显微结构产生的影响。结果表明，一定剂量的环磷酰胺对肝脏具有损伤作用。 关键词：小鼠肝脏石蜡切片 环磷酰胺( Cyclophosphamide, Cp) 是人工合成的氮芥类烷化剂。可以抑制细胞增殖，非特异性杀伤抗原敏感性小淋巴细胞，限制其转化为免疫母细胞，可以作为细胞周期非特异性广谱抗肿瘤药，被广泛用于治疗急慢性淋巴细胞性白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤等；但同时可以引起剂量依赖性肝损伤的副作用——原因可能是环磷酰胺主要代谢物丙烯对肝脏有毒副作用，能引起肝细胞坏死，肝小叶中心充血，同时伴有氨基转移酶含量升高的现象。 1 材料与仪器 1.1 实验材料 小白鼠 1.2 实验仪器： 镊子、毛笔、蜡杯、溶蜡箱、酒精灯、切片机、载玻片、盖玻片、染色缸、光学显微镜。1.3 试剂： 中性福尔马林固定液、各浓度酒精、二甲苯、石蜡、伊红染液、苏木精染液、加拿大树胶 2 实验方法 2.1 取材 用左手拇指和食指捏住小白鼠头的后部，并用力下压，右手抓住鼠尾，用力向后上方拉，即可使颈椎脱臼，小白鼠瞬间死亡。取肝组织。 2.2 固定 将小鼠肝脏块投入中性福尔马林固定液中固定。 2.3 脱水 将组织经各浓度酒精各1 h，95%、100% 的酒精各两次，每次30 min。 2.4 透明 将组织块置于酒精二甲苯混合液中15 min，再将组织块置于二甲苯中透明两次，每次10 min。最后将组织块置于二甲苯石蜡混合液中20 min。
2.5 透蜡 将组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温，共三次，前两次45 min，第三次 30 min。 2.6 包埋 向纸盒中倒入少许石蜡，将组织块用镊子夹取到纸盒中，放入盛有冷水的盆中使其凝固。2.7 切片 右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，当切成的蜡带到一定长度时，将蜡带放在纸上。 2.8 贴片、展片 选取蜡带放置在载玻片上。将载玻片放置在机器上进行展片，待蜡带完全展开时将载玻片拿下，放入盒内。 2.9 脱蜡复水 将石蜡切片经二甲苯Ⅰ脱蜡 20 min，二甲苯Ⅱ脱蜡 10 min，然后放入各级酒精溶液中各2 min，蒸馏水中2 min。 2.10染色 将石蜡切片在苏木精染液中浸40min，然后蒸馏水涮洗几次至发蓝（约2min），镜检。 2.11 脱水Ⅰ、复染、脱水Ⅱ 将镜检合格的石蜡切片依次在各级酒精中浸2min，再在伊红水溶液浸二十至三十秒，再依次在95%、纯酒精Ⅰ、纯酒精Ⅱ中各浸 3 min。 2.12 透明 将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各 3 min。 2.13封藏：中性树胶封存 将载玻片取出，在切片中央滴一滴树胶，用镊子盖上盖玻片。 3 小鼠肝脏石蜡切片观察 见下图：
小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型
小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型 缺血再灌注损伤，即缺血器官、组织重新获得血液供应，不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重了功能代谢障碍及结构破坏。对麻醉动物的肝中叶和肝左叶的门静脉和肝动脉进行阻断和再通，由于肝脏中叶和左叶血流的阻断和再通，引起肝脏中叶和左叶明显的再灌注损伤。肝脏缺血过程中由于肝细胞内ATP 迅速耗尽，导致乳酸酮体等的堆积，及线粒体氧化磷酸化功能低下，引发代谢性酸中毒，缺血过程中细胞缺氧使ATP含量下降，导致肝细胞内外Ca2 +重新分布，即Ca2 +内流，引起线粒体的损伤。再灌注过程中由于氧自由基的爆发性增多，中性粒细胞的聚集，kupffer细胞的激活，细胞凋亡及其他多种细胞因子的作用，使得肝细胞膜损伤，内皮细胞损伤及肝脏微循环障碍等导致肝脏功能代谢障碍及结构破坏。 1.实验动物 SPF级Balb/C小鼠，雄性，周龄为4w~6w，体重为20g~22g。 2.实验分组： 实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。 3.实验周期 0h、3h、6h、12h、24h、72h 4.建模方法 1 小鼠术前1 2 h禁食，自由饮水。 2 3%戊巴比妥钠80mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后将小鼠平躺在手术台上胶带固定四肢，将小鼠腹部术去毛，用碘酒和75％乙醇术区消毒。 3 取腹正中切口1cm，打开腹腔，小心分离出肝脏左、中叶之肝蒂（左、中叶肝脏供血的门静脉和肝动脉）。 4 用无创血管夹夹闭中叶和左叶的门静脉和肝动脉，使约70%的肝脏缺血，以防止发生严重肠系膜静脉淤血。0.5min后，与非阻断的右叶相比，肉眼可见阻断叶明显变白，说明阻断成功，用止血钳夹闭皮肤切口临时关闭腹腔，同时将小鼠放在37℃恒温加热垫上保温。 5 完成持续缺血60min后，重新打开腹腔，迅速取出血管夹，恢复缺血肝血流，
大鼠系统解剖简述
大鼠系统解剖简述
第一章皮肤 一、皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成。 二、皮肤腺有皮脂腺、汗腺和乳腺。 1、皮脂腺分布在毛囊周围。口角部、肛门、包皮 和乳头周围有特化的皮脂腺。 2、汗腺，大鼠的汗腺只局限于足垫的皮肤。 3、乳腺 数量大鼠的乳腺共有6对，胸部3对，腹部1对，鼠蹊部2对。个别的大 鼠有5对或者7对。 大小和形态随大鼠的年龄和性周期有明显的变化。 部位包埋在皮下组织中，由结缔组织隔与胸壁和腹壁松松地相连。 第 二章骨 一．脊柱大鼠的脊柱由57－61块脊椎骨组成，包括颈椎7、胸椎13、腰椎6、荐锥4、 尾锥27－31块。锥式C7T13L6S4Cy27 －31。骨性标志为第二胸椎，其棘突最 高，超过其它脊椎骨。 1、颈椎和其它哺乳动物一样，恒为7块，全无 肋骨相连，横突上具有横突孔，供锥动 脉通过。 2、胸椎13块，椎骨的长度由前向后逐渐增加（由 2毫米增加到4毫米），锥管的直径平 均为3.3毫米，较颈部的锥管为狭窄。 3、腰椎6块，每块锥体的长度比较一致，约6
－7毫米。锥管直径由前面的4毫米向 后逐渐缩小至2毫米。 二、胸骨 共分为6节，最前一节为胸骨柄，第二到第五 节称为胸骨体，最后一节为剑突，棒状 的剑突后面接一盘状的剑状软骨。胸骨 柄长约10毫米。 第三章肌 肉系统（省略） 第四章消 化系统 消化系统包括消化管及附属消化器官。消化管可 分为口腔、食管、胃、小肠和大肠等部。 附属消化器官有齿、舌、唾液腺、肝和 胰。 第一节消化管 一、口腔 1、舌全长约30毫米，不具有正中系带， 但是有两条侧系带。 一、食管 分为颈、胸、腹三部。成年大鼠食管的颈－胸段长度约75毫米，腹段通过膈的食管裂孔在膈后的长度约15毫米，食管外径约2毫米。 位置：食管主要是沿气管背侧走行，仅在颈部稍偏左侧。 一、胃 位置：横位于腹腔的左前部，其壁 面几乎完全为肝的左叶所覆盖。 大小：胃重为体重的0.5％，属单室 胃。
小鼠部分组织的石蜡切片制作
小鼠部分组织的石蜡切片制作 一、实验原理：利用脱水剂除去组织中的水分，再用透明剂二甲苯可以去除脱水剂酒精，而二甲苯可以溶解石蜡并将其导入到已脱水的组织细胞中，然后用熔化的石蜡对组织进行包 埋，冷却后即可将柔软的组织包埋在石蜡中，使其具有一定硬度，且不改变其大小和形状。用旋转切片机可将其切为极薄的薄片，经染色、脱水、装片后在显微镜下可以清晰地观察其 组织结构。 二、材料与用具 1 ?材料：小鼠肝脏、脾脏等。 2 ?用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。 三、实验内容与步骤 1 .取材及固定 取小鼠，采用拉颈处死或麻醉处死法将其杀死，取其脾脏和肝脏，切为边长约为0.5cm的组 织块。用先用0.85%的生理盐水漂洗以洗去血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污 物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀 或其他器具刮之。 由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24 hr。如果是 管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。 取下的材料马上进行固定，采用FAA固定液，固定液的用量与组织块体积之比一般在20:1 , 固定时间2 hr以上，超过24hr时可继续浸泡或转入70%酒精中保存。不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。 2 .冲洗 固定后的组织块在进行脱水前用70%酒精洗去固定液。 3 .脱水和硬化 经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换 出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。 常用的脱水剂是不同浓度的酒精，因为酒精与水有很大的亲和力，酒精浓度可以逐渐升高，置换出组织中的水。脱水必须充分，脱水不充分会影响透明和浸蜡。脱水过程要逐级上升，不能操之过急，跳级脱水会引起组织块强烈的收缩变形。 脱水所用的酒精浓度及过程如下： 30%> 5C%> 7%> 80%> 9%> 95%> 10（% （I ）> 10（% （n ） 组织块在各级较低浓酒精（小于70% ）中脱水的时间应视组织块的大小而定，大小不超过 0.5立方厘米的组织块脱水时间为6?12 hr，在高浓度酒精中（大于70%）脱水时间为3 hr 左右。组织块在无水酒精中需经过两次处理，以保证脱净水分。由于无水酒精有使组织变脆 的缺点，故在无水酒精中脱水的时间不宜过长，一般应在15?30 min左右。在脱水瓶中酒 精的量与组织块之比约为50:1。 简化步骤如下： 70% （一夜）——80% （1 hr）——90% （30 分）——95% （30 分）——100% （15 分）——酒精+二甲苯（15分）——二甲苯（3分）——石蜡+二甲苯（30分）——石蜡（80分） 4 .透明 透明是石蜡切片法切片前必经的一步。其目的在于用矿物油或植物油等透明剂置换出无水酒 精，以便于熔化的石蜡浸渗到组织间隙中，故透明剂必须是能分别与石蜡和酒精相溶的。经