黄芪皂苷类提取

黄芪皂苷的提取与纯化

1.黄芪的有效成分

黄芪化学成分的研究，始于上世纪 50 年代初期，迄今为止，已从黄芪类中药中分离出了几十种活性成分。经药理学研究表明：黄芪主要含有黄芪皂甙类、黄芪多糖类、黄酮类、氨基酸类及少量微量元素类。肖容等人对黄芪中氨基酸进行了提取，得到 15 种氨基酸并测出其含量。根据日本、前苏联和中国学者的研究，黄芪中的黄酮或黄酮类似物约二十种左右，大多属于黄酮，异黄酮和异黄烷类化合物，从黄芪中分离的黄酮具有抗缺血和改善血相作用，是天然抗氧化剂家族中的重要成员之一，它具有很强的清除自由基和抑制脂质过氧化特性。黄芪中主要的有效成分为黄芪皂甙和黄芪多糖。

2. 黄芪皂甙

2.1 皂甙的分类及性质

皂甙是由皂甙元和糖组成，依据甙元的结构将皂甙分为两大类，其一为甾体皂甙，另一类为三萜皂甙。甾体皂甙结构中大多不含羧基而呈中性，而三萜皂甙根据水解后结构分成四环三萜皂甙和五环三萜皂甙两大类，结构中可见羧基，因此酸性皂甙多属此类。

黄芪中含有大量的皂甙类及三萜类化合物，约有50多种左右，它们大多属于四环三萜类，其中含量较多的为黄芪皂甙Ⅳ，即黄芪皂甙甲苷。皂甙的溶解度随其分子中连接糖数目不同而不同。一般可溶于水，易溶于热水、热甲醇及热乙醇，不溶于乙醚等极性小的有机溶剂，具有溶血作用，可被酶或酸溶液水解，水解后的糖多为葡萄糖、半乳糖、鼠李糖及其他五碳糖。

2.2 皂甙的提取

(1) 正丁醇萃取法

皂甙在水饱和正丁醇或戊醇中溶解度大，且能与水分成两相，可利用此性质从皂甙水溶液中用丁醇或戊醇提取皂甙，与亲水性大的糖、蛋白质等分离。具体方法用亲水性强的正丁醇为溶剂在水溶液中作两相萃取，皂甙转溶于正丁醇，一些亲水性强的杂质如糖、蛋白质、鞣质等仍留在水中，与皂甙分离。

(2) 甲醇提取-乙醚沉淀法

甲醇提取含皂甙植物，过滤，回收绝大部分甲醇，冷却甲醇浓缩液，利用皂甙不溶于乙醚的特性，加入等体积的乙醚，摇匀，析出大量白色沉淀，静置，倾出上清液，再加入乙醚，又有白色沉淀产生，如此重复，直到加入乙醚无沉淀产生为止。把沉淀物干燥，得黄色粗皂甙，如其纯度不合要求，可以再溶于甲醇，加乙醚沉淀。此法流程简单，能耗少，易于操作，但溶剂消耗量大。

(3) 水提取-无水乙醇溶解法

水提取皂甙，过滤，浓缩，真空干燥，粉碎，得棕色粗皂甙。利用皂甙可溶于热无水乙醇，而糖类、蛋白质等杂质不溶原理，采用热无水乙醇把粗皂甙粉中的皂甙溶解出来，回收部分乙醇，冷却，静置，即有大量的白色皂甙析出。此法所得的皂甙纯度很高，但溶剂和电能消耗大，皂甙得率不高。

(4) 大孔树脂法

用水或醇类提取皂甙去杂后，用少量水溶解粗皂甙，上大孔树脂柱，先用水冲洗柱子，乙醇洗脱，皂甙主要被60-80%乙醇洗脱出来，收集这部分的洗脱液，浓缩至干，得精制皂甙，淡黄色。大孔树脂对物质的吸附是以范德华力为主的，非极性分子形式的杂质容易被吸附，而且树脂内部具有很多大小适当的孔穴，在一定程度上可以依照分子量的大小进行分离。分离过程中，一些无机盐，低分子量的糖在大孔树脂中由于极性的原因不被吸附而容易被水洗脱。蛋白质、中分子量及大分子量的多糖类被低浓度的乙醇除去。通过大孔树脂后，已经得到纯度较高、质感较

好的皂甙。此法不仅操作简单，成本低，回收率大，而且连续化程度高，适宜工业化生产。

(5) 重金属盐沉淀法

皂甙的水溶液可以和一些金属盐类如铅盐、钡盐、铜盐等产生沉淀，利用这一性质可以进行皂甙的提取分离。但此法会有重金属残留，对人体有害，而且所得的皂甙纯度也不高，需配合其它方法进一步提纯，故很少采用。

(6) 超临界CO2萃取

超临界流体萃取(Supercritical Fluid Extraction)技术是近30年来发展起来的一项新型萃取和分离技术。超临界流体(简称SF)具有和液体相近的密度，其粘度与气体相近，扩散系数为液体10-100倍，因此对许多物质有较好的渗透性和较强的溶解能力。但是不同植物的皂甙在分子量和极性上有比较大的差别，究竟此法能否适应所有的皂甙，还有待研究。

A 索氏提取法:分别采用 95％乙醇、70％乙醇和 30％乙醇进行索氏提取器提取，提取溶剂体积为 350ml，提取时间为 4 小时。

B 超声波法:采用 95％乙醇进行超声波提取黄芪皂甙，提取溶剂体积为

350ml，超声时间为 30min。

C 煎煮回流法:分别采用醇碱提取法、水提取法和碱水提取法进行回流提取实验，提取溶剂体积为 350ml，提取时间为 2 小时。

1. 将饮片用中药粉碎机粉碎到适合提取的粒度。

2 去除杂质:使用 7.5 倍的丙酮和石油醚为 1:1 的溶液在功率为 100％的条件下进行超声处理。

3 过滤，黄芪样品中的有机溶剂挥发风干，用于提取实验。

4 提取:称取适量上述操作后所得黄芪干粉，置于圆底烧瓶中或索氏提取器中，按一定料液比、浸提温度和浸提时间等提取条件，在热水浴中回流浸提数小时，冷却后离心，收集上清液备用。

5 滤渣复提:将初次浸提残渣，按前次操作进行重复提取。

6 醇沉:在浓缩液中加入适量的无水乙醇溶液，静置过夜，4000r/min离心

20min，弃去沉淀。

2.3 皂甙的分离纯化方法

由于皂甙亲水性大，与杂质分离较困难，有些皂甙结构差别不大，上述方法只能得到较纯的总皂甙，若要得到单体，目前常用色谱分离法作进一步分离

1 正丁醇萃取:将提取物制备为水溶液，加入足够的水饱和的正丁醇进行萃取。

2 大孔树脂柱层析

(1) 大孔树脂 D101 预处理:2mol/L HCl 浸泡 12 小时，用蒸馏水冲洗至中性；2mol/L NaOH 浸泡 12 小时，用蒸馏水冲洗至中性，95％乙醇浸泡 24 小时，溶胀后，用 95％乙醇洗至洗出液加适量蒸馏水至无白色混浊现象，再用大量水洗至无醇味。

(2) 装柱:采用常规湿法装柱，装柱前于柱内倒入一定量的水。将带水的吸附树脂，沿着玻璃棒一次性加入层析柱中，同时开启柱底活塞，水从底部缓缓流出，使树脂自然沉降而不留气泡，注意在装柱过程中始终保持液面高出树脂层面 20mm 以上。

(3) 上样与洗脱:正丁醇萃取溶液浓缩后蒸馏水溶解，取适量水溶液环壁缓慢均匀的加入到树脂柱上，采用 80％乙醇进行洗脱并用香草醛硫酸比色法进行检测。

(4) 树脂的再生用水去除杂质，至水清澈为止，用 5%HCI 溶液以4-6BV/h 的流速通过树脂层，浸泡 24h，而后以同样流速用水洗至出水呈中性，用 2%NaOH 溶液以 4-6BV/h 的流速通过树脂层，浸泡 24h,而后以同样流速用水洗至出水呈中性即可。

陈长仁药学1101

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2.3 硅胶柱层析:把洗脱液和硅胶混合搅拌成稀状后装入硅胶柱里，(注意:此过程中不能使液体流干)，装好柱后，把干粉倒入，再加适量液体(氯仿)搅拌，再加洗脱液开始洗脱。收集洗脱液，用薄层层析法来鉴定。