细菌常见的生化反应试验
细菌常见的生化反应试验
（一）什么是生化试验?
指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。
生化试验或称生化反应：细菌的酶不完全相同，对营养物质的分解能力不一致，因此其代谢产物各异。在培养基中加入可与被测终产物反应的指示剂，产生肉眼可见的变化，如颜色的改变等，利用生化方法来鉴定细菌的试验，统称为细菌的生化试验或称生化反应
（二）生化试验的方法：
1在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的pH值变化。
2在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。
3根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。
4根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。
（三）生化试验的注意事项
1.待检菌应是新鲜培养物，培养18~24h。
2.待检菌应是纯种培养物。
3.遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48
小时。
4.应做必要的对照试验。
5.提高阳性检出率，至少挑取2~3待检的疑似菌落分别进
行试验。
（四）检验细菌的生化试验范围
:1、糖（醇）类代谢试验 2、氨基酸和蛋白质代谢试验3、有机酸盐和铵盐的利用试验 4、呼吸酶类试验 5、毒性酶类试验
二、糖醇类代谢试验
（一）糖醇类发酵试验
（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验
（三）V-P试验
（四）甲基红（Methyl Red）试验MR
（五）七叶苷水解试验（六）甘油品红试验（一）糖醇类发酵试验
1、原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖(醇)，有的只能分解1~2种糖(醇) ，有的分解糖(醇)能产酸产气，有的分解糖(醇)只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。
常用的糖醇
单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖
双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖
三糖：棉子糖
多糖：菊糖、肝糖、淀粉
醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇
2试验方法：用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置36±1.0℃培养1~3天，每天观察结果。
3、结果观察和记录：
•产酸产气，阳性，以“⊕”表示
•产酸不产气，阳性，以“+”表示
•不产酸产气，阴性，以“-”表示
应用：沙门氏菌可发酵葡萄糖但不发酵乳糖。大肠埃希菌可发酵葡萄糖及乳糖。
有些菌可发酵同一种糖类，其发酵产生的代谢产物也不尽相同。如大肠埃希菌和志贺菌均可发酵葡萄糖，但前者产酸产气，而后者仅产酸，故可利用此试验来鉴定细菌。
（二）葡萄糖氧化发酵OF试验
1、原理：
细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。
氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；
发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；
不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。
2、方法：
取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入一层（约1cm）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在37℃培养2~4h天，每天观察结果。
应用：可用于鉴别肠杆菌科细菌（发酵型）与非发酵菌（氧化型或产碱型）。也可用于鉴定葡萄球菌（发酵型）和微球菌（氧化型）。
3、结果观察与记录
（三）V-P试验
1、原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的O2氧化为二乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用下，二乙酰与培养基中的蛋白胨中精氨酸等所含的胍基生成红色化合物，即V-P试验阳性，称V－P（+）反应。
应用：本试验常与甲基红试验一起使用。二者结果通常相反。即如大肠埃氏菌、沙门菌、志贺菌等甲基红呈阳性反应，而VP反应则为阴性。沙雷菌、阴沟肠杆菌等，VP反应为阳性，而甲基红反应为阴性。
2、试验方法
（1）奥梅拉（O’Meara）法（2）贝立脱（Barritt）氏法（3）快速法
（１）奥梅拉法
将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1 ℃培养48h，每1mL培养液加奥梅拉O’Meara试
剂0.1ml，摇动试管1~2min，静置于37℃恒温箱4h ，或在48~50 ℃水浴放置2h后判定结果。
（2）贝立脱法
将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1℃培养2天，每2mL培养液先加入6%a-萘酚纯酒精溶液1mL，再加40%氢氧化钾水溶液0.4ml，摇动2~5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1 ℃培养4h ，如显现红色为阳性，呈黄色或有类似铜色者，可判定为阴性。
（3）快速法
将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中，挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。不产酸的培养物不能使用。3、结果观察与记录
（1）发酵管出现红色者，为阳性，记V-P +
（2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记V-P - （四）甲基红试验（MR）
1、原理：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途
径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基pH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色，为甲基红试验阳性；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液pH＞5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。
2、试验方法：挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1 ℃或30 ℃（以30 ℃较好）培养3~5天，从第48h起，每日取培养液1mL，加入甲基红指示剂1~2滴，立即观察结果。
3、结果观察与记录
（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记MR +；
（2）呈橘黄色或黄色为阴性，记MR -，迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性，即可判定结果。
应用：主要用于大肠埃希菌（阳性）和产气肠杆菌（阴性）的鉴别。
•肠杆菌中许多细菌甲基红试验为阳性，如沙门菌、志贺
菌、枸橼酸杆菌、变形杆菌等为阳性，但肠杆菌属和克
雷伯菌属为阴性。
（五）七叶苷水解试验
１、原理：七叶苷被细菌分解后，生成葡萄糖和七叶素，七叶素与Fe2+结合，生成黑色化合物，使培养基呈黑色，以此鉴别细菌。
2、试验方法：将待试纯培养物少许，接种于七叶苷培养基，于36±1 ℃培养24h,观察结果。
3、结果观察与记录
（1）培养基变为黑色或棕黑色者，为阳性，记录为+ （2）培养基不变色者，为阴性，记录为-
（六）甘油品红试验
1、原理：某些细菌可分解甘油成为丙酮酸，并进一步脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红生成醌式化合物，呈深紫红色，以此鉴别细菌。
2、试验方法:取待检菌的新鲜纯培养物，接种于甘油品红肉汤培养基中，于36±1 ℃培养8天,并用未接种的培养基在
相同条件下培养作为阴性对照，观察结果。
3、结果观察与记录
（1）出现紫色或紫红色者,为阳性，记录为+
（2）与对照管颜色相同者,为阴性，记录为-
三、氨基酸和蛋白质代谢试验
（一）靛基质（吲哚）试验
1、原理：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。
2、试验方法所用试剂:（1）柯凡克(Kovacs)试剂或（2）欧-波试剂
将待检菌小量接种于培养基中，于36±1 ℃培养24~48h时后，加入柯凡克试剂数滴，轻摇试管，呈红
色者为阳性。
或沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约0.5ml覆盖液面，两液接触处呈现玫瑰红色者，为阳性反应，无红色者为阴性
反应。
3、结果观察与记录：
呈现玫瑰红色，为阳性反应，记+
无红色者，为阴性反应，记-
（二）硫化氢（H2S）试验
1、原理：某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鉴别细菌
2、试验方法：挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养基上，于36±1℃培养24~48h，观察结果。
3、结果观察与记录
培养基底部呈黑色，为阳性，记+
培养基底部无黑色，为阴性，记-
应用：用于肠道杆菌鉴定试验，如：沙门氏菌属、爱德华菌属、枸橼酸杆菌属及变形杆菌等为阳性；肠道杆菌中其他菌属为阴性，沙门菌属中的甲型副伤寒沙门菌也为阴性。
（三）尿素酶试验
1、原理：某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚红指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性。以此鉴别细菌。
应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属的鉴定。奇异变形杆菌和普通变形杆菌尿素酶阳性，雷氏普罗威登斯菌和摩氏摩根菌阳性，斯氏和产碱普罗威登斯菌阴性。
2、试验方法：挑取大量培养18~24h的待试菌，浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2、4和24h分别观察一次结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色不变者为阴性。如阴性应继续培养至4天，作最终判定。
3、结果观察与记录：
培养基变呈粉红色，为阳性，记+
培养基颜色不变，为阴性，记-
（四）氨基酸脱羧酶试验
1、原理：某些细菌能产生氨基酸脱羧酶, 可使赖氨酸、鸟氨
酸生产脱羧作用, 生成胺类物质和CO2。
胺类物质使培养基呈碱性变紫色，为阳性, 如呈黄色为阴性，以此鉴别细菌。
2、试验方法：取待检菌，分别接种于含有氨基酸的培养基内和不含氨基酸的对照培养基内，在36±1 ℃培养1~4天，每天观察结果。
3、结果观察与记录：
试验管呈紫色，对照管呈黄色，为阳性，记+
试验管、对照管都呈黄色，为阴性，记-。
阳性反应试验管颜色变化过程：紫色→黄色→紫色
原理：对照管呈黄色，说明有细菌生长。
在培养的早期（10~12h），细菌发酵葡萄糖产酸使培养液pH 下降，指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色，以后由于氨基酸脱羧生成胺，pH又回升至碱性，指示剂显紫色。
应用：沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的鸟氨酸和赖氨酸脱羧酶试剂均为阳性。志贺菌除宋氏和鲍氏志贺菌外其他志贺菌均阳性。故可作为肠杆菌科细菌鉴定的重要
方法。此外，对链球菌和弧菌科细菌的鉴定也有重要价值。（五）苯丙氨酸脱氨酶试验
1、原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物，以此鉴别细菌。
2、试验方法：从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物，接种于苯丙氨酸培养基上，在36±1 ℃培养18~24h后，加入氯化铁溶液4~5滴，转动试管，使试剂与菌苔表面充分接触，立即观察结果。
3、结果观察与记录
试验管立即出现绿色，为阳性，记+
无色为阴性，记-。
应用：本试验特异性较高，主要用于肠杆菌科细菌鉴定。
变形杆菌属、摩根菌属和普罗威登菌属细菌均为强阳性，肠杆菌科中其他细菌均为阴性。
（六）明胶液化试验
1、原理：有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将
明胶先水解为多肽，又进一步将多肽水解为氨基酸，明胶失去凝胶性质，使培养基由固态变为液态。
2、试验方法：
挑取培养18~24h的待试菌，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度。于20~22℃培养7~14天。明胶高层亦可培养于36±1℃。
另取一支未接种的培养基一同培养作对照，每天取出两支试管，放入冰箱放置20~30min后，再观察结果。3、结果观察与记录：
明胶液化，为阳性，+。
明胶凝固，为阴性，-。
四、有机酸盐和铵盐的利用试验
碳源利用试验：细菌对单一来源的碳源利用的鉴定试验（一）枸橼酸盐利用试验
1、原理：某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解枸橼(柠檬)酸盐生成碳酸盐；同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为深蓝
色，为阳性。
2、试验方法：挑取待检菌，在西蒙枸橼酸盐培养基斜面上密集划线接种，在36±1 ℃培养1~4天，每天观察结果。
3、结果观察与记录：
斜面有菌苔生长，培养基斜面变为蓝色或深蓝色，为阳性，记+；
无菌苔生长，培养基斜面仍为绿色者，为阴性，记-
应用：枸橼酸盐利用试验用于肠杆菌科中各菌属间的鉴别，在肠杆菌科中，埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属等为阴性，其他菌属为阳性。
（二）丙二酸盐利用试验
1.原理：某些细菌可以利用培养基中的丙二酸盐作为唯一碳源,丙二酸盐被分解成碳酸钠,使培养基变为碱性,培养基由草绿色变成蓝色，为阳性，以此鉴别细菌。
2、试验方法：取待检菌新鲜纯培养物，接种于丙二酸钠培养基上，于36±1 ℃培养48h，观察结果。
3、结果观察与记录：
培养基由草绿色变成蓝色,为阳性,记+
培养基无颜色变化,为阴性,记-
应用：常用于肠杆菌科细菌鉴定，亚利桑那和克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属中有些菌种也呈阳性反应，其他各属均为阴性。
Mimic试验：吲哚（I）、甲基红（M）、VP（Vi）、枸橼酸盐利用（C）四种试验常用于鉴定肠道杆菌，合称为IMViC试验。
I - 吲哚（indol）试验M - 甲基红（methyl red）试验
Vi - VP（Voges-Proskauer）试验
C -枸橼酸盐利用（citrate utilization）试验
I M Vi C试验
大肠埃希菌+ + - -
产气杆菌- - + +
五、呼吸酶类试验
（一）氧化酶试验
1.原理：氧化酶使细胞色素C氧化后，氧化型细胞色素C 再使盐酸二甲基对苯二胺氧化，使生成玫瑰红色到暗紫色的醌类化合物,再和α-萘酚结合,生成吲哚酚蓝,呈蓝色反应，为阳性。
试剂：1% α-萘酚-乙醇液1%盐酸二甲基对苯二胺2、试验方法：用滴管直接滴加1%盐酸二甲基对苯二胺试剂1~2滴在培养物上,再加入1% α-萘酚-乙醇液1~2滴, 在30秒内判定试验结果。
3、结果观察与记录：
在30秒内呈蓝色反应,为阳性,记+
不变色或为红色者,为阴性,记-
应用：奈瑟菌属的菌种均呈阳性反应。也用于区别假单胞菌与肠杆菌，肠杆菌科细菌为阴性，假单胞菌为阳性。莫拉菌属也为阳性。
本试验中避免接触含铁物质，否则易出现假阳性，选铜绿假单胞菌为阳性对照，大肠埃希菌为阴性对照。（二）过氧化氢酶（触酶）试验
1.原理：某些细菌可分泌过氧化氢酶，加入过氧化氢后，可将过氧化氢分解生成水和氧气，产生气泡，即为阳性反应。
2、试验方法：挑取固体培养基上的新鲜菌落一环，置于洁净玻片上（或试管），滴加3%过氧化氢液数滴，或在琼脂斜面培养物上直接滴加过氧化氢液，立即观察结果。
3、结果观察与记录：
产生气泡者，为阳性，记+
不产生气泡者，为阴性，记-
应用：绝大多数细菌均能产生过氧化氢酶，但链球菌属触酶阴性，故常用此试验来鉴别链球菌。
应注意本试验不宜用血琼脂平板上的菌落（易出现假阳性）。由于陈旧培养物可失去酶活性，所以试验应取新鲜培养菌。用金黄色葡萄球菌作阳性对照，阴性对照用链球菌。
（三）硝酸盐还原试验
1、原理：某些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，在酸性条件下，亚硝酸盐可生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再
与α-萘胺作用，生成红色的化合物，呈红色反应，为阳性反应
试剂：A、对氨基苯磺酸试剂B、α-萘胺试剂
2、试验方法：取待检菌新鲜纯培养物，在硝酸盐培养基上接种，在36±1 ℃培养1~4天，每天取2mL培养液,加入A、B试剂的等量混合物各二滴混匀，立即观察结果。
3、结果观察与记录：
呈现红色，为阳性，记+
若无红色出现，为阴性，记-
（四）氰化钾试验
1.原理：氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂,可与呼吸酶作用使酶失去活性,抑制细菌的生长,但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长,以此鉴别细菌.
2、试验方法:取培养20～24h的营养肉汤培养液或菌落1环，接种至对照培养基及氰化钾培养基内，立即以橡胶塞塞紧，36±1 ℃培养24～48h，观察结果。
3、结果观察与记录:
细菌鉴定中常用的九个生化反应
１、糖酵解试验 不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。 试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力、培养物可呈弥散生长。 ２、淀粉水解试验 某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。 试验方法：以18~24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培养物）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1°C培养24~48h，或于20°培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。 淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。 3 、明胶液化试验 有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。 试验方法：挑取18~24h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。于20~22℃培养7~14天。明胶高层亦可培养于36±1℃。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂，若为阳性，10~20min后，菌落周围应出现清晰带环。否则为阴性。 4 、石蕊牛奶试验有些微生物能水解牛奶中蛋白质酪素，酪素水解可有石蕊牛奶检测，石蕊牛奶培养基由脱脂牛奶和石蕊组成，是浑浊的蓝色。酪素水解成氨基酸和肽后培养基就会变得透明。石蕊牛奶也常用来检测乳糖发酵，有酸石蕊会转变为粉红色，过量的酸可引起牛奶的固化（凝乳形成）。氨基酸分解会引起碱性反应使石蕊变为紫色。某些细菌能还原石蕊使试管底部变为白色。 试验方法：取两支石蕊牛奶培养基试管，以无菌操作分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌，置35℃恒温箱中，培养24~38h。观察培养基颜色。石蕊酸性时为粉红色，碱性为紫色，还原后为无色。 ５、靛基质试验 某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。 试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±1C培养24h时后，取约2ml培养液，加入Kovacs氏试剂2~3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs 氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。 6 、硫化氢（H2S）试验 有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐
实验十二细菌常用生理生化反应实验结果观察.
实验十二细菌常用生理生化反应实验结果观察 一结果观察 １葡萄糖发酵实验 直接观察试管, 试管变黄者为葡萄糖发酵阳性菌,不变者为阴性菌. 左边为恶臭假单胞菌，有气泡并变为黄色；右边为大肠杆菌, ２V. P. 反应和甲基红试验: 将培养好的液体培养基分装于两个干净的小试管中,在一管中滴入2-3滴甲基红试剂, 溶液变红的为甲基红阳性菌,不变的为甲基红阴性菌. 在另一管中加入V. P. 试剂,在37℃保温15分钟, 变红者为阳性菌,不变者为阴性菌. VP，图为右边为大肠杆菌，溶液变红，为阳性菌。 ３吲哚实验 在培养好的液体培养基中加入1厘米高的乙醚,振荡,静置分层,加入2-4滴吲哚试剂,在掖面交界出现红色者为吲哚反应阳性菌,不变者为阴性菌.
左边为大肠杆菌，出现红色阳性菌；右边为产气杆菌，颜色不变，阴 性菌。 ４硝酸盐还原实验 在点滴板上滴入革里斯试剂A液和B液，如过溶液变红说明有亚硝酸盐，为硝酸盐还原阳性菌，如果不变色需要再倒出部分培养基在另外的小孔中再滴如耳苯胺试剂，如果变蓝，说明此菌为阴性菌；如果不变色，说明此菌为硝酸盐还原强阳性菌． 右下方恶臭假单胞菌，加入革里斯试剂A、B后不变色，再加入二苯 胺试剂后变蓝，为阴性菌；左上方大肠杆菌为红色。 ５柠檬酸盐实验 直接观察斜面，斜面变兰色者为柠檬酸盐利用阳性菌，不变者为阴性菌．
左边产生蓝色，产气杆菌阳性；右边为大肠杆菌，阴性。 ６明胶水解 向培养好的明胶培养基中加入酸性氯化汞或三氯乙酸溶液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为明胶水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌． 左边为大肠杆菌，出现透明圈，阳性；右边为枯草杆菌，阴性菌。 7 淀粉水解实验 向培养好的淀粉培养基平板上加入碘液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为淀粉水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌．
各种微生物生化试验方法原理
各种微生物生化试验方法原理 通常利用生化试验的方法，检测细菌对各种物质的代谢作用及其代谢产物，称为细菌的生化反应，常用于细菌的鉴别。 1、糖类分解产物 （1）糖发酵试验（carbohydrate fermentation test）不同种类的细菌对糖的分解利用能力不同，一般以能否分解某种糖，是否产酸产气等现象来鉴别。例如大肠杆菌能分解葡萄糖和乳糖，产酸且产气；而伤寒杆菌只分解葡萄糖产酸不产气，且不分解乳糖。这是因为大肠杆菌分解葡萄糖等产生甲酸，经甲酸解氢酶的作用生成H2和CO2。而伤寒杆菌无此酶，故分解葡萄糖只产酸不产气。 （2）VP试验（V oges-Proskauer test）产气杆菌将分解葡萄糖产生的两分子丙酮酸脱羧，生成一分子乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中氧气氧化，生成二乙酰，二乙酰可与培养液中含胍基的化合物（如蛋白胨中的精氨酸）反应，生成红色的化合物，此为VP试验阳性。大肠杆菌分解葡萄糖不生成乙酰甲基甲醇，故VP试验阴性。 （3）甲基红试验（methyl red test）大肠杆菌和产气杆菌均属G-短杆菌，且都能分解葡萄糖、乳糖产酸产气，二者不易区别。但两者所产生的酸类和总酸量不一：大肠杆菌可产生甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等，而产气杆菌只产生甲酸、乙醇及乙酰甲基甲醇。故大肠杆菌培养液PH在4.5以下，加入甲基红指示剂呈红色，为甲基红试验阳性；产气杆菌培养液PH在5.4以上，加入甲基红后呈桔黄色，为甲基红试验阴性。 （4）枸橼酸盐利用试验(citrate utilization test）产气杆菌在以枸橼酸盐为唯一碳源的培养基上生长，分解枸橼酸盐产生CO2，并转变为碳酸盐，使培养基由中性变为碱性，含溴麝香草酚蓝（BTB）指示剂的培养基由淡绿色变为深兰色，此为枸橼酸盐利用试验阳性。大肠杆菌不能利用枸橼酸盐，故在此培养基上不能生长，培养基仍为绿色。 2、蛋白质及氨基酸的分解产物 （1）硫化氢试验（hydrogen sulfide test）有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、甲硫氨酸等）产生H2S，如遇醋酸铅或硫酸亚铁，能生成黑色的硫化物，为硫化氢试验阳性。本试验常用于区别肠道杆菌的种类。沙门氏菌属通常为阳性;大肠杆菌、产气杆菌、志贺氏菌为阴性。 （2）明胶液化试验（gelatin liguefaction test）有些细菌具有明胶酶，能分解明胶使其失去凝固能力而液化。变形杆菌、霍乱弧菌、绿脓杆菌、枯草杆菌等能液化明胶；大肠杆菌、沙门氏菌则不能。 （3）吲哚试验（indole test）有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成无色吲哚，加入对-二甲基氨基苯甲醛，无色吲哚生成红色玫瑰吲哚， 为吲哚试验阳性。大肠杆菌、霍乱弧菌等吲哚试验阳性；产气杆菌、伤寒沙门氏菌为吲哚试验阴性。 吲哚对二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚 细菌的生化反应是鉴别细菌的重要手段：其中吲哚试验（I）、甲基红试验（M）、VP试验(V)和枸橼酸盐利用试验（C），简称为IMVIC试验，常用于大肠杆菌与产气杆菌的鉴别。典型的大肠杆菌的IMViC试验结果为“++--”，而产气杆菌是“--++”。 0票票数
细菌的生理生化反应实验
细菌的生理生化反应实验 一．目的与意义 一般来说，对一株从自然界或其他样品中分离纯化的未知菌种的鉴定要做以下几个方面工作。①个体形态观察，进行革兰氏染色，分辨是G（+）菌还是G（-）菌。并观察其形状、大小、有无芽孢及其位置等；②菌种形态观察，主要观察其形态、大小、边缘情况、隆起度、透明度、色泽、气味等特征；③做动力试验，看他能否运动及其鞭毛着生类型（端生、周生）；④做生理生化反应及做血清学反应实验。最后根据以上实验项目的结果，通过查阅微生物分类检索表，给未知菌进行命名。 此实验为生理生化反应实验，就是使不同种类的细菌在对营养物质的利用、代谢产物的种类、代谢类型等方面表现出差异，故利用这些差异作为细菌分类作为细菌分类鉴定的重要依据。要求在此实验中了解细菌在不同底物环境中各种代谢途径和产物，加深理解细菌生化反应原理；根据细菌在培养基中生理生化特点，学会鉴定细菌。 生理生化反应的项目很多。本实验结合肠道杆菌科的分类鉴定，选作其中重要的几项实验。 二．材料与用具 1.菌种：大肠杆菌、沙门氏菌。 2.培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖）糖发酵半固体培养基（添加溴甲酚紫试剂）、葡萄糖蛋白胨水培养基、童汉氏蛋白胨水培养基、
柠檬酸盐斜面培养基（添加溴麝香草酚蓝变色范围pH6.8 绿—pH7.6 蓝）、三糖铁琼脂培养基。 3.试剂：甲基红指示剂、40%NaOH、吲哚检验试剂（对二甲基氨基苯甲醛）、双氧水等。 4.用具。酒精灯、接种环、接种针、试管等。 三．实验内容与方法 1.糖（醇）类发酵实验 多数细菌都能利用糖类作为碳源及能源，但各种菌因含有不同发酵糖（醇）类的酶，故表现出有的能分解或不分解某些糖类，有的分解糖产酸，并产气，或只产酸不产气，可根据这些特点鉴别细菌（培养基中指示剂溴甲酚紫pH6.8以上呈紫色，pH5.2以下呈黄色）。 大肠杆菌与沙门氏菌的生理生化鉴定区别 操作：（葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖）糖发酵半固体培养基（添加溴甲酚紫试剂）中，无菌操作，穿刺接种，37℃培养1天。 记录：阴性—不产酸（紫色）；阳性—产酸（黄色）。 2.甲基红（M·R）实验 某些菌在糖代谢过程中，分解糖类，产生丙酮酸，继而再分解为各种酸，使培养基pH下降至4.5以下，加入甲基红指示剂呈红色，为阳性反应；若分解糖产酸少，或所产生的酸转换为其他物质，则培养基pH在4.5以上，加入指示剂呈黄色，为阴性。 操作：葡萄糖蛋白胨水培养基中，无菌操作，斜面取菌接种，37℃培养2天。观察时加入甲基橙试剂。
细菌鉴定中常用的生理生化反应实验报告
细菌鉴定中常用的生理生化反应实验报告 一、引言 在微生物学中，鉴定细菌的方法有很多种，其中生理生化反应实验是最常用的一种方法之一。生理生化反应实验可以通过观察细菌对不同物质的代谢情况来确定其种类和特性。本报告将介绍细菌鉴定中常用的生理生化反应实验。 二、目的 本报告旨在介绍常用的生理生化反应实验，包括试剂、操作步骤、结果解释等内容，以帮助读者更好地了解和掌握这些实验。 三、材料与方法 1. 大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）培养基； 2. 硝酸盐还原试剂； 3. 糖类试剂：葡萄糖、果糖、半乳糖； 4. 氨基酸试剂：天冬氨酸、赖氨酸； 5. 酶试剂：淀粉酶、蛋白酶； 6. 无水硫酸铜溶液。 四、实验步骤及结果解释
1. 硝酸盐还原试验 步骤： （1）取一支细菌液体培养物，加入硝酸盐还原试剂； （2）观察液体颜色变化。 结果解释： 若液体变为红色，则表示细菌能够还原硝酸盐为亚硝酸盐，是亚硝化菌。若无颜色变化，则表示细菌不能还原硝酸盐。 2. 糖类代谢试验 步骤： （1）取三个试管，分别加入葡萄糖、果糖、半乳糖； （2）加入相同量的细菌液体培养物； （3）观察试管内气泡产生情况。 结果解释： 若在葡萄糖试管内产生了气泡，则表示该细菌能够利用葡萄糖进行发酵代谢；若在果糖或半乳糖试管内产生了气泡，则表示该细菌能够利用果糖或半乳糖进行发酵代谢。 3. 氨基酸代谢试验 步骤： （1）取两个试管，分别加入天冬氨酸和赖氨酸； （2）加入相同量的细菌液体培养物； （3）观察试管内气泡产生情况。
结果解释： 若在天冬氨酸试管内产生了气泡，则表示该细菌能够利用天冬氨酸进行代谢；若在赖氨酸试管内产生了气泡，则表示该细菌能够利用赖氨酸进行代谢。 4. 酶代谢试验 步骤： （1）取两个试管，分别加入淀粉和蛋白质； （2）加入相同量的细菌液体培养物； （3）观察试管内颜色变化情况。 结果解释： 若在淀粉试管内出现了透明带，则表示该细菌能够分泌淀粉酶；若在蛋白质试管内出现了变色，则表示该细菌能够分泌蛋白酶。 5. 硫代硫酸盐还原试验 步骤： （1）取一支细菌液体培养物，加入无水硫酸铜溶液； （2）观察液体颜色变化。 结果解释： 若液体变为黑色，则表示该细菌能够将硫代硫酸盐还原为硫化物。 五、结论 通过以上实验，可以初步鉴定出细菌的种类和特性。在实际应用中，
细菌生化反应鉴定及其它试验操作规程
细菌生化反应鉴定及其它试验操作规程 1、氧化-发酵试验（O-F试验） 原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型。可以进行无氧降解的，称为发酵型（发酵型细菌在有氧无氧的条件下均能分解葡萄糖）。不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。 方法：将待检细菌同时穿刺接种两支Hugh-Leifson 培养基，其中一支培养基滴加无菌石蜡（或其它矿物油），高度不少于lcm。35C, 24小时或更长。 结果：培养基变黄表示细菌分解葡萄糖产酸，两支培养基均无变化为产碱型或不分解糖型；两支培养基均均产酸为发酵型。若仅不加石蜡的培养基产酸为氧化型。 应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵细菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者均为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌问的鉴别。 2、B -半乳糖苷酶（ONPG）试验 原理：细菌产生半乳糖苷酶，分解邻-硝基酚卩-D- 半乳糖苷（无色）生成邻-硝基酚（黄色）。 结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20-30 分钟内显色 应用：主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。
3、七叶苷水解试验原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子反应，生成黑色的化合物。 结果：培养基变黑为阳性，不变色为阴性。应用：主要用于D 群链球菌与其它链球菌的鉴别。前者为阳性，后者为阴性。也可用于革兰阴性菌与厌氧菌的鉴别。 4．甲基红试验原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基pH 值降至4.5 以下，加入甲基红呈现红色为阳性。若细菌分解葡萄糖产生的酸少，或产生的酸进一步转化为其他产物，则培养基pH 值仍在6.2 以上，加入甲基红呈现黄色为阴性。 结果：呈现红色为阳性，橘红色为弱阳性。黄色为阴性。 应用：主要用于鉴别大肠杆菌与产气杆菌，前者阳性，后者阴性。此外肠杆菌科中变形杆菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属和志贺菌属等阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。 5、VP 试验原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中，氧化为二乙酰，与精氨酸中的胍基作用生成红色化合物。 结果：在数分钟内出现红色为阳性，如无红色出现且
[实验六细菌的生化试验]细菌的生化实验
[实验六细菌的生化试验]细菌的生化实验实验六细菌的生化试验 目的要求 1．通过本试验加深对细菌生化反应原理和意义的理解； 2．掌握常规细菌生化试验操作方法。 操作步骤 一、糖类发酵（分解）试验 原理：细菌含有分解不同蔗糖（醇、苷）类的酶，因而分解各种糖（醇、苷）类的能力也不必一样。有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号：+）、产气（符号：○），培养基由兰变黄（指示剂溴指示剂麝香草酚兰由兰遇酸福兰县的结果），并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类（符号：－），培养基仍为兰色。 （一）适用于需氧菌的方法 培养基用邓亨氏（Dunham）蛋白胨水溶液（蛋白胨1g，氯化钠0.5g，水100ml，pH7.6按0.5～1％的比例分别加入各种辣椒），每100ml加入1.2ml的0.2％溴麝香草酚蓝（或用1.6％溴甲酚紫酒精溶液0.1ml）作指示剂。分装于试管（每一个试管事先都加有一枚倒立的小发酵管），10磅高压灭菌10分钟。 如在培养基中加入琼脂达0.5～0.7％，则成半固体，可省去倒立的小失水管。 0.2％溴麝香草酚蓝溶液配法： 溴麝香草酚蓝 0.2g 0.1N NaOH 5ml 蒸馏水 95ml
方法：从琼脂斜面的纯培养物上，用接种环取少量被检细菌接种于糖发酵管培养基中（如为半固体，应穿刺），在37℃培养，一般观察2～3天，观察时用上述符号标记之。 （二）适用于厌氧菌的方法 培养基： 蛋白胨 20g 氯化钠 5g 琼脂 1g 1.6％硫甲酚紫酒精溶液 1ml 糖 10g 硫乙醇酸钠 1g 蒸馏水 1000ml 将胨、盐、硫乙醇酸钠、琼脂和水放于水槽内，加热使融化，再加入所需的糖，调整pH到7.0，加入指示剂，分装试管，在10磅高压灭菌15分钟后，做成高层。 方法将厌氧菌的培养物用穿刺接种法接种于上述培养基的深部，于37℃培养。结果观察同需氧菌。 二、V－P试验（二乙酰试验） 原理：某些细菌能从葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇（Acetymethyl carbinol）→2，3-丁烯二醇（2，3-bytaylene cylycol），在有碱阿提斯鲁夫尔谷存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用，会带来粉红色的化合物。其反应式为： 2CH3H——→CH33十2CO2
细菌鉴定中常用的生理生化反应
细菌鉴定中常用的生理生化反应 1、实验原理 （1）细菌生化试验 各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。 （2）糖（醇）类发酵试验 不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先加入溟甲酚紫［P HS . 2 （黄色）一6 . 8 （紫色）] ，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。 （3）甲基红（Methylred ）试验（该试验简称MR 试验） 很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH 降低到4 . 2 以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是pH4 . 4 （红色）一pH6 . 2 （黄色）。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱梭，转化成醇等物，则培养基的pH 仍在6 . 2 以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。 （4）大分子物质代谢实验． 靛基质（口引睬）试验 某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质（叫睬），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。 硫化氢试验 某些细菌能分解含硫的氨基酸（肌氨酸、半肌氨酸等），产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。 明胶液化实验 某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，是为阳性。淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不做） 细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶（淀粉酶）将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖（或麦芽糖），再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。 （5）有机酸盐及氨盐利用试验 柠檬酸盐利用试验
细菌常见的生化反应试验
细菌常见的生化反应试验 （一）什么是生化试验? 指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。 生化试验或称生化反应：细菌的酶不完全相同，对营养物质的分解能力不一致，因此其代谢产物各异。在培养基中加入可与被测终产物反应的指示剂，产生肉眼可见的变化，如颜色的改变等，利用生化方法来鉴定细菌的试验，统称为细菌的生化试验或称生化反应 （二）生化试验的方法： 1在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的pH值变化。 2在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。 3根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。 4根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。
（三）生化试验的注意事项 1.待检菌应是新鲜培养物，培养18~24h。 2.待检菌应是纯种培养物。 3.遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48 小时。 4.应做必要的对照试验。 5.提高阳性检出率，至少挑取2~3待检的疑似菌落分别进 行试验。 （四）检验细菌的生化试验范围 :1、糖（醇）类代谢试验 2、氨基酸和蛋白质代谢试验3、有机酸盐和铵盐的利用试验 4、呼吸酶类试验 5、毒性酶类试验 二、糖醇类代谢试验 （一）糖醇类发酵试验 （二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验 （三）V-P试验 （四）甲基红（Methyl Red）试验MR
（五）七叶苷水解试验（六）甘油品红试验（一）糖醇类发酵试验 1、原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖(醇)，有的只能分解1~2种糖(醇) ，有的分解糖(醇)能产酸产气，有的分解糖(醇)只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。 常用的糖醇 单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖 双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖 三糖：棉子糖 多糖：菊糖、肝糖、淀粉 醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇 2试验方法：用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置36±1.0℃培养1~3天，每天观察结果。 3、结果观察和记录： ?产酸产气，阳性，以“⊕”表示
细菌生化鉴定检验
细菌生化鉴定检验 细菌在新陈代谢过程中进行着各种生物化学反应，由于细菌所具有的酶系不尽相同，对 底物的分解能力也不一样，因而其代谢产物也不同。用生物化学方法检测这些代谢产物，可 帮助鉴定细菌，这种生化反应测定方法称为细菌的生化试验。在临床细菌检验工作中,除根据 细菌的形态与染色及培养特性对细菌进行初步鉴定外，还往往利用细菌的生化试验进行进一 步的鉴定，细菌的生化试验对绝大多数分离的未知菌属(或种)的鉴定具有重要作用。因此， 掌握细菌生化反应的原理、方法及应用，对于鉴定和鉴别细菌具有重要意义。 细菌的生化试验的基本方法是，将已分离纯化的待检细菌，接种到含有特殊物质和指示 剂的鉴别培养基中，通过观察细菌在培养基内的pH值变化，或是否产生某种特殊的代谢产物，来判断细菌的生化反应结果。 1 糖(醇、苷)类发酵试验 1.1原理：由于各种细菌含有发酵不同糖(醇、苷)类的酶，故对糖的分解能力及分解糖产生的终末产物各不相同，如有的能分解糖类产酸、产气，有的仅产酸，有的不能分解糖。故 可利用此特点以鉴别细菌。 1.2方法：将分离的纯种细菌，以无菌操作接种到含有指示剂的糖(醇、苷)类发酵培养基中，35℃恒温箱培养18～24 h观察结果。若用微量发酵管，或培养时间较长，应注意保持湿度，以免培养基干燥。 1.3结果：接种的细菌，若能分解培养基中的糖(醇、苷)类，则培养基中的指示剂呈酸性反应。若产气.则可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，可使固体培养基内有 裂隙等现象。若不分解培养基中的糖(醇、苷)类，则培养基中除有细菌生长外，无其他变化。 1.4应用：发酵试验是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤 为重要。 2 葡萄糖氧化／发酵试验 2.1原理：根据细菌在分解葡萄糖的代谢过程中对氧需求的不同，将细菌分为氧化型、 发酵型和产碱型三类。细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有氧参加的，称为氧化型。氧化型 细菌在无氧环境中不能分解葡萄糖。细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解的，称 为发酵型。发酵型细菌无论是在有氧环境还是在无氧环境都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的 细菌称为产碱型。葡萄糖氧化／发酵试验亦称为O／F试验或Hugh－Leifson(HL)试验，利用 此试验可区分细菌的代谢类型。 2.2方法：取2支Hugh－Leifson(HL)葡萄糖培养基，置沸水中水浴10 min以驱逐培养基 中的氧气，冷却后，将待检菌同时接种两支HL培养基，其中一支培养基滴加无菌的液体石 蜡(或其他矿物油)，使培养基与空气隔绝。另一支不加液体石蜡，培养基暴露于空气中。将 培养基于35℃培养18～24 h。 2.3结果：两支培养基均无变化，为产碱型；两支培养基均产酸(变黄)，为发酵型；加液体石蜡的培养基不产酸，不加液体石蜡的培养基产酸，为氧化型。 2.4应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为 氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌之间的鉴别。 3 伏普试验
细菌鉴定中常用的理化生化反应
实验日期：2017.11.1 实验班级：生物技术指导教师：张建丽 姓名：高熹学号：1120152430 细菌鉴定中常用的理化生化反应 一、实验目的 1)了解细菌生理生化反应原理 2)通过细菌对不同含碳、氮化合物的分解利用情况了解细菌碳、氮代谢类型的多样性。 3)了解细菌在培养基中生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。 二、实验原理 1）糖（醇）类发酵实验 因细菌所含的酶不同，其发酵糖（醇）后的代谢产物亦不相同，即可产酸产气，或产酸不产气。酸的产生可利用培养基中溴甲酚紫的颜色变化进行判断（pH5.2黄色—6.8紫色），即当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管内倒置的杜氏小管中有无气泡来判断。 2）甲基红（Methyl red）实验（MR实验） 大肠杆菌等许多细菌分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸可进一步分解成甲酸（或乙酸\乳酸）,使培养基的pH降低到4.2以下,此时加入甲基红指示剂，呈现红色。 产气杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸,培养基的pH在6.2以上, 故此时加入甲基红指示剂,呈现黄色。 3）伏-普(Voges-Proskauer)氏实验(V.P.实验) 4）靛基质(吲哚)实验 大肠杆菌等能分解蛋白质中的色氨酸,产生靛基质(吲哚),靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合形成玫瑰色靛基质(红色化合物)。 5）硫化氢实验
某些细菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸\半胱氨酸等),产生硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐,形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁.为硫化氢实验。 6）明胶液化实验 某些细菌具有胶原酶,使明胶被分解,失去凝固能力,呈现液体状态,为明胶实验阳性。 7）淀粉水解实验 细菌不能直接利用淀粉,须经淀粉酶将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖)后被细菌吸收利用,细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明,即加碘液测定时，不再产生蓝色。 8）柠檬酸盐利用实验 产气杆菌等能以柠檬酸钠为碳源进行生长。其分解柠檬酸盐后产生碳酸盐, 培养基呈碱性.使培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为蓝色.不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌,在该培养基上不生长,培养基不变色. 三、实验试剂及器材 实验仪器和用具：恒温培养箱、试管、无菌平皿、杜氏小管、接种环,酒精灯； 微生物材料：大肠杆菌,变形杆菌,枯草杆菌,产气杆菌斜面； 试剂：甲基红试剂、V.P试剂、吲哚试剂格里斯试剂（A、B）、卢戈氏碘液； 培养基： 葡萄糖和乳糖发酵培养基（糖类发酵实验） 葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红和V.P.实验） 胰蛋白水培养基（吲哚实验） 柠檬酸铁铵或醋酸铅的半固体培养基（硫化氢实验） 明胶培养基（明胶液化实验） 淀粉培养基（淀粉水解实验） 柠檬酸钠斜面培养基（柠檬酸盐利用实验） 硝酸盐培养基（硝酸盐利用实验）。 四、实验步骤 1）糖（醇）类发酵实验 1. 编号：在试管上标明培养基名称,所接种的菌名和组号. 2. 接种：取 3 支葡萄糖发酵培养基, 1 支接种大肠杆菌，1 支接种变形杆菌, 留1 支不接种，作为对照. 3. 乳糖发酵试验接种方法同葡萄糖发酵试验。将已接种好的培养基置37℃培养箱中培养24h. 4. 结果观察:若细菌能发酵培养基中的糖，可使培养基的pH 降低, 培养基中的指示剂呈酸性反应(为黄色),若发酵糖产酸产气,不仅培养基呈黄色,且在倒置的小玻璃管(杜氏小管)中有气体（气体占杜氏小管的10%以上）；若被测细菌不分解培养基中的糖,则培养基不发生变化。 2）甲基红实验（MR 实验） 1. 取3 支葡萄糖蛋白胨水培养基，标记同上。
微生物鉴定之生化实验大全
微生物鉴定之生化实验大全 不同的细菌具有各自的独特的酶系统，因而对底物的分解力量各异，其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又具有不同的生物化学特性，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。把握各种生 化反应的原理和应用是细菌鉴定的基础。生理生化特性的测定主要 依据Shirling Gottlieb《InternationalJournal of Systematic Bacteriology》中鉴定的有关试验。 （一）碳水化合物代谢试验 糖（醇、苷）类发酵试验 （1）原理： 细菌分解糖的力量与该菌是否含有分解某种糖的酶亲密相关，故 分解糖的力量各不相同，细菌分解糖类后的终产物亦不全都，在含 糖培育基中加入指示剂，若细菌分解糖则产酸或产酸产气，使培育 基颜色转变，从而推断细菌是否分解某种糖或其他碳水化合物 （2）基本培育基： 在培育基中加入0.5%～1%的糖类（单糖、双糖、或者多糖）、醇 类（甘露醇、肌醇）苷类（水杨苷、菊糖等）。培育基可为液体、 半固体、固体或微量生化管几种类型。 （3）试验方法：
取某一种细菌的24h纯培育物分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖等培育基内，37℃培育24h，观看结果并记录。 （4）结果判定： 假如接种进去的细菌可发酵某种糖或醇，则可产酸，使培育基由 紫色变成黄色，假如不发酵，则仍保持紫色。如，发酵的同时又产 生气体，则在微量发酵管顶部积有气泡。 （5）应用： 是鉴定细菌最主要最基本的试验，特殊是对肠杆菌科细菌的鉴定 尤为重要。 氧化型与发酵型(O/F)的测定 （1）原理： 细菌在分解葡萄糖的过程中，必需有氧的参与的，称为氧化型， 细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解的，称为发酵型。 发酵型细菌无论在有氧或者无氧的环境中都能分解葡萄糖。不分解 葡萄糖的细菌称为产碱型。这在区分微球菌与葡萄球菌、肠杆菌科 成员中尤其有意义。 （2）培育基： 培育基蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，葡萄糖10g，琼 脂3g，1％溴麝香草酚蓝3mL，蒸馏水1000mL。将蛋白胨、盐、琼 脂和水混合，加热溶解，校正pH至7.2，然后加葡萄糖和指示剂，
细菌生理生化实验
细菌生理生化试验—小木虫 微生物生理生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生理生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区分的微生物。因此微生物生理生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一,微生物鉴定中常用的生理生化反应如下所示： (一) 糖、醇发酵试验 原理： 不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号：+）、产气（符号：○），培养基由紫（蓝）变黄（指示剂溴甲酚紫或溴百里酚蓝由紫或蓝遇酸变黄的结果），并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类（符号：－），培养基仍为紫（蓝）色。 培养基配制： 一般细菌常用休和李夫森二氏培养基： 蛋白胨：2g ，K2HPO4 :0.2g ，NaCl:5g ，糖（醇、糖苷）：1% ，水洗琼脂：5～6g，蒸馏水：1000mL，PH:6.8～7.0，溴百里酚蓝：1%水溶液3mL(先用少量的95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液)。先调PH后再加指示剂。 芽孢杆菌培养基配制： (NH4)2HPO4:1g ，MgSO4:0.2g ，KCl:0.2g ，酵母膏：0.2g ，糖（醇、糖苷）：1%水洗琼脂：5～6g ，蒸馏水：1000mL ，溴甲酚紫：0.4%乙醇液2mL，PH:6.8～7.0。先调PH后再加指示剂。 将以上培养基分装试管，培养基高度约为4～5cm ，115℃灭菌20min。 测定的糖（醇、糖苷）类可以包括：葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖（1.5%）、半乳糖（1.5%）、D-山梨醇、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、水杨苷等。 注意：以上亦可用液体培养基。 接种和观察结果： 用18～24h的幼龄菌种，用穿刺针接种于培养基中，适温培养1d，3d，5d后观察，颜色变黄为阳性，不变为阴性；有气泡产生为产气。 结果记录： 产酸：+，产气：○，不产酸长气：-。 (二) 淀粉水解试验 原理： 某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。 培养基配制： 牛肉膏5g；NaCl:5g；可溶性淀粉5g；琼脂:20g；蒸馏水1000mL。PH:7.2 121℃灭菌20min。 试验方法： 以18~24h的纯培养物，点接于淀粉琼脂平板（一个平板可分区接种）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1℃培养24～48h，或于20℃培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明圈、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明圈或肉汤呈深蓝色。 淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养
细菌鉴定中常用的生理生化反应
细菌鉴定中常用的生理生化反应 （1）细菌生化试验 各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物 或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢 作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。（2）糖（醇）类发 酵试验 相同的细菌所含蒸煮相同糖（醇）的酶，因而蒸煮糖（醇）的能力各不相同。其产生 的新陈代谢产物亦不相同，例如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的产生可以利用指示 剂去认定。在酿制培养基时预先重新加入溟甲酚紫［phs.2（黄色）一6.8（紫色）]，当 蒸煮产酸时，可以并使培养基由紫色变成黄色。气体产生可以由蒸煮管中倒转的杜氏小管 中存有无气泡去证明。 （3）甲基红（methylred）试验（该试验简称mr试验） 很多细菌，例如大肠杆菌等水解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被水解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，并使培养基的ph减少至4.2以下，这时若提甲基白指示剂呈现出红色。因 甲基白指示剂变色范围就是ph4.4（红色）一ph6.2（黄色）。若某些细菌例如产气杆菌，水解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱梭，转化成醇等物，则培养基的ph仍在6.2 以上，故此时重新加入甲基白指示剂，呈现出黄色。（4）大分子物质新陈代谢实验．靛 基质（口引睬）试验 某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质（叫睬），靛基质与 对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。 硫化氢试验 某些细菌能分解含硫的氨基酸（肌氨酸、半肌氨酸等），产生硫化氢，硫化氢与培养 基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。 明胶液化实验 某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，是为阳性。淀 粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不做） 细菌对大分子的淀粉无法轻易利用，须依靠产生的胞外酶（淀粉酶）将淀粉水解为小 分子糊精或进一步水解为葡萄糖（或麦芽糖），再被细菌稀释利用，细菌水解淀粉的过程 可以通过底物的变化去证明，即为用碘测量不再产生蓝色。 （5）有机酸盐及氨盐利用试验柠檬酸盐利用试验
细菌的生理生化试验
实验九细菌的生理生化试验 实验九细菌的生理生化试验 1 目的 1.1 了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理 1.2 掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法 2 原理 各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，这种差异就表现的更加明显。不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不相同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系统。即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。 3 材料 3.1 菌种 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面菌种 3.2 培养基 葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）3.3 试剂 40％NaOH溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示剂。 3.4 器具 超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。 4 流程 糖发酵试验→V-P试验→甲基红试验→吲哚试验 5 步骤 (一) 糖类发酵试验 1 目的 了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法． 2 原理 可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。 3 材料 3.2菌种 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）的斜面菌种 3.３培养基 葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管 ４流程 发酵液试管→标记→接种→培养→观察→记录 5 步骤 5.1 试管标记图9-1 糖发酵产气 取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管各Ａ不产气；Ｂ产气
细菌的生化实验
细菌的生化实验 各种细菌具有各自独特的酶系统,因而对底物的分解能力不同,其代谢产物也不同.用生物化学方法测定这些代谢产物,可用来区别和鉴定细菌的种类.利用生物化学方法来鉴别不同细菌,称为细菌的生物化学试验或称生化反应.生物化学试验的方法很多,这里主要介绍碳水化合物的代谢试验 1．糖(醇、苷)类发酵试验 (1)原理:不同种类细菌含有发酵不同糖(醇、苷)类的酶,因而对各种糖(醇、苷)类的代谢能力也有所不同,即使能分解某种糖(醇、苷)类,其代谢产物可因菌种而异.检查细菌对培养基中所含糖(醇、苷)降解后产酸或产酸产气的能力,可用以鉴定细菌种类. (2)方法:在基础培养基中(如酚红肉汤基础培养基pH7.4)加入0.5~1.0％(w/v)的特定糖(醇、苷)类.所使用的糖(醇、苷)类有很多种,根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等,见表6-4-1.将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中,置35℃孵育箱内孵育数小时到两周(视方法及菌种而定)后,观察结果.若用微量发酵管,或要求培养时间较长时,应注意保持其周围的湿度,以免培养基干燥. (3)结果:能分解糖(醇、苷)产酸的细菌,培养基中的指示剂呈酸性反应(如酚红变为黄色),产气的细菌可在小倒管(Durham小管)中产生气泡,固体培养基则产生裂隙.不分解糖则无变化. (4)应用:糖(醇、苷)类发酵试验,是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验,不同细菌可发酵不同的糖(醇、苷)类,如沙门菌可发酵葡萄糖,但不能发酵乳糖,大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖.即便是两种细菌均可发酵同一种糖类,其发酵结果也不尽相同,如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖,但前者仅产酸,而后者则产酸、产气,故可利用此试验鉴别细菌. 单糖 四碳糖:赤藓糖, 五碳糖:核糖核酮糖木糖阿拉伯糖, 六碳糖:葡萄糖果糖半乳糖甘露糖 双糖 蔗糖(葡萄糖＋果糖) 乳糖(葡萄糖＋半乳糖) 麦芽糖(两分子葡萄糖) 三糖 棉子糖(葡萄糖＋果糖＋半乳糖) 多糖 菊糖(多分子果糖) 淀粉