各类微生物生化实验方式原理
各类微生物生化实验方式原理
通常利用生化实验的方式，检测细菌对各类物质的代谢作用及其代谢产物，称为细菌的生化反映，经常使用于细菌的辨别。
一、糖类分解产物
（1）糖发酵实验（carbohydrate fermentation test）不同种类的细菌对糖的分解利用能力不同，一样以可否分解某种糖，是不是产酸产气等现象来辨别。例如大肠杆菌能分解葡萄糖和乳糖，产酸且产气；而伤寒杆菌只分解葡萄糖产酸不产气，且不分解乳糖。这是因为大肠杆菌分解葡萄糖等产生甲酸，经甲酸解氢酶的作用生成H2和CO2。而伤寒杆菌无此酶，故分解葡萄糖只产酸不产气。
（2）VP实验（Voges-Proskauer test）产气杆菌将分解葡萄糖产生的两分子丙酮酸脱羧，生成一分子乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中氧气氧化，生成二乙酰，二乙酰可与培育液中含胍基的化合物（如蛋白胨中的精氨酸）反映，生成红色的化合物，此为VP实验阳性。大肠杆菌分解葡萄糖不生成乙酰甲基甲醇，故VP实验阴性。
（3）甲基红实验（methyl red test）大肠杆菌和产气杆菌均属G-短杆菌，且都能分解葡萄糖、乳糖产酸产气，二者不易区别。但二者所产生的酸类和总酸量不一：大肠杆菌可产生甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等，而产气杆菌只产生甲酸、乙醇及乙酰甲基甲醇。故大肠杆菌培育液PH在以下，加入甲基红指示剂呈红色，为甲基红实验阳性；产气杆菌培育液PH在以上，加入甲基红后呈桔黄色，为甲基红实验阴性。
（4）枸橼酸盐利用实验(citrate utilization test）产气杆菌在以枸橼酸盐为唯一碳源的培育基上生长，分解枸橼酸盐产生CO2，并转变成碳酸盐，使培育基由中性变成碱性，含溴麝香草酚蓝（BTB）指示剂的培育基由淡绿色变成深兰色，此为枸橼酸盐利用实验阳性。大肠杆菌不能利用枸橼酸盐，故在此培育基上不能生长，培育基仍为绿色。
二、蛋白质及氨基酸的分解产物
（1）硫化氢实验（hydrogen sulfide test）有些细菌能分解培育基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、甲硫氨酸等）产生H2S，如遇醋酸铅或硫酸亚铁，能生成黑色的硫化物，为硫化氢实验阳性。本实验经常使用于区别肠道杆菌的种类。沙门氏菌属一样为阳性;大肠杆菌、产气杆菌、志贺氏菌为阴性。
（2）明胶液化实验（gelatin liguefaction test）有些细菌具有明胶酶，能分解明胶使其失去凝固能力而液化。变形杆菌、霍乱弧菌、绿脓杆菌、枯草杆菌等能液化明胶；大肠杆菌、沙门氏菌那么不能。
（3）吲哚实验（indole test）有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成无色吲哚，加入对-二甲基氨基苯甲醛，无色吲哚生成红色玫瑰吲哚，
为吲哚实验阳性。大肠杆菌、霍乱弧菌等吲哚实验阳性；产气杆菌、伤寒沙门氏菌为吲哚实验阴性。
吲哚对二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚
细菌的生化反映是辨别细菌的重要手腕：其中吲哚实验（I）、甲基红实验（M）、VP实验(V)和枸橼酸盐利用实验（C），简称为IMVIC实验，经常使用于大肠杆菌与产气杆菌的辨别。典型的大肠杆菌的IMViC实验结果为“++--”，而产气杆菌是“--++”。
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实验四、微生物的快速鉴定和自动化分析技术
如何使微生物学技术方式快速、准确、简易和自动化，一直是微生物学工作者研究的热点，尤其是临床医学方面，对微生物的快速准确鉴定，更是"时刻确实是生命"。近20连年来，随着微电子、运算机、分子生物学、物理、化学等先进技术向微生物学的渗透和多学科的交叉，这方面已取得了冲破性进展，许多快速、准确、灵敏、简易、自动化的方式技术，不仅在微生物鉴定中广为利用，而且在微生物学的其它方面也被采纳，推动了微生物学的迅速进展。
一、微量多项实验鉴定系统
该系统的全然原理是依照微生物生理生化特点鉴定的结果，而进行的数码分类鉴定。这种技术也称为简易诊检技术，或数码分类鉴定法。它是针对微生物的生理生化特点，配制各类培育基、反映底物、试剂等，别离微量（约）加入各个分隔室中（或用小圆纸片吸收），冷冻干燥脱水或不干燥脱水，各分隔室在同一塑料条或板上组成检测卡。实验时加入待检测的某一种菌液，培育2~48小时，观看鉴定卡上各项反映，按判定表判定实验结果，用此结果编码，查检索表(依照数码分类鉴定的原理编制成)，取得鉴定结果，或将编码输入运算机，用依照数码分类鉴定原理编制的软件鉴定，打印出结果。
微量多项实验鉴定系统已普遍用于动、植物检疫、临床查验、食物卫生、药品检查、环境监测、发酵操纵、生态研究等方面，尤其是临床查验中深受欢迎，迅猛进展。国际上此技术的产品，或称系统，种类繁多，国内有河南开封医学生物研究所的肠杆菌科细菌鉴定卡E-15；上海市卫生防疫站的发酵性革兰氏阴性杆菌鉴定系统SWF-A；中国人民解放军一八一医院的厌氧菌快速生化鉴定系列ARB-ID；深圳华士达生物科技的肠杆菌科的细菌生化鉴定卡ENT等。国外的产品已标准化、系统化和商品化，要紧有法国生物-梅里埃集团的API/ATB；瑞士罗氏公司的Micro-ID，Enterotube,Minitek；美国的Biolog全自动和手动细菌鉴定系统：日本的微孔滤膜块等，其中API/ATB包括众多的鉴定系统，共计有750种反映，可鉴定几乎所有常见的细菌。微量多项鉴测技术优势突出，不仅能快速、灵敏、准确、重复性好地鉴检微生物，而且简易，节省人力、物力、时刻和空间，缺点是各系统不同较大，有
的价钱贵，有的个别反映不准，难判定，但毫无疑问，它是微生物技术方式向快速、简易和自动化进展的重要方向之一。
API20E系统是API/ATB中最先和最重要的产品，也是国际上应用最多的系统。该系统的鉴定卡是一块有20个分隔室的塑料条，分隔室由相连通的小管和小环组成，各小管中含不同的脱水培育基、试剂，或底物等，每一分隔室可进行一种生化反映，个别的分隔室可进行两种反映，要紧用来鉴定肠杆菌科细菌，如图1所示。
图1 API 20E鉴定卡示用意
鉴定未知细菌的要紧进程：将菌液加入每一个分隔室；培育后，有的分隔室的小杯中需要添加试剂，观看鉴定卡上20个分隔室中的反映变色情形，依照反映判定表（表1），判定各项反映是阳性仍是阴性反映；按鉴定卡上反映项目从左到右的顺序，每三个反映项目编为一组，共编为七组，每组中每一个反映项目定为一个数值，依次是一、二、4，各组中实验结果判定的反映是阳性者记"＋"，那么写下其所定的数值，反映阴性者记"－"，那么写为0，每组中的数值相加，即是该组的编码数，如此便形成了7位数字的编码，表2为举例说明；用7位数字的编码查API20E系统的检索表，或输入运算机检索，那么能将查验的细菌鉴
定出是什么菌种或生物型。
表1 API20E反映判定表
鉴定卡上的反应项目反应结果
代号项目名称阴性阳性
ONPN β-半乳糖苷酶无色黄
ADH 精氨酸水解黄绿红，橘红
LDC 赖氨酸脱羧黄绿红，橘红
ODC 鸟氨酸脱羧黄绿红，橘红
CIT 枸椽酸盐利用黄绿绿蓝
H2
S
表2 API20E举例说明
实验五、抗微生物药物灵敏性实验
一、实验目的
抗微生物药物灵敏性实验（药敏实验）的要紧目的检出细菌的耐药性，预测抗微生物药物的临床医治成效，并为临床医生针对某一特定的临床感染选用药物提供依据。对所有临床分离的可疑致病菌，如不能从该菌的种属特点靠得住地推知其对抗菌药物的灵敏性，就需要进行药敏实验。
纸片扩散法
二、实验原理
此法是临床和实验室标准化研究所（CLSI/NCCLS）所推荐的临床微生物理学室常规开展的药敏实验方式。将含有定量抗菌药物的纸片（药敏纸片）贴在已接种待检菌的琼脂平板表面特定部位。药物借其分子的扩散力向周围琼脂中扩散，形成了随着离纸片距离加大，琼脂中的药物浓度慢慢减少的梯度浓度。其纸片周围必然区域琼脂内的药物浓度高于抑制待检菌所需浓度时，那么该区域内细胞不能生长，形成透明抑制圈。抑菌圈的大小能够反映待检对测定药物的灵敏程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
三、实验器材和试剂
1．菌种金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC2592二、铜绿假单胞菌ATCC27853或临床分离的菌株。
2．培育基MH（Mueller-Hintion）琼脂。
3．试剂无菌生理盐水，麦氏标准比浊管（McFarland
standard，相当于×108CFU/ml），抗菌药物纸片：选用直径吸水量20μl的专用药敏纸片，包括阿米卡星（AMK）、青霉素（PEN）、氨苄西林（AMP）、哌拉西林（PIP）、头孢唑啉（FZN）、头孢呋辛（FRX）、头孢他啶（CAZ）、头孢他啶/棒酸（CD03）、氨曲南（ATM）、亚胺培南（IMP）、环丙沙星（CIP）、万古霉素（VAN）、克林霉素（CLI）、复方新诺明（SXT）。
4．其他无菌棉拭子、镊子、毫米尺、接种环。
四、方式步骤
1．菌液制备
（1）对数生长法：从琼脂平板上选取至少3-5个形态特点一致的菌落，用接种环转移至含4~5ml的肉汤培育管（如胰酶消化大豆肉汤）中，35℃孵育2-6h。用无菌盐水或肉汤调整菌液浊度相当于麦氏标准。
（2）直接菌落法：从孵育18-24h的非选择性培育基（如血琼脂）平板上，挑取单个菌落，直接用肉汤或无菌盐水制成麦氏标准浊度的悬液。
2．接种细菌悬液制备后15min内接种至MH琼脂平板。用无菌棉拭醮取菌悬液，在管内壁液面上方旋转紧压，将多余菌液挤去，最后沿平板内缘涂抹一周。
3．贴药敏纸片
涂布后的平板在室温下干燥3-5min，用纸片分派器或无菌镊子将纸片贴于琼脂表面并轻压，使纸片与琼脂表面完成接触。各纸片中心相距应大于24mm，纸片贴上后就不能再移动位置。
4．孵育
将平板倒置放入35℃孵箱（苛养菌敏平板应放置于5%-10%CO2环境中），16-18h读取结果，葡萄球菌和肠球菌必需孵育24h以检测对苯唑西林和万古霉素的耐药性。
五、结果判定
抑菌圈的直径（包括纸片的直径），以毫米数报告（取整数）。依照CLSI判定标准测量抑菌圈直径大小能够判定细菌对该抗生素是灵敏、中介仍是耐药。
灵敏（S）：表示常规剂量的测定药物在体内所达到的浓度能抑制或杀灭待测菌。
中介（I）：不是灵敏性的气宇，而是一个“缓冲区”，用以避免因微小的技术因素失控致使的结果误差，因此其临床意义是不确信的，故不该作临床报告。
耐药（R）：表示常规剂量的测定药物在体内达到有效浓度时不能抑制待测菌生长。
六、药敏实验结果判定注意事项
（1）药敏实验的结果容易受培育基、抗菌药物、孵育条件等多种因素阻碍，实验室开展药敏实验时应按期用标准菌株对上述因素进行质量操纵。
（2）变形杆菌属的菌株可扩散到某些抗菌药物的抑菌圈内，因此在明显的抑菌圈内有薄膜样爬行生长能够忽略。
（3）关于链球菌应检测生长抑制圈而不是溶血抑制圈。关于甲氧苄啶和磺胺，拮抗物可使细菌轻微生长，因此抑菌圈直径的检测不考虑细微生长的部份（生长菌苔的20%或以下）而测量比较明显的边缘。
（4）关于沙门菌属和志贺菌属的分离株只有氨苄西林、一种喹诺酮类药物和磺胺甲唑/甲氧苄啶可用于常规实验和报告，第一、第二代头孢菌素和氨基糖苷类抗生素体外可能对这些菌株有活性，但临床却无效，因此对上述药物不该报告为灵敏。
（5）沙门菌属的肠道外分离株应测试并报告氯霉素和一种三代头孢菌素的灵敏性。
（6）肠球菌属对头孢菌素类、氨基糖苷类（仅挑选高水平耐药性）、磺胺甲唑/甲氧苄啶和克林霉素在体外可能有活性，但在临床上耐药，因此不能报告对这些药物灵敏。
七、阻碍药敏结果的因素
1.培育基：应依如实验菌的营养需要进行配制。倾注平板时，厚度适合（约5-6mm），不可太薄，一样90mm直径的培育皿，倾注培育基18-20ml为宜。培育基内应尽可能幸免
有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。
2.细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。
3.药物浓度：药物的浓度和总量直接阻碍抑菌实验的结果，需精准配制。商品药应严格依照其推荐医治量配制。
4.培育时刻：一样培育温度和时刻为37℃8-18小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培育基，先置4℃冰箱内2-4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培育，能够推延细菌的生长，而取得较大的抑菌圈。
八、试探题
1.操作药敏实验并说出注意事项。
2.试述药敏实验的意义？
3.如何依照药敏实验的结果选择药物？
4.什么叫抑菌圈？如何依照抑菌圈大小判定细菌对药物的灵敏度？
实验六、微生物的生理生化反映
微生物生理生化反映的多样性在自然界产生了两种结果:第一是使自然界的有机分子都有可能取得分解;第二是使不同微生物之间有了相互作用和相互依托的基础.例如,一种微生物能利用另一种微生物所分解的产物,或一种微生物的产物可抑制或杀死另一种微生物.因此微生物的生理生化反映也被作为细菌鉴定和分类的内容。
一、大分子物质的水解实验
(一)目的要求
1.证明不同微生物对各类有机大分子的水解能力不同,从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2.把握进行微生物大分子水解实验的原理和方式。
(二)大体原理
微生物对大分子的淀粉,蛋白质和脂肪不能直接利用,必需靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用.胞外酶要紧为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖;脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸;蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等.这些进程都可通过观看细菌菌落周围的物质转变来证明:淀粉遇碘液会产生蓝色,但细菌水解淀粉的区域,用碘测定再也不产生蓝色,说明细菌产生淀粉酶.脂肪水解后产生脂肪酸可改变培育基的pH,使pH降低,加入培育基的中性红指示剂会使培育基从淡红色变成深红色,说明胞外存在着脂肪酶。
微生物能够利用各类蛋白质和氨基酸作为氮源外,当缺乏糖类物质时,亦可用它们作为碳源和能源.明胶是由胶原蛋白经水解产生的蛋白质,在25℃以下可维持凝胶状态,以固体形式存
在.而在25℃以上明胶就会液化.有些微生物可产生一种称作明胶酶的胞外酶,水解这种蛋白质,而使明胶液化,乃至在4℃仍能维持液化状态。
还有些微生物能水解牛奶中的蛋白质酪素,酪素的水解可用石蕊牛奶来检测.石蕊培育基由
脱脂牛奶和石蕊组成,是昏浊的蓝色.酪素水解成氨基酸和肽后,培育基就会变得透明.石蕊牛奶也常被用来检测乳糖发酵,因为在酸存在下,石蕊会转变成粉红色,而过量的酸可引发牛奶的固化(凝乳形成).氨基酸的分解会引发碱性反映,使石蕊变成紫色.另外,某些细菌能还原石蕊,使试管底部变成白色。
尿素是由大多数哺乳动物消化蛋白质后被分泌在尿中的废物.尿素酶能分解尿素释放出氨,
这是一个分辨细菌很有效的诊断实验.尽管许多微生物都能够产生尿素酶,但它们利用尿素
的速度比变形杆菌属(Proteus)的细菌要慢,因此尿素酶实验被用来从其他非发酵乳糖的肠道微生物中快速区分那个属的成员.尿素琼脂含有蛋白胨,葡萄糖,尿素和酚红.酚红在时为黄色,而在培育进程中,产生尿素酶的细菌将分解尿素产生氨,使培育基的pH升高,在pH升至时,指示剂就转变成深粉红色。
(三)器材
1.菌种枯草芽胞杆菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),一般变形杆菌。
2.培育基固体油脂培育基,固体淀粉培育基,明胶培育基试管,石蕊牛奶试管,尿素琼脂试管。
3.溶液或试剂革兰氏染色用卢戈氏碘液(Lugol's iodine solution)。
4.仪器或其他用具无菌平板,无菌试管,接种环,接种针,试管架。
(四)操作步骤
l.淀粉水解实验
(1)将固体淀粉培育基溶化后冷却至50℃左右,无菌操作制成平板。
(2)用记号笔在平板底部划成四部份。
(3)将枯草芽孢杆菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌别离在不同的部份划线接种,在平板的反面别离在四部份写上菌名。
(4)将平板倒置在37℃温箱中培育24h。
(5)观看各类细菌的生长情形,将平板打开盖子,滴入少量Lugol's碘液于平皿中,轻轻旋转平板,使碘液均匀铺满整个平板。
如菌苔周围显现无色透明圈,说明淀粉己被水解,为阳性.透明圈的大小可初步判定该菌水解淀粉能力的强弱,即产生胞外淀粉酶活力的高低。
2.油脂水解实验
(1)将溶化的固体油脂培育基冷却至50℃左右时,充分摇荡,使油脂均匀散布.无菌操作倒入平板,待凝。
(2)用记号笔在平板底部划成四部份,别离标上菌名。
(3)将上述四种菌别离用无菌操作划+字接种于平板的相对应部份的中心。
(4)将平板倒置,于37℃温箱中培育24h。
(5)掏出平板,观看菌苔颜色,如显现红色斑点说明脂肪水解,为阳性反映。
3.明胶水解实验
(1)取三支明胶培育基试管,用记号笔标明各管欲接种的菌名。
(2)用接种针别离穿刺接种(见图3—4B)枯草芽抱杆菌,大肠杆菌,金黄色葡萄球菌。
(3)将接种后的试管置20℃中,培育2～5d。
(4)观看明胶液化情形。
4.石蕊牛奶实验
(1)取两支石蕊牛奶培育基试管,用记号笔标明各管欲接种的菌名。
(2)别离接种一般变形杆菌和金黄色葡萄球菌。
(3)将接种后的试管置35℃中,培育24～48h。
(4)观看培育基颜色转变.石蕊在酸性条件下为粉红色,碱性条件下为紫色,而被还原时为白色。
5.尿素实验
(1)取两支尿素培育基斜面试管,用记号笔标明各管欲接种的菌名。
(2)别离接种一般变形杆菌和金黄色葡萄球菌。
(3)将接种后的试管置35℃中,培育24~48h。
(4)观看培育基颜色转变.尿素酶存在时为红色,无尿素酶时应为黄色。
(五)实验报告
1.结果
将结果填入下表,"+"表示阳性,"-"表示阴性
2.试探题
(1)你如何说明淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？
(2)不利用碘液,你如何证明淀粉水解的存在？
(3)接种后的明胶试管能够在35℃培育,在培育后你必需做什么才能证明水解的存在？
(4)说明在石蕊牛奶中的石蕊什么缘故能起到氧化还原指示剂的作用？
(5)什么缘故尿素实验可用于鉴定Proteus细菌？
二、糖发酵实验
(一)目的要求
1.了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用
2.把握通过糖发酵辨别不同微生物的方式
(二)大体原理
糖发酵实验是经常使用的辨别微生物的生化反映,在肠道细菌的鉴定上尤其重要.绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源,可是它们在分解糖类物质的能力上有专门大的不同.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气.例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气;伤寒杆菌分解葡萄糖产酸不产气,不能分解乳糖;一般变形杆菌分解葡萄糖产酸产气,不能分解乳糖.发酵培育基含有蛋白胨,指示剂(溴甲酚紫),倒置的德汉氏小管和不同的糖类.当发酵产酸时,溴甲酚紫指示剂可由紫色变成黄色.气体的产生可由倒置的德汉氏试管中有无气泡来证明..
图.糖发酵实验
A. 培育前的情形;
B. 培育后产酸不产气;
C. 培育后产酸产气
(三)器材
1.菌种大肠杆菌,一般变形杆菌斜面各一支。
2.培育基葡萄糖发酵培育基试管和乳糖发酵培育基试管各3支(内装有倒置的德汉氏小试管)。
3.仪器或其他用具试管架,接种环等。
(四)操作步骤
1.用记号笔在各试管外壁上别离标明发酵培育基名称和所接种的细菌菌名。
2.取葡萄糖发酵培育基试管3支,别离接入大肠杆菌,一般变形杆菌,第三支不接种,作为照.另取乳糖发酵培育基试管3支,一样别离接入大肠杆菌,一般变形杆菌,第三支不接种,作为对照。在接种后,轻缓摇动试管,使其均匀,避免倒置的小管进入气泡。
3.将接种过和作为对照的6支试管均置37℃培育24~48h。
4.观看各试管颜色转变及德汉氏小管中有无气泡。
（五）实验报告
1.结果
将结果填入下表."+"表示产酸或产气,"-"表示不产酸或不产气
2.试探题
假设某种微生物能够有氧代谢葡萄糖,发酵实验应该显现什么结果？
三、IMViC与硫化氢实验
(一)目的要求
了解IMViC与硫化氢反映的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方式
(二)大体原理
IMViC是吲哚(indol test),甲基红(methy1 red test),伏一普(Voges-Prokauer test)和柠檬酸盐(citrate test)四个实验的缩写,I是在英文中为了发音方便而加上的.这四个实验主若是用来快速辨别大肠杆菌和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes),多用于水的细菌学检查.大肠杆菌虽非致病菌,但在饮用水中假设超过必然数量,那么表示受粪便污染.产气肠杆菌也普遍存在于自然界中,因此检查水时要将二者分开，
硫化氢实验也是检查肠道杆菌的生化实验
吲哚实验是用来检测吲哚的产生.有些细菌能产生色氨酸酶,分解蛋白胨中的色氨酸产生吲
哚和丙酮酸.吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合,形成红色的玫瑰吲哚.但并非所有微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力,因此吲哚实验能够作为一个生物化学检测的指标。
大肠杆菌吲哚反映阳性,产气肠杆菌为阴性。
甲基红实验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸,如甲酸,乙酸,乳酸等.当细菌代谢糖产生酸时,培育基就会变酸,使加入培育基的甲基红指示剂由橘黄色变成红色,即甲基红反映.尽管所有的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸,但那个实验在区分大肠杆菌和产气肠杆菌上仍然
是有价值的.这两个细菌在培育的初期均产生有机酸,但大肠杆菌在培育后期仍能维持酸性pH4,而产气肠杆菌那么转化有机酸为非酸性结尾产物,如乙醇,丙酮酸等,使pH升至大约6.因此大肠杆菌为阳性反映,产气肠杆菌为阴性反映。
伏-普实验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性结尾产物的能力,如丙酮酸.丙酮酸进行缩合,脱羧生成乙酰甲基甲醇,此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰.二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用,生成红色化合物,即伏-普反映阳性;不产生红色化合物者为阴性反映.有时为了使反映更为明显,可加入少量含胍基的化合物,如肌酸等。
柠檬酸盐实验是用来检测柠檬酸盐是不是被利用.有些细菌能够利用柠檬酸钠作为碳源,如产气肠杆菌;而另一些细菌那么不能利用柠檬酸盐,如大肠杆菌.细菌在分解柠檬酸盐及培育基中的磷酸铵后,产生碱性化合物,使培育基的pH升高,当加入1%溴麝香草酚蓝指示剂时,培育基就会由绿色变成深蓝色.溴麝香草酚蓝的指示范围为:pH小于时呈黄色,pH在~时为绿色,pH大于时呈蓝色.
硫化氢试验是检测硫化氢的产生,也是用于肠道细菌检查的常用生化试验.有些细菌能分解含硫的有机物,如胱氨酸,半胱氨酸,甲硫氨酸等产生硫化氢,硫化氢一遇培养基中的铅盐或铁盐等,就形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。
以半胱氨酸为例,其化学反映进程如下:
CH2SHCHNH2COOH+H2O→CH3COCOOH+H2S↑+NH3↑
H2S+Pb(CH3COO)2→PbS↓+2CH3COOH
(黑色)
大肠杆菌为阴性,产气肠杆菌为阳性。
(三)器材
l.菌种大肠杆菌,产气肠杆菌。
2.培育基蛋白胨水培育基,葡萄糖蛋白胨水培育基,柠檬酸盐斜面培育基,醋酸铅培育基。
在配制柠檬酸盐斜面培育基时,其pH不要偏高,以浅绿色为宜,吲哚实验顶用的蛋白胨水培育基中宜选用色氨酸含量高的蛋白胨,如用胰蛋白酶水解酪素取得的蛋白胨较好。
3.溶液或试剂甲基红指示剂,40%KOH,5%α-萘酚,乙醚,吲哚试剂等。
(四)操作步骤
l.接种与培育
(1)用接种针将大肠杆菌,产气肠杆菌别离穿刺接入2支醋酸铅培育基中(硫化氢实验),置37℃培育48h。
(2)将上述二菌别离接种于2支蛋白胨水培育基(吲哚实验),2支葡萄糖蛋白胨水培育基(甲基红实验和伏-普实验),2支柠檬酸盐斜面培育基和2支醋酸铅培育基中,置37℃培育2d。
2.结果观看
(1)硫化氢实验培育48h后观看黑色硫化铅的产生。
(2)吲哚实验
于培育2d后的蛋白陈水培育基内加3~4滴乙醚,摇动数次,静置1~3min,待乙醚上升后,沿试管壁缓缓加入2滴吲哚试剂,在乙醚和培育物之间产生红色环状物为阳性反映。
配制蛋白胨水培育基,所用的蛋白胨最好用含色氨酸高的,如用胰蛋白酶水解酪素取得的蛋白胨中色氨酸含量较高。
(3)甲基红实验
培育2d后,将l支葡萄糖蛋白胨水培育物内加入甲基红试剂2滴,培育基变成红色者为阳性,变黄色者为阴性。
注意甲基红试剂不要加得太多,以避免显现假阳性反映。
(4)伏-普实验
培育2d后,将另1支葡萄糖蛋白胨水培育物内加入5~10滴40%KOH,然后加入等量的5%α-萘酚溶液,使劲振荡,再放入37℃温箱中保温15~30min,以加速反映速度.假设培育物呈红色者,为伏-普反映阳性。
(5)柠檬酸盐实验
培育48h后观看柠檬酸盐叙面培育基上有无细菌生长和是不是变色，蓝色为阳性,绿色为阴性。
（五）实验报告
1.结果
将实验结果填入下表."+"表示阳性反映,"-"表示阴性反映.
二、试探题
(1)讨论IMViC实验在医学查验上的意义.
(2)说明在细菌培育中吲哚检测的化学原理,什么缘故在那个实验顶用吲哚的存在作为色氨酸活性的指示剂,而不用丙酮酸？
(3)什么缘故大肠杆菌是甲基红反映阳性,而产气肠杆菌为阴性？那个实验与伏一普实验最初底物与最终产物有何异同处？什么缘故会显现不同？
(4)说明在硫化氢实验中,醋酸铅的作用,能够用哪一种化合物代替醋酸铅？
微生物生理生化反应
微生物生理生化反应
实验原理 通过测定微生物细胞内某些酶类的有无、对某些底物的利用能力、代谢产物的类型等来研究微生物代谢的多样性。某些细菌产生色氨酸酶，能分解培养基蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚，当吲哚遇到含有对二甲基氨基苯甲醛试剂，形成红色的玫瑰红吲哚，为吲哚反应阳性。V-P反应也称乙酰甲基甲醇试验。微生物发酵葡萄糖产生丙酮酸，2分子丙酮酸脱羧形成乙酰乳酸，继续脱羧形成乙酰甲基甲醇，后者在碱性条件下与胍类、肌酸类物质反应，形成红色化合物，为V-P反应阳性。有些细菌发酵糖类产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使发酵液的pH下降到4.2以下，当加入甲基红试剂后，使发酵液变红色。某种微生物能以某种糖类为碳源，产酸产气，则判断为发酵这种糖。 实验材料和方法： 材料： 培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖和蔗糖）、酚红半固体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基； 菌种：大肠杆菌（E. coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus arueus）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）、变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）； 试剂：V-P试剂、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲酚紫指示剂、抗生素； 仪器及用具：酒精灯、接种环、超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温水浴锅、试管、移液管、滴管、杜氏小管、记号笔等。 实验方法： 1.V-P反应 取5只装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管，以无菌操作分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形均、枯草芽孢杆菌菌液0.1mL至上述相应试管的培养基中，空白对照不接种。置于37℃恒温箱中培养48小时。取出培养物，分别从中取出2.5mL培养液，再加入等量V-P试剂，充分震荡后放置在37℃培养箱中温育30min。若培养液呈红色，记录为V-P试验阳性反应；无色者为V-P试验阴性反应；粉红色者为弱阳性。 2.甲基红试验 分别从V-P实验中的培养物中取出2.5mL培养液，分别加入2～3滴甲基红指示剂，立即观察培养液颜色变化。若培养液变成红色，即为阳性反应，橘色或黄色为阴性反应，橘红色为弱阳性。 3.吲哚试验 取5只装有蛋白胨水培养基的试管，以无菌操作分别接种大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形均、枯草芽孢杆菌菌液0.1mL至上述相应试管的培养基中，空白对照不接种。置于37℃恒温箱中培养48小时。在通风橱中向培养基中加入乙醚1～2mL，振荡使吲哚尽量被完全萃取至乙醚中，沿管壁缓慢加入5～10滴吲哚试剂，加入后不能摇动。若乙醚层呈现玫瑰红色，即为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。 4.糖发酵试验 取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管个4支，内装有倒置杜氏小管，杜氏小管内
微生物的生理生化反应
实验六微生物的生理生化反应 一、实验目的 掌握细菌鉴定中主要生理生化反应的常规实验法。 二、实验原理 由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。具体个原理如下： 1、淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种两种细菌（1—枯草杆菌，5—大肠杆菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。 2、明胶水解试验：穿刺接种于明胶培养基中的细菌，若能产生明胶酶利用明胶，则该培养基在4摄氏度条件下会处于液体状态，从而区别于正常条件下4摄氏度时固态的明胶培养基。 3、糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 4、IMVC实验包括四个试验，主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌，多用于水环境的细胞血检查。 ①吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。本次不做该试验。 ②甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙算和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。 ③柠檬酸盐利用试验：有些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一的碳源，而有些细菌则不能利用。由于细菌不断地利用柠檬酸盐并生成碳酸盐，使培养基PH由中性变为碱性，培养基中的指示剂有浅绿色变为蓝色。 ④伏-普试验（乙酰甲基甲醇试验 VP）：某些细菌在代谢过程中，能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸在羧化酶的催化下脱羧后形成活性乙醛，后者与丙酮酸缩合，脱羧形成乙酰甲基甲醇，或者乙醛化合生成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下被空气中的氧气氧化成二乙酰，二乙酰与培养基中含有胍基的化合物起作用生成红色化合物，即为VP试验阳性。 三、材料和器皿 ⑴ 菌种：1号—枯草杆菌，5号—大肠杆菌，7号—产气杆菌； ⑵培养基：淀粉培养基平板（1个），明胶培养基（2个），葡萄糖培养基（2个），葡萄糖蛋白胨水培基（4个），柠檬酸盐培养基斜面（2个）； ⑶试剂：卢氏碘液，溴甲酚紫指示剂，甲基红指示剂，溴麝香草酚兰指示剂，氢氧化钾，α—萘酚。 四、实验步骤
各种微生物生化试验方法原理
各种微生物生化试验方法原理 通常利用生化试验的方法，检测细菌对各种物质的代谢作用及其代谢产物，称为细菌的生化反应，常用于细菌的鉴别。 1、糖类分解产物 （1）糖发酵试验（carbohydrate fermentation test）不同种类的细菌对糖的分解利用能力不同，一般以能否分解某种糖，是否产酸产气等现象来鉴别。例如大肠杆菌能分解葡萄糖和乳糖，产酸且产气；而伤寒杆菌只分解葡萄糖产酸不产气，且不分解乳糖。这是因为大肠杆菌分解葡萄糖等产生甲酸，经甲酸解氢酶的作用生成H2和CO2。而伤寒杆菌无此酶，故分解葡萄糖只产酸不产气。 （2）VP试验（V oges-Proskauer test）产气杆菌将分解葡萄糖产生的两分子丙酮酸脱羧，生成一分子乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中氧气氧化，生成二乙酰，二乙酰可与培养液中含胍基的化合物（如蛋白胨中的精氨酸）反应，生成红色的化合物，此为VP试验阳性。大肠杆菌分解葡萄糖不生成乙酰甲基甲醇，故VP试验阴性。 （3）甲基红试验（methyl red test）大肠杆菌和产气杆菌均属G-短杆菌，且都能分解葡萄糖、乳糖产酸产气，二者不易区别。但两者所产生的酸类和总酸量不一：大肠杆菌可产生甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等，而产气杆菌只产生甲酸、乙醇及乙酰甲基甲醇。故大肠杆菌培养液PH在4.5以下，加入甲基红指示剂呈红色，为甲基红试验阳性；产气杆菌培养液PH在5.4以上，加入甲基红后呈桔黄色，为甲基红试验阴性。 （4）枸橼酸盐利用试验(citrate utilization test）产气杆菌在以枸橼酸盐为唯一碳源的培养基上生长，分解枸橼酸盐产生CO2，并转变为碳酸盐，使培养基由中性变为碱性，含溴麝香草酚蓝（BTB）指示剂的培养基由淡绿色变为深兰色，此为枸橼酸盐利用试验阳性。大肠杆菌不能利用枸橼酸盐，故在此培养基上不能生长，培养基仍为绿色。 2、蛋白质及氨基酸的分解产物 （1）硫化氢试验（hydrogen sulfide test）有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、甲硫氨酸等）产生H2S，如遇醋酸铅或硫酸亚铁，能生成黑色的硫化物，为硫化氢试验阳性。本试验常用于区别肠道杆菌的种类。沙门氏菌属通常为阳性;大肠杆菌、产气杆菌、志贺氏菌为阴性。 （2）明胶液化试验（gelatin liguefaction test）有些细菌具有明胶酶，能分解明胶使其失去凝固能力而液化。变形杆菌、霍乱弧菌、绿脓杆菌、枯草杆菌等能液化明胶；大肠杆菌、沙门氏菌则不能。 （3）吲哚试验（indole test）有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成无色吲哚，加入对-二甲基氨基苯甲醛，无色吲哚生成红色玫瑰吲哚， 为吲哚试验阳性。大肠杆菌、霍乱弧菌等吲哚试验阳性；产气杆菌、伤寒沙门氏菌为吲哚试验阴性。 吲哚对二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚 细菌的生化反应是鉴别细菌的重要手段：其中吲哚试验（I）、甲基红试验（M）、VP试验(V)和枸橼酸盐利用试验（C），简称为IMVIC试验，常用于大肠杆菌与产气杆菌的鉴别。典型的大肠杆菌的IMViC试验结果为“++--”，而产气杆菌是“--++”。 0票票数
微生物生理生化实验
【实验题目】 微生物生理生化实验 【实验目的】 1.了解生理生化的意义。 2.掌握几种常用生理生化的实验方法。 【实验器材】 1、菌种： 枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，铜绿假单胞菌，变形杆菌，产气肠杆菌 2、试剂： 卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水等 3、仪器和用具： 酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管等 4、培养基 淀粉培养基、油脂培养基（大分子物质水解实验） 葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基（内附倒置的德汉氏小管）（糖发酵实验） 蛋白胨水培养基（吲哚实验） 葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红培养基） 【实验原理】 在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程。具有酶功能的蛋白质多数在细胞内，称为胞内酶。许多细菌产生胞外酶，这些酶从细胞中释放出来，以促进细胞外的化学反应。各种微生物在代谢类型上表现出很大的差异，如表现在对大分子糖类和蛋白质的分解能力以及分解代谢的最终产物的不同，反映出他们具有不同的酶系和不同的生理特性，这些特性可被用作为细菌鉴定和分类的内容。具体实验原理如下： 一、大分子物质的水解实验原理 1、淀粉水解 由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，所以必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内。如淀粉酶将淀粉水解为小分子的糊精,双糖和单糖，能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉。已知淀粉遇到碘会显现蓝色，因此可通过在淀粉培养基上滴加碘液来判断微生物是否能产生淀粉酶分解淀粉，菌落周围不呈蓝色，出现无色透明
微生物实验原理
大肠埃希菌检测 胆盐乳糖培养基：通过胆盐或者去氧胆酸钠抑制革兰氏阳性菌；选择利用乳糖为碳源的革兰氏阴性菌； 溴甲酚紫 可以用作乳酸乳球菌的培养基制备时的指示剂，其pH变色范围5.2(黄色)～6.8(紫色)； 胆酸盐 MUG 培养基试验 亚硫酸钠和去氧胆酸钠为选择性抑菌剂；菌的葡萄糖醛酸苷酶在碱性条件下，作用于4－甲基伞形酮－β－D葡萄糖醛酸苷的β糖醛酸苷键，使其水解，释放的4－甲基伞形酮在366nm紫外灯下产生蓝白色荧光。97%的大肠埃希氏杆菌、10%的沙门氏菌以及少量的志贺氏菌具有葡萄糖醛酸苷酶。 靛基质试验 某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚，当加入吲哚试剂（对位二甲氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚。(变形杆菌和霍乱弧菌亦可以产生靛基质阳性) 色氨酸酶 催化色氨酸厌氧分解产生吲哚和丙酮酸和氨的反应的酶。在微生物中特别是大肠杆菌有大量存在，以磷酸吡哆醛为辅酶，对半胱氨酸和丝氨酸也有一定作用。在动物体内无此酶。 伊红美蓝培养基 伊红为酸性染料，美蓝为碱性染料，两种苯胺类染料，可以抑制革兰氏阳性菌的生长。当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽。而产气杆菌则形成呈棕色的大菌落。 在碱性环境中不分解乳糖产酸的细菌不着色，伊红和美蓝不能结合，故沙门氏菌等为无色或琥珀色半透明菌落。金葡菌在此培养基上不生长。 麦康凯琼脂培养基 利用胆盐来抑制革兰阳性细菌的生长，而对伤寒等沙门菌有促进生长的作用．利用乳糖发酵，中性红的颜色可把分解乳糖和不分解乳糖的细菌区别开．沙门菌及志贺菌呈无色菌落，大肠埃希菌呈桃红色菌落． 沙门氏菌检测 生化特性 发酵葡萄糖，麦芽糖，甘露醇和山梨醇产气；不发酵乳糖、蔗糖和侧金盏花醇；不产吲哚、V-P反应阴性；不水解尿素和对苯丙氨酸不脱氨。伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌及一部分鸡白痢沙门氏菌发酵糖不产气，大多数鸡白痢沙门氏菌不
细菌鉴定中常用的生理生化反应
细菌鉴定中常用的生理生化反应 细菌鉴定中常用的生理生化反应1、实验原理 （1）细菌生化试验 各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物 或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢 作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。（2）糖（醇）类发 酵试验 不同的细菌含有能发酵不同糖（醇）的酶，因此发酵糖（醇）的能力不同。其代谢产 物也不同。例如，有些产生酸和气体，有些产生酸但不产生气体。酸的生成可通过指示剂 来确定。在制备培养基2（黄色）-6.8（紫色）]时预先加入甲酚紫[PHS]，当发酵产生酸时，培养基可从紫色变为黄色。气体的产生可以通过发酵管中倒置的杜氏管中是否存在气 泡来证明。 （3）甲基红（methylred）试验（该试验简称mr试验） 许多细菌，如大肠杆菌，分解葡萄糖生成丙酮酸，然后分解生成甲酸、乙酸、乳酸等，将培养基的pH值降低到4.2以下。此时，如果添加甲基红，指示器将显示红色。因为甲 基红指示剂的变色范围为pH4（红色）-ph6 2（黄色）。如果某些细菌，如产气菌，分解 葡萄糖生成丙酮酸，但迅速解吸丙酮酸并将其转化为酒精，培养基的pH值仍高于6.2。因此，此时添加甲基红指示剂以显示黄色。（4）大分子代谢的实验。靛蓝基质（口服吸收）试验 某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质（叫睬），靛基质与 对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。 硫化氢试验 某些细菌能分解含硫的氨基酸（肌氨酸、半肌氨酸等），产生硫化氢，硫化氢与培养 基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。 明胶液化实验 某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，是为阳性。淀 粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不做） 细菌不能直接利用大分子淀粉。它们必须依靠产生的胞外酶（淀粉酶）将淀粉水解成 小分子糊精或进一步水解成葡萄糖（或麦芽糖），然后被细菌吸收和利用。细菌水解淀粉 的过程可以通过底物的变化来证明，即碘的测定不再产生蓝色。 （5）有机酸盐及氨盐利用试验柠檬酸盐利用试验
生物技术微生物学实验讲义
实验一革兰氏染色实验 一、目的要求 1、学习并初步掌握革兰氏染色法 2、了解革兰氏染色的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、基本原理 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。 三、器材 1、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。 2、其他：革兰氏染色液，载玻片，显微镜、盖玻片、吸水纸，接种针。 四、操作步骤 1. 涂片将培养24小时的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2. 染色 （1）初染加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 （2）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 （3）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒钟，立即用水冲净酒精。 （4）复染用番红液染1—2分钟，水洗。 （5）镜检干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。 （6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合制片，作革兰氏染色对比。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，常呈阴性反应。
微生物检测原理
1、胆盐乳糖培养基原理 蛋白胨为氮源、乳糖为碳源，胆酸盐为抑制剂（抑制革兰氏阳性细菌），溴甲酚紫指示剂（变黄则细菌产酸）该培养基为选择性培养基，选择性生长利用乳糖为碳源的革兰氏阴性菌，根据是否产酸产气判断样品是否为大肠菌群。 2、玫瑰红纳培养基原理 胨提供碳氮源，葡萄糖提供能源，磷酸二氢钾提供缓冲剂，硫酸镁提供微量元素，玫瑰红纳未选择抑菌剂，可抑制细菌的生长，并可减缓莫些霉菌生长过而导致菌落蔓延生长通常黑曲霉为孢子黑色白色念珠菌为奶油色 3、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基原理 酵母浸出粉提供B族维生素能促进酵母生长 4、靛基质实验原理 莫些细菌可能分解蛋白质中的色氨酸生成吲哚，吲哚的存在可用显色表现，吲哚对对二甲基氨基苯醛结合成玫瑰吲哚 5、乙酰甲基甲醇生成实验(v-p) 莫些细菌分解葡萄糖生成丙酮酸，丙酮酸缩合脱羧生成乙酰甲基甲酸，乙酰甲基甲酸可在强碱条件下被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的瓜基生成红色化合物 6、枸橼酸盐利用实验原理 不同的细菌有不同的酶，分解产物各有差异，以枸橼酸纳为唯一碳源于Ph为7的培养基上，产气杆菌分解枸橼酸生成碳酸盐，是培养基由中性变为碱性培养基中指示剂溴麝香草酚蓝（ptb)有浅绿色变为深蓝色，此为枸橼酸利用实验阳性，大肠杆菌因不能利用为阴性 7、曙红亚甲基蓝琼脂平板实验原理 蛋白胨和牛肉浸粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；氯化钠能维持均衡的渗透压；乳糖是大肠菌群可发酵的糖类；琼脂是培养基凝固剂；曙红钠和亚甲蓝是抑菌剂和pH指示剂，可抑制革兰氏阳性菌，在酸性条件下产生沉淀，形成紫黑色菌落或具黑色中心的外围无色透明的菌落 MUG培养基在大肠杆菌中检测的原理 8、一种基于荧光方法检测大肠杆菌的ＭＵＧ培养基，其主要组分和含量（重量份）为：ＭＵＧ０．０３０－０．１，乳糖３－１０，ｐＨ值为７．０－７．５。由于本发明在培养基中加入胆盐，可抑制部分革兰氏阳性细菌的生长，有利于大肠杆菌的生长。在培养基中加入乳糖，同时考察培养液产气和产荧光两个因素，大大减少假阳性，提高检测准确性。 微生物限度检查法 附录ⅪJ 微生物限度检查法 微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检 查方法，包括染菌量及控制菌的检查。 供试品应随机抽样。一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。 检查的全过程，均应严格遵守无菌操作，严防再污染。 除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25 ～28℃，控制菌培养温度为36℃±1℃。 检验结果的报告以1g、1ml或10cm<2>为单位。 培养基及其制备方法 除另有规定外，培养基制备的灭菌条件为121℃20分钟。
微生物常用生化实验
微生物常用生化实验 胆汁-七叶苷试验 原理：培养基中的胆汁对某些细菌有抑制作用，只有既能在胆汁中生长，又能水解七叶苷的细菌才能表现出对七叶苷的水解活性。肠球菌和D群链球菌都能在含有胆汁的培养基中生长并水解七叶苷，生成七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸铁的Fe3+反应形成黑色沉淀，使培养基变黑。 65g/L NaCl生长试验 原理：肠球菌具有很强的耐盐能力，能在上述培养基生长，并且分解培养基中的葡萄糖产酸，使指示剂溴甲酚紫变黄。而链球菌的耐盐能力较弱，在此培养基不能生长。 原理：培养基中葡萄糖和乳糖的比例为1︰10，指示剂为酚红，酚红变色范围在pH6.4~8.2（黄~红），而KIA的pH为7.4，产少量的酸就可导致颜色改变。斜面部分为有氧环境，底层与空气隔绝是相对厌氧的环境。如接种的是能发酵葡萄糖和乳糖的细菌，因产生大量的酸，使斜面与底层均成黄色。如接种的是只发酵葡萄糖不发酵乳糖的细菌，培养基内仅有0.1%葡萄糖可产酸。开始的8~12h时，产生的酸足以引起斜面和底层的颜色变黄。在接下来的时间里，葡萄糖被完全消耗，斜面部分所生成的酸可因接触空气而氧化挥发，细菌在有氧的条件下开始分解蛋白质，氧化降解氨基酸，产生碱性化合物，18~24h整个斜面又转换成碱性颜色—红色。底层（相对缺氧状态），细菌发酵葡萄糖所生成的酸类物质不被氧化而氨基酸降解产生的碱性化合物不足以中和形成的酸，所以培养基仍为黄色。细菌如分解蛋白质产生硫化氢，则与培养基中枸橼酸铁形成黑色的硫化铁。细菌产气时，在底层还可看到有气泡或裂口现象。 苯丙氨酸脱氨酶试验 培养基：苯丙氨酸微量液体培养基 2）原理：细菌分解氨基酸可通过脱氨或脱羧基生成反应物。某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基生成苯丙酮酸，与10%三氯化铁试剂产生深绿色反应。 3）方法：待检菌用接种针以无菌操作接种于上述培养基中，35 ℃培养18~24h，滴加入10%三氯化铁试剂3-4滴。 4）结果：立即（延长时间颜色会退去）观察结果，出现绿色环者为阳性，阴性为黄色。5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。在肠杆菌科细菌中变形杆菌属、普罗维登斯菌属、摩根菌属均为阳性，其它肠杆菌科细菌为阴性 氨基酸脱羧酶试验 原理：细菌凭借其特异脱羧酶作用于相应氨基酸的羧基，以产生胺类物质和二氧化碳的反应过程。脱羧作用的结果使pH移向碱侧，使指示剂溴甲酚紫变紫。脱羧的过程是在厌氧环境进行的，故接种完后培养基需封液体石蜡。 3）方法：待检菌用接种针以无菌操作接种于氨基酸脱羧酶和氨基酸对照培养基中，并加入无菌液体石蜡数滴于35 ℃培养18~24h，观察结果。 【结果】对照管应呈黄色，测定管呈紫色为阳性；对照管呈黄色，测定管也呈黄色为阴性。若对照管呈紫色则试验无意义，不能作出判断。 【应用】主要用于肠杆菌科细菌的鉴定
微生物理化性质实验
微生物理化性质实验 生命学院生科四班 张行润 200900140177 摘要 通过不同菌种的代谢方式和产物的不同，在一定的培养基下，对照实验，以简单方便的观察出不同鉴定菌种之间的差异。比如铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌可以分解使用淀粉，而金黄色葡萄球菌和大肠杆菌却是不行。乳糖发酵实验中，大肠杆菌产气产酸，但是普通变形杆菌却无法产酸产气。通过与对照组的对照，我们便可以轻松区分，以达到鉴定区别菌种的目的。 关键词 糖酵解（glycolysis）大分子水解吲哚试验甲基红试验 前言 用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。 不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝。这些都可以作为鉴定菌种的指标性特征。 一、实验材料 1.1.菌种： 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）大肠杆菌（Escherichia coli）铜绿假单胞杆菌（P.Aeruginosa）金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）普通变形杆菌（P. vulgaris）产气肠杆菌（Enterobacter amnigenus）等。 1.2.试剂及药品： 卢戈式碘液、溴甲酚紫指示剂、甲基红指示剂、吲哚试剂、蛋白胨、牛肉膏、NaCl、1.6%花生油中性红水溶液、琼脂、蒸馏水、可溶性淀粉、1.6%溴甲酚紫乙
细菌鉴定中常用的生理生化反应
细菌鉴定中常用的生理生化反应 1、实验原理 （1）细菌生化试验 各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。 （2）糖（醇）类发酵试验 不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来判定。在配制培养基时预先加入溟甲酚紫［P HS . 2 （黄色）一6 . 8 （紫色）] ，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。 （3）甲基红（Methylred ）试验（该试验简称MR 试验） 很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH 降低到4 . 2 以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。因甲基红指示剂变色范围是pH4 . 4 （红色）一pH6 . 2 （黄色）。若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱梭，转化成醇等物，则培养基的pH 仍在6 . 2 以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。 （4）大分子物质代谢实验． 靛基质（口引睬）试验 某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质（叫睬），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。 硫化氢试验 某些细菌能分解含硫的氨基酸（肌氨酸、半肌氨酸等），产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。 明胶液化实验 某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，是为阳性。淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不做） 细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶（淀粉酶）将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖（或麦芽糖），再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。 （5）有机酸盐及氨盐利用试验 柠檬酸盐利用试验
微生物生化鉴定
常用生化试验 一．糖、醇发酵试验 1.糖、醇发酵试验 原理：各种细菌因含有发酵不同糖、醇的酶，所以分解糖、醇的能力个不相同。有的能分解某些糖、醇类，有的则不能分解。有的分解某些糖、醇类发酵产酸产气，有的仅产酸，而不产气。根据这些特点，可鉴别细菌。 培养基：糖发酵试验应用的培养基种类很多，大致可分为液体，半固体，固体（高层、斜面）等几类。可根据试验的要求和细菌的特性来选择。 2.乙酰甲基甲醇试验（V-P试验） 原理：某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，并将丙酮酸脱羧，变为乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境下，被空气中的氧氧化成二乙酰，二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色的化合物。故在培养基中加入少量含胍基的化合物，如肌酸、肌酐可增加胍基含量。试验中加入的α-萘酚为催化剂，可加速此反应，使反应颜色增加，提高反应的敏感性。大肠埃希菌不能将丙酮酸脱羧，故V-P试验呈阴性。 培养基：磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基 3.甲基红试验（MR试验） 原理：许多细菌如大肠埃希菌等，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再次被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，这样使培养基的PH降至4.5以下。这时加入甲基红指示剂呈红色。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醛、气体和水等），则培养基的酸度仍在PH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性反应。 培养基：磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基 MUG葡萄糖醛酸苷酶试验 原理：细菌的葡萄糖醛酸苷酶在碱性条件下，作用于4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖醛酸甘（4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide简称MUG）的β葡萄糖醛酸甘键，使其水解，释放的4-甲基伞形酮在366nm紫外灯下产生蓝白色荧光。 培养基：MUG培养基 4.β-半乳糖苷酶试验 原理：肠杆菌科细菌发酵乳糖，依靠半乳糖苷渗透酶和β-半乳糖苷酶两种不同的酶作用，能水解邻硝酸酚-β-D半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG），而释放出黄色
实验十 微生物鉴定中常用的生理生化试验
实验十微生物鉴定中常用的生理生化试验 摘要 本次实验包括大分子水解试验、糖发酵试验和IMViC试验（吲哚、甲基红试验）三类试验，根据要求本实验使用六种培养基分别对所需菌种组合进行了大约24h的培养，之后按照实验要求进行各个试验。最后观察到了实验现象，了解了所用菌种鉴别的方法和原则。 关键词 微生物鉴定；生理生化试验；大分子水解试验；糖发酵试验；IMViC试验 前言 类的微生物有着不同的代谢类型，例如对一些物质的分解能力及分解代谢的产物的不同反映出他们不同的生理特征，这些特征可以用来对不同种类微生物进行鉴定和分类。因此可以对微生物的不同生化反应进行试验，以此证明微生物生理特征的多样性，证明微生物分类鉴别的依据。生理生化试验相比其他鉴别方法而言相对简便、快捷、经济实用，在一般的实验室中都可以进行，因此在微生物种类的初步鉴别中被广泛使用。 一、实验目的 1、大分子水解试验 证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统，掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 2、糖发酵试验 了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中的重要作用，掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 3、IMViC试验 了解IMViC的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。 二、实验原理 在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢。代谢过程主要是酶促反应过程。具有酶功能的蛋白质多数在细胞内，称为胞内酶（endoenzymes）.许多细菌产生胞外酶(exoenzymes)，这些酶从细胞中释放出来，以催化细胞外的化学反应。各种微生物具有不同的酶系统，所以它们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。具体的原理如下： 1、大分子水解试验： 微生物对大分子如淀粉、蛋白质和油脂不能直接利用，必须依靠产生的胞外
细菌鉴定中常用的理化生化反应
实验日期：2017.11.1 实验班级：生物技术指导教师：张建丽 姓名：高熹学号：1120152430 细菌鉴定中常用的理化生化反应 一、实验目的 1)了解细菌生理生化反应原理 2)通过细菌对不同含碳、氮化合物的分解利用情况了解细菌碳、氮代谢类型的多样性。 3)了解细菌在培养基中生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。 二、实验原理 1）糖（醇）类发酵实验 因细菌所含的酶不同，其发酵糖（醇）后的代谢产物亦不相同，即可产酸产气，或产酸不产气。酸的产生可利用培养基中溴甲酚紫的颜色变化进行判断（pH5.2黄色—6.8紫色），即当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体产生可由发酵管内倒置的杜氏小管中有无气泡来判断。 2）甲基红（Methyl red）实验（MR实验） 大肠杆菌等许多细菌分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸可进一步分解成甲酸（或乙酸\乳酸）,使培养基的pH降低到4.2以下,此时加入甲基红指示剂，呈现红色。 产气杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸,培养基的pH在6.2以上, 故此时加入甲基红指示剂,呈现黄色。 3）伏-普(Voges-Proskauer)氏实验(V.P.实验) 4）靛基质(吲哚)实验 大肠杆菌等能分解蛋白质中的色氨酸,产生靛基质(吲哚),靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合形成玫瑰色靛基质(红色化合物)。 5）硫化氢实验
某些细菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸\半胱氨酸等),产生硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐,形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁.为硫化氢实验。 6）明胶液化实验 某些细菌具有胶原酶,使明胶被分解,失去凝固能力,呈现液体状态,为明胶实验阳性。 7）淀粉水解实验 细菌不能直接利用淀粉,须经淀粉酶将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖(或麦芽糖)后被细菌吸收利用,细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明,即加碘液测定时，不再产生蓝色。 8）柠檬酸盐利用实验 产气杆菌等能以柠檬酸钠为碳源进行生长。其分解柠檬酸盐后产生碳酸盐, 培养基呈碱性.使培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为蓝色.不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌,在该培养基上不生长,培养基不变色. 三、实验试剂及器材 实验仪器和用具：恒温培养箱、试管、无菌平皿、杜氏小管、接种环,酒精灯； 微生物材料：大肠杆菌,变形杆菌,枯草杆菌,产气杆菌斜面； 试剂：甲基红试剂、V.P试剂、吲哚试剂格里斯试剂（A、B）、卢戈氏碘液； 培养基： 葡萄糖和乳糖发酵培养基（糖类发酵实验） 葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红和V.P.实验） 胰蛋白水培养基（吲哚实验） 柠檬酸铁铵或醋酸铅的半固体培养基（硫化氢实验） 明胶培养基（明胶液化实验） 淀粉培养基（淀粉水解实验） 柠檬酸钠斜面培养基（柠檬酸盐利用实验） 硝酸盐培养基（硝酸盐利用实验）。 四、实验步骤 1）糖（醇）类发酵实验 1. 编号：在试管上标明培养基名称,所接种的菌名和组号. 2. 接种：取 3 支葡萄糖发酵培养基, 1 支接种大肠杆菌，1 支接种变形杆菌, 留1 支不接种，作为对照. 3. 乳糖发酵试验接种方法同葡萄糖发酵试验。将已接种好的培养基置37℃培养箱中培养24h. 4. 结果观察:若细菌能发酵培养基中的糖，可使培养基的pH 降低, 培养基中的指示剂呈酸性反应(为黄色),若发酵糖产酸产气,不仅培养基呈黄色,且在倒置的小玻璃管(杜氏小管)中有气体（气体占杜氏小管的10%以上）；若被测细菌不分解培养基中的糖,则培养基不发生变化。 2）甲基红实验（MR 实验） 1. 取3 支葡萄糖蛋白胨水培养基，标记同上。
做微生物实验实验的原理
做微生物实验实验的原理 微生物实验是指通过实验操作来观察和研究微生物的生理、生化、遗传、代谢、生长等特性及其与环境、其他生物的相互作用关系。微生物实验的原理主要包括微生物的生物学特性、实验目的与方法、实验材料与设备、实验步骤和数据处理与分析等。 一、微生物的生物学特性： 微生物是一类生活在自然界和人类生活环境中的微小生物体，包括细菌、真菌、病毒、藻类等。微生物具有以下生物学特性： 1. 生长迅速：微生物的生命周期短，生长速度快。 2. 免疫性：微生物对外界环境变化有一定的适应能力。 3. 代谢多样性：微生物能够分解有机物和无机物，产生能量和各种代谢产物。 4. 适应性强：微生物对环境的要求较低，可以在各种环境中生存。 5. 遗传变异：微生物具有较高的突变率和遗传多样性。 二、实验目的与方法： 微生物实验的目的是为了研究微生物的特性和功能，包括研究微生物的代谢途径、生长规律、耐受性、致病性等。常用的微生物实验方法包括： 1. 培养方法：通过培养基和培养条件提供合适的环境，使微生物能够生长和繁殖。 2. 分离方法：将微生物从样品中分离出来，得到纯培养物，方便后续的观察和实验操作。
3. 鉴定方法：通过形态学、生理生化特性、分子生物学等方法鉴定微生物的种类和特征。 4. 抗生素敏感性试验：通过对不同抗生素对微生物生长的抑制作用来判断微生物的抗药性和耐药性。 5. 恒温培养和野外监测：通过控制培养条件和在自然环境中观测微生物的生长和演化。 三、实验材料与设备： 微生物实验所需的材料包括培养基、培养物、试剂、抗生素等。常用的实验设备包括培养箱、显微镜、冷冻离心机等。 四、实验步骤： 微生物实验的步骤主要包括：准备实验材料和设备、制备培养基和培养物、分离和纯化菌株、培养微生物、观察和记录实验结果。 五、数据处理与分析： 微生物实验的数据处理和分析主要包括统计分析、图像分析和文献对比等。通过对实验结果进行分析，可以得出微生物特性、生长规律等方面的结论，为后续的研究工作提供有价值的数据。 总结： 微生物实验的原理包括微生物的生物学特性、实验目的与方法、实验材料与设备、
生理生化试验
微生物鉴定中常用生理生化试验 一、实验目的 1.证明不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不 同的酶系统。 2.掌握微生物大分子物质水解实验的原理和方法。 3.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 4.了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用 二、实验原理 由于各种微生物具有不同的酶系统，所以它们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。具体的原理如下： 1.淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种四种细菌（枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、铜绿假单胞菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。 2.糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 3.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。 （1）吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。 （2）甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。 三、实验材料 1.菌种 大肠杆菌（Escherichia coli），铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa）， 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis Cohn），产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，普通变形杆菌（Proteus.vulgaris) 2.培养基 固体油脂培养基，固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），乳糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基。 3.溶液和试剂 革兰氏染色用卢戈氏碘液，甲基红指示剂，乙醚和吲哚试剂，无菌水。 4.仪器和其他用品 平板，试管，接种环，试管架，电子天平，称量纸，玻璃棒，三角瓶，烧杯，药匙，标签纸，酒精灯，滴管。 四、实验步骤 1.制备培养基 制备固体淀粉培养基，固体油脂培养基，葡萄糖发酵培养基，乳糖培养基（内装有倒置
微生物的生理生化反应实验原理及步骤
实验六微生物的生理生化反应 实验目的： 1．证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 2．了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 3．了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。 实验原理： 微生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实：淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变为深红色，说明胞外存在着脂肪酶。 微生物可以利用各种蛋白质和氨基酸作为氮源外，当缺乏糖类物质时，亦可用它们作为碳源和能源。明胶是由胶原蛋白经水解产生的蛋白质，在25℃以下可维持凝胶状态，以固体形式存在。而在25℃以上明胶就会液化。有些微生物可产生一种称作明胶酶的胞外酶，水解这种蛋白质，而使明胶液化，甚至在4℃仍能保持液化状态。 还有些微生物能水解牛奶中的蛋白质酪素，酪素的水解可用石蕊牛奶来检测。石蕊培养基由脱脂牛奶和石蕊组成，是昏浊的蓝色。酪素水解成氨基酸和肽后，培养基就会变得透明。石蕊牛奶也常被用来检测乳糖发酵，因为在酸存在下，石蕊会转变为粉红色，而过量的酸可引起牛奶的固化(凝乳形成)。氨基酸的分解
微生物鉴定之生化实验大全
〔一〕碳水化合物代谢实验 糖〔醇、苷〕类发酵实验 （1)原理：细菌分解糖的能力与该菌是否含有分解某种糖的酶密切相关，故分解糖的能力各不相同，细菌分解糖类后的终产物亦不一致，在含糖培养基中加入指示剂，假设细菌分解糖则产酸或产酸产气，使培养基颜色改变，从而判断细菌是否分解某种糖或其他碳水化合物。（2)基本培养基：在培养基中加入0.5%-1%的糖类〔单糖、双糖、或者多糖〕、醇类〔甘露醇、肌醇〕苷类〔水杨苷、菊糖等).培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。 （3)实验方法：取某一种细菌的24h纯培养物分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖等培养基内，37℃培养24h，观察结果并记录。 （4)结果判定：如果接种进去的细菌可以发酵某种糖或醇，则可产酸，使培养基由紫色变成黄色，如果不发酵，则仍保持紫色。如发酵的同时又产生气体，则在微量发酵管顶部积有气泡。 （5)应用：是鉴定细菌最主要最基本的实验，特别是对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。 氧化型与发酵型〔O/F)的测定 （1）原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必需有氧的参加，称为氧化型〔O〕，细菌在分解葡萄糖过程中可以进行无氧降解的，称为发酵
型(F)。发酵型细菌无论在有氧无氧的环境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的细菌称为产碱型(-)。这在区别微球菌与葡萄球菌、肠杆菌科成员中尤其有意义。 （2）培养基：培养基蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，葡萄糖10g，琼脂3g，1%溴麝香草酚蓝3mL，蒸馏水1000mL。将蛋白胨、盐、琼脂和水混合，加热溶解，校正PH至7.2，然后加葡萄糖和指示剂，加热溶解，分装试管，3-4mL/管；115℃，高压蒸汽灭菌20min，取出冷却成琼脂柱。 （3）试验方法：挑取18-24h的幼龄斜面培养物，穿刺接种，每种细菌接种两管，于其中一管覆盖1mL液体石蜡，37℃培养24h或更长时间。 （4）结果判定： 〔5〕应用：O/F试验主要适用于G-肠道杆菌的鉴别。肠杆菌科的细菌为发酵型，其他肠道菌为非发酵型，非发酵型细菌为氧化型或产碱型。该试验也用于鉴别葡萄球菌〔F〕和微球菌〔O〕。