4、微生物保藏及基本操作技术
微生物保藏的名词解释
微生物保藏的名词解释微生物保藏是指将微生物种类、品种、菌株等贮藏在特定的条件下，以便进行长期保存和研究的一种方法。
随着科学技术的不断发展，微生物保藏在生物学、农业、医学等领域发挥着重要作用。
本文将主要就微生物保藏的定义、目的、方法以及其在各个领域的应用进行详细解释。
一、微生物保藏的定义微生物保藏指的是将不同类型的微生物在特定的媒体或载体上进行培养和保存的过程。
微生物包括各种细菌、真菌、病毒、藻类等微小的生物体。
通过保藏这些微生物，科学家能够长期保存并进行研究，为科学研究和应用提供基础。
二、微生物保藏的目的1. 科学研究：微生物保藏使得科学家能够获得各类微生物菌株，用于进行病原体识别、生物学机理研究、新药开发等领域的研究。
这些微生物资源对于解析生物学问题、推动疾病诊断和治疗的进展都具有重要意义。
2. 保护物种：微生物保藏有助于保护生物多样性中的微生物物种，避免因为知识和技术的流失而导致物种灭绝。
3. 实用应用：微生物保藏提供了用于产业发展和农业、环境管理等领域的微生物资源。
如利用保藏的微生物菌株进行发酵工业、环境修复、食品加工等过程。
三、微生物保藏的方法1. 冷冻保存：将微生物分离出来后，培养并将菌株保存在低温(-70℃～-196℃)下，通常使用液氮保存。
冷冻保存是一种简单且常用的方法，可以长期保藏微生物。
2. 乾燥保存：将微生物培养物蒸发至干燥状态，并放置在干燥的容器中，摄氏4℃存放。
这种方法适合于真菌和细菌的保存，可以长时间保存。
3. 冻干保存：首先将微生物培养物冷冻，然后通过低温下的真空干燥，使得水分蒸发。
最后将干燥的微生物保存在低温下。
这种方法适用于一些要求较高的微生物，有助于提高保存的成功率。
四、微生物保藏在各个领域的应用1. 农业领域：微生物保藏在农业领域有广泛的应用。
科学家能够通过保藏微生物资源，研究和利用微生物对作物的生长和产量的影响。
此外，通过保藏微生物菌株，也可以研究和应用有益微生物来增进作物的生长和抵抗病害能力。
微生物菌种保藏方法及关键技术
目录
01 一、微生物菌种保藏 方法
02
二、微生物菌种保藏 关键技术
03
三、应用实践及注意 问题
04 四、结论
05 参考内容
微生物菌种是生物科学领域中的重要资源，它们具有广泛的工业和医学应用价 值。然而，微生物菌种的保存和保藏是一项充满挑战性的任务，因为微生物细 胞的生命周期短暂，且对环境条件极为敏感。为了更好地利用和保护这些珍贵 的资源，本次演示将详细介绍微生物菌种保藏方法及关键技术。
2、需要根据菌种的特性和应用需求，选择合适的培养基和培养条件，以保证 菌种的活性和稳定性。
3、在使用液氮保藏方法时，需要注意液氮的纯度和保存容器的密封性等问题， 以免影响菌种的存活率和保藏效果。
4、在菌种保藏过程中，需要注意防止杂菌污染和交叉感染等问题，以保证菌 种的纯度和质量。
5、需要注意菌种的定期检测和维护，及时发现并处理衰退和失活的菌种，以 保持菌种种群的健康和稳定。
三、应用实践及注意问题
在实际应用中，不同微生物菌种的保藏方法具有各自的优势和适用范围。一般 来说，对于一些常见的微生物种类，如细菌、酵母和霉菌等，冷冻保藏和液氮 保藏是常用的保藏方法。在实际操作中，需要根据具体情况选择合适的保藏方 法和操作条件。此外，还需要注意以下问题：
1、在菌种保藏过程中，需要注意菌种的来源和背景信息的记录和整理，以便 更好地了解菌种的特性和进行相应的管理。
2、种子管理
种子管理是微生物菌种保藏的关键环节之一。良好的种子管理包括对菌种的纯 度、质量、稳定性和活性的监控和维护。在菌种保藏过程中，需要定期对菌种 进行纯度检测，确保菌种的纯度和质量。同时，需要根据菌种的生长特性和环 境条件，制定相应的管理措施，包括培养基的选择、培养温度和湿度的控制等， 以维持菌种的稳定性和活性。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。
菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。
(一)常规保藏方法1 目的1.1 了解菌种保藏的基本原理1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。
2 原理菌种保藏的方法很多。
其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。
使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。
依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。
一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。
3 材料3.1菌株待保藏的适龄菌株斜面3.2培养基肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。
3.3 试剂10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。
3.4 器具用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l 毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。
4 流程斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏5 步骤5.1斜面保藏5.1.1流程标记试管→接种→培养→保藏5.1.2步骤5.1.2.1贴标签取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。
在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。
在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.1.2.2斜面接种将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。
5.1.2.3培养置37恒温箱中培养48小时。
5.1.2.4保藏斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。
这种方法一船可保藏三个月至半年。
5.2半固体穿刺保藏5.2.1流程标记试管→穿刺接种→培养→保藏5.2.2 步骤5.2.2.1贴标签取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.2.2.2穿刺接种用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。
snt26322010微生物菌株常规保藏技术规程
snt26322010微生物菌株常规保藏技术规程一、引言微生物菌株的保藏是微生物研究中十分重要的一环，对于维持菌株的活力和纯度，保证研究和应用的可靠性具有重要意义。
本文将介绍一套微生物菌株常规保藏技术规程，以供研究人员参考和实施。
二、常用的微生物保存技术目前常见的微生物保藏技术主要包括冷冻保存法、冻干法、液氮冷冻保存法等。
下面将对各个保存技术进行详细介绍。
1.冷冻保存法冷冻保存法是目前最常用的微生物保藏技术之一。
该方法通过将微生物菌株在培养基中培养至适当生长阶段后，添加适量的甘油或乳糖等保护剂，然后迅速降温至-80°C或-196°C，使生物体内活性蛋白质等分子稳定，并避免细胞内形成冰晶破坏细胞结构。
保存期间，尽量避免频繁地退冰和冷冻，以免影响菌株的存活率和质量。
菌株保存时间可长达十年以上。
2.冻干法冻干法是常用的微生物保藏技术之一。
该方法通过将微生物菌株在培养基中培养至适当生长阶段后，通过负压冻干机将培养基中的水分逐渐蒸发，最终将细胞完全冻干，然后将冻干物以药瓶或其他密封容器保存于-20°C或-80°C冰箱中。
冻干法能够较好地保留菌株的活力和稳定性，保存期限可长达数年。
3.液氮冷冻保存法液氮冷冻保存法是用液态氮进行冷冻保存的一种技术。
菌株培养后，直接将其放入液态氮中进行保存。
该方法具有保存期限长、保存质量好的优点，适用于保藏时间较长的菌株。
保存期限可以长达数十年以上。
三、微生物菌株常规保藏步骤下面将介绍微生物菌株常规保藏的具体步骤。
1.菌种培养首先，选择需要保藏的菌株，进行预培养。
将菌株接种到适当的培养基上，在恒温摇床等有效装置上进行培养。
培养时间根据菌株的生长速度和特性而定。
2.准备保护剂在培养基成熟后，准备保护剂。
常用的保护剂有甘油和乳糖。
根据菌株的特点和需求，选择适合的保护剂。
3.菌株混合将保护剂与菌株悬浮液混合，并搅拌均匀，以确保保护剂能够充分包裹菌株。
微生物培养及实验基本操作技术
微生物培养及实验基本操作技术一、培养基配制培养基是指人工配制的、适合于微生物生长繁殖或累积代谢产物所需的各种营养物的混合基质。
配制培养基是进行微生物检验工作的基础,甚至是任何与微生物有关工作的基础。
注意事項–灭菌锅的使用①加水盖过底部铁板—②放入东西—③关门—④調整溫度時間—⑤关紧泄压阀灭菌結束後，等压力降回零時才可打開門進入灭菌锅之物品，蓋子不可關太緊或太鬆拿滅菌後物品請記得帶耐熱手套培养基中的主要成分及其作用：营养物质：N源、C源、无机盐、生长因子、水常用的N源：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏常用的C源：糖、醇类物质（单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖；多糖：淀粉、纤维素、菊糖；醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油）水：用蒸馏水，不能用自来水凝固剂：琼脂、明胶、血清等抑制剂：1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率2、种类：盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素指示剂1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。
2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等。
培养基的类型：●根据培养基的物理状态来区分：1、液体培养基：主要用于增菌培养、鉴别性培养2、固体培养基：用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定3、半固体培养基：观察微生物的动力，有时用来保藏菌种4、脱水(商品)培荞基：脱水培养基也称为商品培养基、预制干燥培养基。
●将各种营养成分按比例配制完全,制成脱水的干粉状,装瓶出售;使用时只需按比例加人定量的水溶化、灭菌便可。
●根据培养基的用途来区分：➢增殖培养基选择培养基鉴别培养基1、增殖培养基：在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。
微生物菌种常规保藏技术规程
微生物菌种常规保藏技术规程一、前言微生物菌种的保藏是微生物研究中非常重要的一环，它对于保障菌种的长期保存和研究使用具有重要的意义。
本技术规程旨在规范微生物菌种的常规保藏技术，确保其安全、稳定和可持续使用。
二、常规保藏技术1. 冻干法（Lyophilization）：将培养的微生物菌株悬液在前冷冻过程中给予低温、高真空条件，使其中的水分直接从冰态升华为气态，从而避免了常规冻存法中由于结冰时水晶体的生成对菌体的危害，从而达到保存微生物菌株的目的。
操作步骤：a. 微生物培养物经适当稀释后应当倒入试管中，滴入约1ml 20%乳糖溶液在表面形成一层薄膜，待乳糖凝固后，在加入4ml 0.5-0.7%匀浆的2%干燥乳铁粉液，将试管摇匀，再灌入16ml混合液保持无气泡，放置于冰浴上。
b. 待培养物温度达到0摄氏度，再清洗喷雾器，灌入76％露醇20ml，培养物放入冷板上，适当时间后将试管封口放入冷板上经杀菌后真空泵连接，把真空泵打开，通过真空泵提供的条件慢慢降低压强，一般12小时后真空泵关闭。
c. 提供适当温度下作干燥处理，通常使用倍耐安减压干燥器空干40-80小时，干燥后的干燥灸试管，将试管放入吸气瓶中后置入-40—-50摄氏度低温冷冻管内低温保存(一般保存温度为—40摄氏度或更低)，备用空干矿温度—20摄氏度或更低。
2. 酶解冻存法（Enzymatic freezing）：在培养基中添加蔗糖，结合酶解冻存方法，经冻干后的菌种耐冻性和储存时间明显提高。
操作步骤：a. 将微生物分别接种于琼脂平板上，预培养24小时，取2-3份储备品。
菌液于冻干菊花瓶中进行前冷冻，真空抽气消耗20分钟。
b. 平均地用EP管管接受，采用3次“起冻—冷冻”的方法完全冻干，最后0.1至0.3ml真菌液在5摄氏下冷冻6小时，然后在5摄氏下还原18小时。
c. 移除冻存，延长试验保存时间。
必须在-80摄氏下保存。
3. 液氮冻存法（Liquid nitrogen freezing）：液氮冷冻法是现在应用最广泛的冷冻保存方法，在液氮的作用下，微生物菌种在-196摄氏度下冷冻，保持良好的生物活性。
规程–Ⅳ微生物细菌菌种保藏库管理规程
规程–Ⅳ微生物（细菌）菌种保藏库管理规程中国检验检疫微生物菌种保藏管理中心前言微生物菌种资源是自然科学资源的重要组成部分，是生物多样性的重要体现。
本规程是依据我单位的特点，现有的工作基础和实际需要制定的。
制定本规程是为了实现微生物菌种资源保藏管理程序的规范化、标准化，以有效的收藏微生物菌种资源，更好的为检验检疫、科研培训等服务。
本规程制定了4°C菌种库、低温库管理的基本原则，菌种的出入库流程及菌种库的日常管理。
规程起草单位：中国检验检疫微生物菌种保藏管理中心规程起草人：赵贵明、王娉、杨海荣、陈颖、赵勇胜版本：2014-07目录前言--------------------------------------------------------------------第 1 页1 范围------------------------------------------------------------------第 3 页2 规范性引用文件--------------------------------------------------------第3 页3 术语和定义------------------------------------------------------------第 3 页4 菌种保藏库管理的基本原则----------------------------------------------第 4 页5 菌种库的建设----------------------------------------------------------第 4 页6 菌种保藏库的日常管理--------------------------------------------------第 5 页附录A （资料性附录）菌种入库单、出库三联单------------------------------第7 页微生物（细菌）菌种保藏库管理规程1范围本规程规定了菌种保藏库管理的基本原则，菌种的出入库流程及种库的日常管理。
生物安全实验室病原微生物菌(毒)种和生物样本的保存(保藏)
生物安全实验室病原微生物菌（毒）种和生物样本的保存（保藏）实验室进行实验活动时，经常需要保存病原微生物菌（毒）种及样本。
无论是短期还是长期保存，都应遵循安全、存活、生物学特性不变以及避免差错等原则。
一、保藏管理《条例》规定：“国务院卫生主管部门或者兽医主管部门指定的病原微生物菌（毒）种保藏中心或者专业实验室（以下称保藏机构），承担集中储存病原微生物菌（毒）种和样本的任务。
”保藏机构应当依照国务院卫生主管部门或者兽医主管部门的规定，储存实验室送交的病原微生物菌（毒）种和样本，并向实验室提供病原微生物菌（毒）种和样本。
《传染病防治法实施办法》规定："一、二类病原微生物菌（毒）种的供应由国务院卫生行政部门指定的保藏管理单位供应。
三类菌（毒）种由设有专业实验室的单位或者国务院卫生行政部门指定的保藏管理单位供应。
”2009年7月16日，卫生部颁布了《人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法》（原卫生部令第68号），《办法》规定保藏机构是指由原卫生部指定的，按照规定接收、检定、集中储存与管理病原微生物菌（毒）种或样本，并能向合法从事病原微生物实验活动的单位提供病原微生物菌（毒）种或样本的非营利性机构。
病原微生物菌（毒）种保藏机构应具有符合要求的生物安全实验室，包括既符合生物安全要求，又能够保证所保藏病原微生物菌（毒）种质量的设施、设备、技术操作人员和规章制度。
《浙江省病原微生物实验室生物安全管理办法（试行）》规定实验室设立单位应建立病原微生物菌（毒）种和样本保藏保管制度，落实安全责任部门和专人进行管理。
有关机构按照规定从事临床诊疗、疾病控制、检验检疫、教学和科研等工作，在确保安全的基础上，可以保管其工作中经常使用的病原微生物菌（毒）种或样本，其保管的病原微生物菌（毒）种或样本名单应当报当地卫生主管部门备案。
重点落实对高致病性病原微生物菌（毒）种和样本的安全保卫措施，加强安全管理与控制，设立专库专柜，单独储存，做好病原微生物菌（毒）种和样本进出和储存的记录，建立档案制度。
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国认外可的菌种收藏机构
世界菌种保藏联合会WFCC (World Federation Of Culture Collection)全球注册的菌种保藏机构583家
ATCC美国 NRRL DSMZ德国 NCTC CMI CBS NBRC(IFO) JCM日本
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菌株代数
美国药典（USP）中规定：“将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一次 即称为一代，”并规定“菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代”。 United States Pharmacopoeia (USP) provides that: "to microbial inoculation to a fresh medium on / in each germination time is referred to as a generation," and provides that "strains of the passages (from the original strain from freeze-dried powder) must not exceed 5 generation. “
普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）, 中国科学院微生物研究所 农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）,中国农科院区划所 工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），中国食品发酵工业研究院 医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC），中国药品生物制品鉴定所 抗菌素菌种保藏管理中心（CACC），中国医科院医用生物技术研究所 兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC），农业部兽医药品监察所 林业微生物菌种保藏管理中心（CFCC），中国林业科学院
使菌液完全冻结；
可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置－20℃冻30 分钟，再放入－80℃冰箱冻30min；
采用离心式冻干装置时勿需预冻。
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熔封
将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈； 将安瓿管装到多歧管上，用火焰在细颈处熔封； 拉管时注意火焰不要离菌体太近。
是在藻酸钙颗粒或其他基质中进行的。含有藻酸钠的菌悬浮液 加入氯化钙后会形成藻酸钙固定化细胞，细胞一旦固定化，便可采取 传统的冻干保藏方法进行保藏。这种固定化技术已经被应用在真菌中， 并延伸至线虫和藻类。
Mycelium radiating from an alginate bead on an agar plate. © M.Ryan / Mycologist 15: 66-69
安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状 真空度接近空载时的最高值 样品温度与管外温度接近 选用 1 ～ 2 支对照管，其水份与菌悬液同量，当其水分完全蒸发时视为 干燥完结
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预冻
制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过1h；
分装完成后将安瓿管立刻放入－35～－40℃冰箱预冻1h，
保藏菌株要求
药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内
或国外菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标
准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。
2010版中国药典《药品微生物实验室规范指导原则》
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国内认可的菌种收藏机构
1979年7月，全国第一届菌种保藏管理会议正式成立中国菌种 保藏管理委员会（CCCCM），委员会下设7个全国性菌种保藏 管理中心及机构所在地：
保藏原理 低温(4℃) 低温(4℃)、阻断氧气 干燥、低温、无氧、保护
保藏时间 3～6 月 1～2 年
保藏设备 冰箱 冰箱 －80℃冰箱、真空冷冻干燥
菌种活性 易退化 退化
保藏成本 高 较高
操作性 简单 比较简单
真空冷冻干燥法 剂 －80℃冰箱冻结法 低温(－80℃)、保护剂 超低温(－150℃或－196 液氮超低温冻结法 ℃)、保护剂
被应用在一些锈菌种的保藏过程中。
Teliospores : Puccinia spp。
Source: /~pi/enpp/p athology/images/dayl.
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菌种保藏技术进展
包埋固定化技术
微生物保藏及基本操作技术
中国工业微生物菌种保藏管理中心 CICC 姚粟 博士
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微生物菌种保藏
菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料，是 发展生物工程的重要基础条件之一，是国家的重 要生物资源。 菌种保藏管理要求各保藏中心必须具有保藏菌种 的详细历史及有关实验资料。并对其所负责保藏 的菌种均应采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌 种的污染或死亡。
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液氮超低温冻结法
保藏时间长；
保藏效果好，菌种不易退化； 对设备要求高(程控降温仪、液氮罐)，对人员操作水平 要求高； 保藏成本高。
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不同保藏方法的比较
保藏方法 定期移植法 液体石蜡法
安瓿管的准备
清洗
选用中性玻璃材质的安瓿管； 2%盐酸浸泡8～10h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗2～3次； 置于烘箱中烘干。 打棉塞，160℃定型2h；
棉塞
标签
激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约10×20mm。 喷码于安瓿管外，160℃固定20min。
灭菌
121 ℃，30min.
《中国微生物菌种保藏管理条例》
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微生物菌种保藏
制订专门菌种保藏管理制度； 同一株菌种采用两种以上保藏方法保存；
对只能采用一种保藏方法的菌株备份存放于两个以上的保
藏设备中；
对菌种的入库和出库记录入档，实行双人负责制管理； 设专人负责管理菌种保藏设施正常运行，定期检修维护。
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操作步骤
冷冻管准备 保护剂制备 保藏培养物准备 预冻
同“－80℃冰箱冻结法”
— 将程序降温系统预冷到4℃，将制备好的冷冻管放入其中，以1℃/min降温 速率降至-35℃； — 使用程序降温盒。
保藏
将预冻后的冷冻管转移至液氮气相(-150℃)或液相(-196℃)。
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接 种
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定期移植法
操作简单，使用方便； 对设备和人员要求不高； 可随时使用，便于观察菌种； 工作劳动强度大，属短期保藏，保藏成本高； 菌种传代频繁，易退化、污染。
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8～10 年 机、封管设备 2～5 年 －80℃冰箱 程控降温仪、 10 年以上 液氮运输罐及液氮罐
退化
低
复杂
退化
较低
复杂
不易退化
高
复杂
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菌种保藏技术进展
程序降温控制技术
冷冻速度慢：细 胞内水分外渗多， 细胞脱水，体积 收缩。 冷度速度快：细 胞内水分没有足 够时间外渗，细 胞内结冰。
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微生物菌种保藏
微生物菌种保藏方法
基本原理是在挑选优良纯培养物并使其处于休
眠状态基础上，人为地创造一个有利于休眠的 环境，使其长期保存后仍能保持菌种原有的优 良特性。
基本措施是低温、真空、干燥。
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冷冻速度非常快： 细胞内冰晶非常 小或称玻璃化状 态。
冻结速度对菌种细胞的影响
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菌种保藏技术进展
原位低温保藏技术
有些菌种不可培养，也无法采用标准的冷冻干燥技术保藏，如一 些致病菌、无法培养的菌种或者与其他微生物共生的菌种（如菌 根真菌）等。这些菌种可采用原位低温保藏技术，这一技术已经
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保护剂的准备
保护剂：12%脱脂牛奶蒸馏水溶液，2～5ml/管； 灭菌锅加热至沸腾，将牛奶管放入锅中，113℃灭菌 20min； 打开放气阀缓慢排出蒸汽，取出灭菌后脱脂牛奶试管，迅 速放入凉水中冷却；
30℃培养2天，无菌检查合格后备用。
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真空度检测
用高频电火花检查各安瓿管的真空情况，如管内呈现灰蓝 光，说明真空度符合要求。
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真空冷冻干燥法
保藏、运输方便；
保藏时间长(5 ～10年)； 对设备要求高(真空冷冻干燥机、多歧管)，对人员操 作水平要求高； 冷冻干燥过程对菌体有损伤，需恢复培养。
液体石蜡法
操作简单，使用比较方便；
对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求；·
菌种易退化、污染。
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真空冷冻干燥法
指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经 预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存 后保存的一种长期菌种保存方法。