Jagged1基因敲除小鼠血管内皮发育异常

交通医学２００６年第２０卷第６期ＭｅｄＪｏｆＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００６，Ｖｏｌ．２０．Ｎｏ．６血管是胎生动物胚胎发育中最早形成的器官，鼠胚从第７．５天血岛开始形成到第１１天完成原始血管系统［１－２］。

许多关键因子信号途径影响和控制着血管发育的早期过程，如ＶＥＧＦ、ＴＧＦ２β、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、Ｔｉｅ、Ｅｐｈ－Ｅｐｈｒｉｎ、Ｎｏｔｃｈ信号途径等［３，４］。

Ｎｏｔｃｈ信号途径由Ｎｏｔｃｈ受体、配体和下游效应物组成。

Ｎｏｔｃｈ是一个高度保守的细胞间信号机制，对哺乳动物胚胎发育十分重要，Ｎｏｔｃｈ信号的异常可引起严重的血管发育异常。

人类Ｎｏｔｃｈ配体Ｊａｇｇｅｄ１突变可引起阿拉日耶综合征。

Ｊａｇｇｅｄ１基因敲除小鼠死于胚胎１０．５天，表现为血管发育异常和广泛出血，血管重塑严重缺陷［５］。

本实验利用Ｊａｇｇｅｄ１基因敲除小鼠为模型，进一步研究Ｊａｇｇｅｄ１基因敲除小鼠胚胎血管发育异常和血管重塑严重缺陷的细胞生物学基础。

１材料与方法１．１动物与试剂实验动物Ｊａｇｇｅｄ１基因敲除小鼠５７ＢＬ／６Ｊ＊１２９Ｓ１／ＳｖＩｍＪ遗传背景（南京大学模式动物研究中心提供）。

动物均在ＳＰＦ动物房饲养，温度在２２±３℃，１２小时明暗交替，饲料用６０Ｃｏ照射。

ＤＭＥＭ培养基，胎牛血清（ＧＩＢＣＯ公司）；ＤｙｎａｂｅａｄｓＢｉｏｔｉｎＢｉｎｄｅｒ，ＤｙｎａｌＭＰＣ－Ｓ（Ｄｙｎａｌｂｉｏｔｅｃｈ公司）；Ｂｉｏｔｉｎ－ＣｏｎｊｕｇａｔｅｄＲａｔＡｎｔｉ－ＭｏｕｓｅＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ－１），ＲａｔＴａｉｌＣｏｌｌａｇｅｎＴｙｐｅＩ（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ公司）；Ｍｅｄｉｕｍ１３１，ＭＶＧＳ（ＭｉｃｒｏｖａｓｃμｌａｒＧｒｏｗｔｈＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ），ＡＦ（ＡｔｔａｃｈｍｅｎｔＦａｃｔｏｒ）（ｃａｓｃａｄｅｂｉｏ公司）；胰蛋白酶，Ｉ型胶元酶（Ｓｉｇｍａ公司）。

１．２模型的获得将杂合子Ｊａｇｇｅｄ１基因敲除小鼠于第１天下午５点合笼（１雄×２雌），第２天早上８＊［基金项目］江苏省高校自然科学研究计划项目（０３ＫＪＢ１０８１１１）。

＊＊［作者简介］顾星星，男，生于１９６４年１１月，汉族，江苏海门人，博士，副教授。

研究方向：发育生物学，神经生物学。

Ｊａｇｇｅｄ１基因敲除小鼠血管内皮发育异常＊顾星星＊＊陶慧（南通大学江苏省神经再生重点实验室，江苏２２６００ｌ）摘要目的：探讨Ｊａｇｇｅｄ１基因敲除小鼠模型中，胚胎血管发育异常和血管重塑严重缺陷。

方法：通过基因型鉴定确认纯合子Ｊａｇｇｅｄ１基因敲除小鼠（Ｊａｇ－／－），分析９．５天小鼠胚胎血管发育状态和血管内皮超微结构；分离胚胎内皮细胞培养于Ｉ型鼠尾胶中，观察环样结构生成。

结果：与正常野生型小鼠相比，纯合子Ｊａｇｇｅｄ１基因敲除小鼠血管内皮延伸段薄弱，内皮连接以点状连接为主，存在明显的结构缺陷；分离获得的胚胎内皮细胞鼠尾胶培养时，环样结构生成能力下降。

结论：Ｊａｇｇｅｄ１基因敲除可导致小鼠血管内皮发育异常，内皮结构的脆弱，成环能力下降，是纯合子基因敲除小鼠胚胎广泛出血现象的发育结构基础。

关键词基因敲除；内皮细胞；发育；胚胎中图分类号Ｑ８１２ＤｅｆｅｃｔｓｏｆｖａｓｃｕｌａｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎＪａｇｇｅｄ１ｔａｒｇｅｔｅｄｍｏｕｓｅＧＵＸｉｎｇｘｉｎｇ，ＴａｏＨｕｉ（ＪｉａｎｇｓｕＫｅｙＬａｂｏｆＮｅｕｒｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＮａｎｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉａｎｇｓｕ２２６００１）ＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｅｆｅｃｔｓｏｆｖａｓｃｕｌａｒｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇｉｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｍｉｃｅｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｏｆＪａｇｇｅｄ１（Ｊａｇ－／－）ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＧｅｎｏｔｙｐｅｏｆｅｍｂｒｙｏｓｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ．Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ（ＥＣ）ａｎｄｔｈｅｊｕｎｃｔｉｏｎｏｒｃｏａｌｅｓｃｅｆｏｒｍｉｎｔｈｅｃｏｕｒｓｅｏｆＥＣｃｏａｌｅｓｃｅｉｎｔｏｃｏｒｄｓｔｏｆｏｒｍａｌｕｍｅｎｈａｄｂｅｅｎｅｘａｍｉｎｅｄ．ＥＣｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄｏｎｒａｔｔａｉｌｃｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅＩａｎｄｔｈｅｃｏｒｄ－ｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｆｏｒｍｉｎｇｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅｓｐｒｅａｄｓｅｇｍｅｎｔｏｆＥＣｗａｓｔｅｎｕｏｕｓａｎｄｆｌｉｍｓｙｉｎＪａｇ－／－ｅｍｂｒｙｏｓ．ＴｈｅｍａｉｎｊｕｎｃｔｉｏｎｏｒｃｏａｌｅｓｃｅｆｏｒｍｗａｓｉｎｃｏｎｔａｃｔｉｎｔｈｅＪａｇ－／－ｅｍｂｒｙｏｓｗｈｉｌｅｏｖｅｒｌａｐｏｒｄｏｕｂｌｅｃｏｎｔａｃｔｗａｓｉｎｔｈｅｗｉｌｄｔｙｐｅ．ＩｔｉｓｄｉｆｆｉｃｕｌｔｆｏｒＥＣｔｏｆｏｒｍｅｄｃｏｒｄ－ｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｆｒｏｍＪａｇ－／－ｗｈｅｎｉｔｗａｓｃｕｌｔｕｒｅｄｏｎｒａｔｔａｉｌｃｏｌｌａｇｅｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＭｉｃｅｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｆｏｒｔｈｅＪａｇ１ｍｕｔａｔｉｏｎｄｉｅｆｒｏｍｈｅｍｏｒｒｈａｇｅｅａｒｌｙｄｕｒｉｎｇｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ．ＡｂｎｏｒｍａｌＵｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌＥＣＭｏｒｐｈｏｌｏｇｙｉｎＪａｇ－／－ｅｍｂｒｙｏｓａｎｄｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙｆｏｒｃｕｌｔｕｒｅｄＥＣｔｏｆｏｒｍｃｏｒｄ－ｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｆｒｏｍＪａｇ－／－ｅｍｂｒｙｏｓｍａｙｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔｏｄｅｆｅｃｔｓｉｎｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇｏｆｔｈｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｄｙｏｌｋｓａｃｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅｏｆＪａｇ－／－ｅｍｂｒｙｏ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓｇｅｎｅｔａｒｇｅｔ；ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ；ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；ｅｍｂｒｙｏ６４２・・交通医学２００６年第２０卷第６期ＭｅｄＪｏｆＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００６，Ｖｏｌ．２０．Ｎｏ．６点前检查确定是否完成交配。

孕至９．５天，引颈法处死怀孕母鼠，取出怀孕子宫。

在解剖镜下获取小鼠胚胎和卵黄膜。

１．３Ｊａｇｇｅｄ１基因敲除小鼠胚胎基因型鉴定对应敲除基因和野生型基因设计相应的特异性引物（由上海生工生物工程公司合成）。

ＪＡＧ１５’－ＴＣＴＣＡＣＴＣＡＧＧＣＡＴＧＡＴＡＡＡＣＣ－３’ＪＡＧ２５’－ＡＡＣＧＧＧＧＡＣＴＣＣＧＧＡＣＡＧＧＧ－３’ＪＡＧ４５’－ＧＧＴＧＣＴＧＴＣＣＡＴＣＴＧＣＡＣＧＡＧ－３’基因型鉴定时，Ｊａｇｇｅｄ１野生型基因用ＪＡＧ１与ＪＡＧ２扩增，Ｊａｇｇｅｄ１敲除基因用ＪＧ１与ＪＧ４扩增。

ＰＣＲ扩增条件：常规加样，总反应体积５０μｌ。

ＰＣＲ程序：９４℃预变性３分钟，９４℃３０秒，５８℃４０秒，７２℃３０秒，扩增３５个循环，最后７２℃延长５分钟。

１．４电镜标本制备将获取的小鼠胚胎和卵黄膜经过ＰＢＳ漂洗后，置２％戊二醛固定液中４℃下前固定１～２小时，用二甲砷酸钠缓冲液漂洗２小时（４℃），用１％锇酸再固定１．５～２小时（４℃）。

常规脱水、浸透、Ｅｐｏｎ８１２包埋、切片、醋酸铅－双氧铀染色，ＪＥＭＳ－１００透射电镜下观察。

１．５内皮细胞培养１．５．１胚胎卵黄膜内皮细胞分离培养：ＣＤ３１亲合磁珠准备按试剂盒说明书进行，４℃保存，１周内可用。

解剖镜下无菌取９．５天小鼠胚胎卵黄膜，切割成微小块。

每胚胎加１ｍｇ／ｍｌＩ型胶元酶１ｍｌ，３７℃消化１３分钟，吹打成单细胞悬液。

单细胞悬液８００转／分离心５分钟沉淀细胞，ＤＭＥＭ培养基离心洗涤１次，加１ｍｌＤＭＥＭ培养基，２０μｌＣＤ３１亲合磁珠，２￣８℃旋转孵育２０分钟（无菌），置ＤｙｎａｌＭＰＣ－Ｓ吸附架吸附磁珠，ＤＭＥＭ洗涤１分钟×３次。

收集磁珠吸附内皮细胞接种于４８孔培养板（ＡＦ包被），加４００μｌ内皮细胞培养基Ｍｅｄｉｕｍ１３１，内含ＭＶＧＳ（１∶５），１０％胎牛血清，３７℃，５％ＣＯ２培养２天，待细胞生长，充分脱离磁珠后洗去磁珠。

１．５．２内皮细胞Ｉ型鼠尾胶培养：用０．０２Ｎ冰乙酸溶解Ｉ型鼠尾胶使之浓度为５ｍｇ／ｍｌ，用ＤＭＥＭ培养基稀释溶解Ｉ型鼠尾胶使之浓度为１．３５ｍｇ／ｍｌ，取２００μｌ／孔加到４８孔培养板。

无菌下，培养板在氨气容器中暴露３分钟使胶凝结，在无菌双蒸水中平衡３０分钟后，换双蒸水平衡过夜，备用。

用０．２５％胰酶消化原代培养获得的胚胎内皮细胞，接种到Ｉ型鼠尾胶培养板，加内皮培养基础６００μｌ，３７℃，５％ＣＯ２培养２￣５天后，观察内皮环形成。

２结果２．１基因型确认杂合子Ｊａｇｇｅｄ１敲除小鼠相互交配，可以完成正常生育，在小鼠胚胎发育到９．５天时，可以得到纯合子Ｊａｇｇｅｄ１（Ｊａｇ－／－）敲除小鼠个体，个体基因型可以通过ＰＣＲ鉴定确认。

２．２血管内皮发育用电子显微镜观察小鼠９．５天胚胎系膜中胚层内的血管结构，可以发现在野生型小鼠中，内皮细胞相互已经形成连接包裹，或正在进行的连接中，内皮细胞间相互连接交错的区域较长，细胞间形成的连接较多表现为交错（ｏｖｅｒｌａｐ）和双交错（ｄｏｕｂｌｅｃｏｎｔａｃｔ），在点状连接（ｃｏｎｔａｃｔ）状态下，内皮细胞延伸段也表现为丰厚充实。

而在Ｊａｇ－／－小鼠中的内皮细胞间的连接，则主要表现为点状连接（见图１），连接区域内皮细胞延伸段相对纤弱的，在某些状态表现为非常纤细的简单膜结构和不连续的内皮细胞断裂结构（见图１箭头所示）。

在野生型（ＪＡＧ＋／＋）胚胎中内皮细胞环发育良好。

２．３环样结构形成用ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ－１）亲合磁珠细胞分选技术分离９．５天小鼠胚胎卵黄膜内皮细胞，可以得到２００－１０００细胞／胚胎，贴壁培养到４８孔板，细胞达到长满培养孔约需２０天左右的时间。

内皮细胞传代培养于Ｉ型鼠尾胶显示，野生型小鼠内皮细胞能相互快速形成良好网状连接的管样结构，而从纯合子基因敲除小鼠胚胎分选获得的内皮细图１Ｊａｇｇｅｄ１基因敲除小鼠血管内皮细胞结构特点（３０００×）表１９．５天小鼠胚胎系膜中胚层中内皮细胞连接方式点状连接交错交错长度双交错Ｊａｇ－／－８６２０１．０９４±０．３９１μｍ３Ｊａｇ＋／＋９２７３．４４３±０．４５２μｍ６Ｊａｇ＋／－８２１３．２９４±０．６２２μｍ３６４３・・交通医学２００６年第２０卷第６期ＭｅｄＪｏｆＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００６，Ｖｏｌ．２０．Ｎｏ．６胞，不能快速形成良好网状连接的环样结构，内皮细胞生长伸出端纤弱（图２）。

３讨论Ｊａｇｇｅｄ１基因敲除小鼠死于胚胎发育１０．５天，表现为血管发育异常和广泛出血。

这种广泛出血被认为是由于血管重塑严重缺失所引起的［５］。