敲除鼠的构建
基因敲除小鼠的制作方法
基因敲除小鼠的制作方法基因敲除小鼠是一种常用的遗传工具，在科学研究中被广泛应用于功能基因组学和疾病模型研究。
基因敲除是指通过特定技术手段，将小鼠体内的目标基因完全沉默或失活，从而研究该基因在发育、生理以及疾病机制中的功能。
本文将介绍基因敲除小鼠的制作方法，包括设计目标基因的敲除载体、胚胎干细胞的筛选和注射、外显子敲除策略的选择等。
1.设计目标基因的敲除载体敲除载体是嵌入目标基因的重要工具。
它通常包含正向与反向的同源臂（homology arms）以及选择标记（如抗生素抗性基因）。
同源臂的长度通常在2-5 kb之间，确保在同源重组时准确而有效地替代目标基因。
此外，敲除载体中还应该包含可诱导甲基化的Cre-loxP重组体系或者FLP-FRT重组体系，以用于后续的基因定向敲除或基因重新组装。
2.筛选胚胎干细胞胚胎干细胞是从内胚层发育而来的多潜能细胞，可以分化为整个鼠体的各种组织和器官。
敲除载体首先需要通过电转或霰粒枪等手段转染到胚胎干细胞系中。
转染后，胚胎干细胞需要进行抗生素筛选，以过滤未转染的细胞。
为了确保目标基因的敲除率，可以使用增强绿色荧光蛋白（eGFP）等标记基因，通过荧光显微镜观察转染细胞的表达情况。
3.敲除载体注射到小鼠受精卵中一旦确认胚胎干细胞中存在敲除载体，接下来就是将胚胎干细胞植入小鼠受精卵。
这个步骤一般由经验丰富的研究人员或者专业公司进行。
首先，选择合适的受精卵（通常为C57BL/6J小鼠品系），然后利用显微操作技术，将敲除载体注射到受精卵的核酸注入腔。
注射后，将受精卵转入对应营养液中培养一定时间，以期达到最佳着床率。
4.敲除鼠胚移植到配子体内经过培养后，将敲除的胚胎植入雌性激素准备好的代孕小鼠（通常为白色的株系，如ICR）。
移植后，将代孕小鼠继续养育，直至分娩。
5.验证敲除小鼠的敲除效果通过提取敲除小鼠的DNA，可以利用PCR、Southern blot和DNA测序等技术验证敲除效果。
完全性基因敲除大鼠构建技术原理及流程
完全性基因敲除大鼠构建技术原理及流程完全性基因敲除大鼠是通过CRISPR/Cas9基因敲除技术，针对靶基因设计和构建gRNA与Cas9表达质粒，造成目的基因的功能区域被敲除，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的大鼠模型。
完全性基因敲除包括：移码突变、片段基因敲除、双/多基因敲除。
移码突变鼠的建系原则与流程1、通过针对靶基因设计、构建相应的gRNA质粒，体外转录为RNA后，与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子大鼠；2、F0代杂合子大鼠与野生型大鼠进行交配，获得PCR和测序鉴定阳性的F1代杂合子大鼠；3、选择来自同一只F0代大鼠，基因型一致的F1代大鼠，达到性成熟后进行互配，可获得F2代大鼠。
对获得的F2代大鼠进行PCR及测序鉴定，理论上，F2代大鼠中25%为纯合子，50%为杂合子，25%为野生大鼠。
片段基因敲除鼠的建系原则与流程1、通过针对靶基因不同位点设计、构建相应的一对gRNA质粒，体外转录为RNA后，与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子大鼠；2、F0代杂合子大鼠与野生型大鼠进行交配，获得PCR鉴定阳性的F1代杂合子大鼠；3、选择来自同一只F0代大鼠，基因型一致的F1代大鼠，达到性成熟后互配，可获得F2代大鼠。
对获得的F2代大鼠进行PCR及测序鉴定，理论上，F2代大鼠中25%为纯合子，50%为杂合子，25%为野生大鼠。
双（多）基因敲除鼠的建系原则与流程1、通过针对两个靶基因分别设计、构建相应的gRNA质粒，体外转录为RNA后，与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代多基因杂合子大鼠；2、F0代杂合子大鼠与野生型大鼠进行交配，获得PCR和测序鉴定阳性的F1代双基因杂合子大鼠；3、选择双基因杂合子大鼠进行杂交，获得F2代大鼠。
对获得的F2代大鼠进行PCR及测序鉴定。
Gla基因敲除小鼠构建技术原理
Gla基因敲除小鼠构建技术原理
基因敲除小鼠是什么？是否就是我们平日所说的实验室用的小白鼠?其实小鼠有很多种，小白鼠只是其中一种，通常普通的小白鼠多被药厂用作临床试验，而基因敲除的小鼠，则用于更尖端的生物医学研究。
基因敲除小鼠技术原理：是先在小鼠的胚胎干细胞上通过基因重组的办法进行基因修饰——就是将胚胎干细胞中的靶向基因改掉,然后将“修饰”后的胚胎干细胞植入小鼠的早期胚胎,生成嵌合体小鼠。
这种嵌合体小鼠长大后,体内同时存在被“修饰”过的基因和未被“修饰”的基因。
下面是，Gla基因敲除小鼠介绍
基因名：Gla
别名：A;Ags
NCBI号：11605
品系背景：C57BL/6N
修饰方式：conventional knockout
表型提示：MGI:1347344
品系描述：Gla位于小鼠的X号染色体，采用CRISPR/Cas9技术，设计sgRNA，通过应用高通量电转受精卵方式，获得Gla基因敲除小鼠，性成熟后取精子冻存。
条件性敲除小鼠（CKO）原理、构建与应用
条件性敲除小鼠（CKO）原理、构建与应用基因敲除小鼠作为研究基因功能重要工具，应用十分广泛，然而实际操作中大家常常遇到这样问题：①靶基因敲除造成小鼠胚胎致死无法生育；②研究靶基因在某一阶段或者某一个组织的表达情况，那么全敲小鼠并不能满足我们的研究要求。
条件性基因敲除小鼠（CKO）就应运而生了，完美地解决了上面2个棘手问题。
今天，我们就为大家介绍一下条件性基因敲除小鼠的原理、构建、鉴定与应用。
一、条件性敲除小鼠（Conditional knockout mice, CKO）原理条件性基因敲除小鼠：使靶基因缺失仅发生于小鼠生命周期的某一阶段或某一特定的组织，而在其它组织或细胞表达正常，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。
如下为全敲和条件性敲除的对比：1. 技术原理通过染色体位点特异性重组酶系统Cre-LoxP或Flp-FRT来实现的。
在待敲除目的基因一个或多个重要外显子两端各放置一个LoxP （或FRT）序列，得到flox（Flankedby LoxP)小鼠。
将flox小鼠与带有组织特异性表达的Cre(或Flp)的小鼠交配繁殖，以获得在特定组织里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。
鉴于这2种技术基本原理一致，Cre-LoxP系统更多用于动物体内编辑，下面就以Cre-LoxP具体介绍。
2. Cre/LoxP系统组成Cre-LoxP系统源于 P1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。
该系统含有两种成分：LoxP位点：一段长34bp的DNA序列，为重组酶识别的位点：含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
Cre重组酶：为一种酶，由343个氨基酸组成的单体蛋白；具有位点特异性，可使LoxP片段间的基因序列被删除或重组。
根据LoxP位点方向分以下三类重组方式：⑴两个LoxP位点方向相同：如果两个LoxP位点位于一条DNA 链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；如图下①所示。
基因敲除小鼠的构建
生物技术十一班 梅沪生
1.基因敲除简介
2.基因敲除方法及其原理
2.1基因敲除小鼠的构建
2.2其他基因敲除方法
3.基因敲除应用
基因敲除主要是应用DNA同源重 组原理，用设计的同源片段替代 靶基因片段，从而达到基因敲除 的目的。
利用同源重组构建基因敲除小鼠的基本步骤
7
把目的基因和与
细胞内靶基因特
异片段同源的DNA
分子都重组到带
有标记干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪， 鸡等的胚胎干细胞也有使用。
将重组载体通过一定的
方式导入同源的胚胎干细 胞(ES cell)中，使外源 DNA与胚胎干细胞基因组中 相应部分发生同源重组，
将重组载体中的DNA序列整
合到内源基因组中，从而 得以表达
目前常用的方法是正负筛选法（PNS法），标记基因的特异位点表 达法以及PCR法。其中应用最多的是PNS法。
通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前 后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。
由于同源重组常常发
生在一对染色体上中一条
染色体中,所以如果要得 到稳定遗传的纯合体基因
建立生物模型
提供廉价的异种移植器官
疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗
免疫学中的应用
改造生物、培育新的生物品种
谢谢观赏
此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体， 在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变 的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。 是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的 新型方法 。
比用同源重组法更加简便，周期大大缩短。 对于哺乳动物，如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基 因，可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。 RNAi还被用来研究在发育过程中起作用的基因，如可用RNAi来阻断 某些基因的表达，来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程 中其起着关键作用。
基于CRISPRCas9技术的TRPS1基因敲除小鼠模型的构建
38基于CRISPR/Cas9技术的TRPS1基因敲除小鼠模型的构建李腾雁，刘文杰，赵宏，蔡建强*（国家癌症中心/ 国家肿瘤临床医学研究中心/ 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肝胆外科，北京 100021）李腾雁 博士研究生中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肝胆外科目的:基于CRISPR/Cas9技术构建敲除TRPS1基因的杂合子小鼠，并进行鉴定。
方法: C57BL/6N小鼠自行交配后，使用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法构建基因敲除小鼠，对可遗传的小鼠基因型进行鼠尾检测，TRPS1杂合子敲除小鼠分别与野生型小鼠交配，获得具有稳定基因型的小鼠。
结果:本实验通过使用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法，所有繁殖小鼠经鼠尾基因型鉴定，证实成功构建了18只TRPS1基因敲除的杂合子小鼠。
结论:基于CRISPR/Cas9技术成功构建了敲除TRPS1基因的杂合子小鼠。
关键词：CRISPR/Cas9；TRPS1；结直肠癌；基因敲除小鼠摘要基金支持：国家自然科学基金(81672461) ；国家自然科学基金(81972311) ；深圳市“医疗卫生三名工程”（SZSM202011010）首都卫生发展科研专项项目(2018-1-4021)；中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2016-I2M-1-001,2017-12M-4-002) *通信作者：蔡建强************************Generation of TRPS1 knockout mice by CRISPR/Cas9-mediated gene targetingAbstractObjectives: This study aimed to construct and identify heterozygous mice knocked out of TRPS1 gene based on CRISPR/ Cas9 technology.Methods: After self-mating of C57BL/6N mice, TRPS1 knockout mice were constructed by injecting fertilized eggs with Cas9/sgRNA, and the mouse genotypes of heritable mice were detected by tail. TRPS1 heterozygous knockout mice were mated with wild-type mice to obtain mice with stable genotypes.Results: In this experiment, the fertilized eggs were injected with cas9 / sgRNA, all breeding mice were identified by tail genotype, 18 TRPS1 knockout heterozygous mice were successfully constructed.Conclusion: In this study, we successfully constructed TRPS1 knockout heterozygous mice based on CRISPR / cas9 technology, which provided a research platform for further research on the role of TRPS1 in the occurrence, development and possible liver metastasis of colorectal cancer at the animal level.Keywords: CRISPR/Cas9; TRPS1; Colorectal cancer; Gene knockout mouseLi Tengyan, Liu Wenjie, Zhao Hong, Cai Jianqiang*(National Department of Hepatobiliary Surgery, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/ Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100021, China)我国结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的发病率和死亡率均保持上升趋势。
apoa5基因敲除仓鼠模型的构建方法
apoa5基因敲除仓鼠模型的构建方法
ApoA5基因是人体中一个重要的脂质代谢相关基因，它编码的蛋白质可以调节血浆三酰甘油水平。
因此，研究ApoA5基因的功能和作用对于了解脂质代谢的机制以及相关疾病的发生发展具有重要意义。
为了更好地研究ApoA5基因的功能，科学家们利用基因敲除技术构建了ApoA5基因敲除仓鼠模型。
ApoA5基因敲除仓鼠模型的构建方法主要包括以下几个步骤：
1.设计ApoA5基因敲除的引物
首先，科学家们需要设计一对特异性引物，用于扩增ApoA5基因的外显子序列。
引物的设计需要考虑到引物的长度、GC含量、Tm值等因素，以确保引物的特异性和扩增效率。
2.构建ApoA5基因敲除载体
将引物扩增得到的ApoA5基因外显子序列克隆到敲除载体中，构建ApoA5基因敲除载体。
敲除载体通常包括两个同向的荧光蛋白基因，用于筛选敲除细胞株。
3.转染和筛选
将ApoA5基因敲除载体转染到仓鼠胚胎干细胞中，利用荧光蛋白筛选出ApoA5基因敲除细胞株。
筛选出的细胞株需要进行PCR验证和Southern blotting确认。
4.建立ApoA5基因敲除仓鼠模型
将ApoA5基因敲除细胞株注射到野生型仓鼠的受精卵中，通过胚胎移植技术建立ApoA5基因敲除仓鼠模型。
建立的仓鼠模型需要进行PCR验证和Southern blotting确认。
通过以上步骤，科学家们成功地构建了ApoA5基因敲除仓鼠模型。
这个模型可以用于研究ApoA5基因的功能和作用，以及与脂质代谢相关的疾病的发生发展机制。
同时，这个模型也为开发相关疾病的治疗方法提供了新的思路和途径。
HTT基因敲除小鼠构建技术原理
HTT基因敲除小鼠构建技术原理HD小鼠模型是目前应用最广泛的HD哺乳动物模型，包括HD转基因小鼠模型、基因敲入（knock in, KI）小鼠模型，以及条件性表达N-端突变HTT的HD小鼠模型。
HD转基因小鼠通过转基因过表达mHTT的N-端片段，包括表达变异HTT exon1对应蛋白片段的R6/2及R6/1模型以及表达更长片段的N171-82Q模型等。
这些N-端片段均包含mHTT中的polyQ序列，而亨廷顿蛋白片段化在疾病的发生过程中具有重要作用，其产生的N-端片段具有高毒性，并且易聚集。
然而，此类模型由于只具有变异HTT基因的5′端序列，且往往有多个拷贝，在遗传学方面与HD病人不一致。
此外，此类模型的表型往往出现早（小鼠出生后几周至十几周），这与大多数HD病人也不一致。
而基因敲入可以精确地将突变基因插入到基因组中相同的位置，建立更接近于人类HD的动物模型。
近期，由中美两国研究人员联合发布了一篇关于HTT小鼠模型研究，提出了一种表型更为准确的HD小鼠模型——BAC226Q转基因小鼠。
在内源性HTT启动子和调节元件的控制下，转基因BAC226Q小鼠体内表达了含有226个CAG-CAA重复序列的全长人HTT。
为了确定全长人HTT序列在转基因FVB小鼠基因组中的拷贝数和插入位点，研究采用了全基因组测序，结果显示在FVB小鼠基因组的8号染色体Chr8:46084002处插入了两个人类HTT拷贝。
与11月龄的另一种亨廷顿模型BACHD小鼠及野生型小鼠进行比较，实验结果显示BAC226Q小鼠中226Q突变亨廷顿蛋白条带的分子量高于BACHD小鼠中97Q突变亨廷顿蛋白条带的分子量。
而在蛋白质印记实验结果显示，2个月或11个月的BAC226Q小鼠中未检测到Htt蛋白片段。
图3 BAC226Q转基因小鼠的产生[9]（A）将全长人类突变HTT插入小鼠基因组的示意图。
（B）通过Western blot分析了 BAC226Q、非转基因同窝小鼠和 BACHD(97Q)小鼠中Htt蛋白的表达水平。
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如何设计条件性基因敲除小鼠模型
摘要：
小鼠和大鼠可谓是生命科学实验室里的明星，成功的小鼠和大鼠模型可谓是“生命科学的好帮手”。
很多人可能想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠，在此做个小结，供大家参考。
小鼠和大鼠可谓是生命科学实验室里的明星，成功的小鼠和大鼠模型可谓是“生命科学的好帮手”。
很多人可能想自己设计或是了解条件性基因敲除小鼠，在此做个小结，供大家参考。
条件性基因敲除小鼠的设计利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理。
它们都是位点特异性重组酶系统。
这里以Cre/LoxP系统为例。
比如在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个loxP序列，得到flox(flanked by loxP)小鼠。
将flox小鼠与带有细胞特异性表达Cre 的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。
此外，若与控制Cre表达的其他诱导系统(比如CreERT2)相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。
Cre/loxP系统来源于噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。
该系统含有两个组成成分：一个是一段长34bp的DNA序列(LoxP序列)，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
LoxP的方向由中间这8个碱基决定。
这段LoxP序列是Cre重组酶识别的位点。
令一个组成部分是Cre重组酶。
它是由噬菌体编码的一种由343个氨基酸组成的蛋白。
Cre可以介导两个LoxP位点的重组，从而引起两个LoxP之间DNA序列的缺失。
如果将Cre重组酶cDNA通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下，可以得到Cre组织/细胞特异性表达的Cre小鼠，也叫Cre工具小鼠。
跟Flox小鼠交配之后，可以得到条件性基因敲除小鼠。
所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个LoxP序列。
这段序列就是Flanked by LoxP，也就叫做Flox小鼠。
这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。
这种小鼠跟Cre工具小鼠交配，由于Cre的表达，介导两个LoxP位点序列的重组，从而敲除两个LoxP之间的序列。
由于不同Cre工具小鼠的Cre表达有组织/细胞特异性，就可以达到在不同组织、细胞里特异性敲除目的基因的目标。
比如上皮细胞、胸腺细胞、T细胞、B细胞、心肌细胞、肠道、肺脏等。
那如何设计条件性基因敲除小鼠呢?这里所说的设计主要是Flox小鼠的设计。
所谓条件性敲除，是说除了特定细胞外，其它细胞里面没有任何的基因表达异常。
一般情况下，不要在第一个外显子前面放置LoxP序列。
因为第一个外显子前面一般是启动子。
放置LoxP 序列有可能会破坏或改变启动子活性。
条件性敲除一般是敲掉最早引起移码突变的外显子。
这样的话，最好不要敲除有起始密码子ATG的外显子。
否则的话，基因可能会利用ORF
内的ATG编码一个缺少部分N端序列的蛋白，这个蛋白很可能有全部或部分野生蛋白的功能。
在选择要敲除的外显子的时候(各放一个LoxP在一个外显子的两侧)，该外显子的碱基数目不能是3N，否则新基因pre-RNA拼接得到的mRNA不能产生移码突变。
会产生一个
与野生蛋白相比少了一段中间序列的新蛋白。
如果一个外显子的碱基数目是3N+1或3N+2，敲除这个外显子之后会产生移码突变，就可以达到基因敲除的目的。
筛选要敲除(Floxed)的外显子的时候，一般是从最上游的外显子开始筛选适合敲除的外显子。
需要注意的是，一般的DNA分析软件不能确定内含子和外显子的边界，需要仔细核对。
95%以上的边界遵循
gt/ag边界原则。
也可以在Ensembl上查一个基因的外显子和内含子。
这个网站上的结果绝大部分是正确的。
但也需要仔细核对。
毕竟基因敲除小鼠研发是一个时间比较长的过程，需要特别小心。
前期做多少的考虑都不嫌多。
这些原则只是对一般课题的考虑。
特殊情况需要特殊处理。
比如，如果只是想敲除一个基因的某个特定domain，或是如果一个基因有一个很大的外显子，这个时候即使这个外显子的碱基数目是3N，也可以对其进行敲除。