敲除小鼠常见问题与回答
传统ES打靶基因敲除敲入小鼠技能
传统ES打靶基因敲除敲入小鼠技能传统ES 打靶基因敲除/敲入小鼠技术技术原理传统的基因打靶技术制备基因敲除（KO ）/敲入（KI ）基因打靶技术是建立在DNA同源重组与胚胎干细胞等技术基础上的分子生物学技术。
同源重组是指当外源DNA 片段与宿主基因组片段同源性高时，同源DNA 区部分可与宿主DNA 的相应片段发生交换（即同源重组）。
基因打靶就是通过同源重组技术将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的。
基因打靶技术目前已被广泛认为是一种理想的特定修饰与改造生物体遗传物质的最佳方法。
尤其是条件性和诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因在时间和空间上的靶位修饰更加明确、效果更加精确可靠，该技术的发展已经为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究和治疗手段，并已显示出巨大的应用前景及商业价值。
服务流程和周期、管路敷设技术通过管线不仅可以解决吊顶层配置不规范高中资料试卷问题，而且可保障各类管路习题到位。
在管路敷设过程中，要加强看护关于管路高中资料试卷连接管口处理高中资料试卷弯扁度固定盒位置保护层防腐跨接地线弯曲半径标高等，要求技术交底。
管线敷设技术中包含线槽、管架等多项方式，为解决高中语文电气课件中管壁薄、接口不严等问题，合理利用管线敷设技术。
线缆敷设原则：在分线盒处，当不同电压回路交叉时，应采用金属隔板进行隔开处理；同一线槽内，强电回路须同时切断习题电源，线缆敷设完毕，要进行检查和检测处理。
、电气课件中调试对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料试卷相互作用与相互关系，根据生产工艺高中资料试卷要求，对电气设备进行空载与带负荷下高中资料试卷调控试验；对设备进行调整使其在正常工况下与过度工作下都可以正常工作；对于继电保护进行整核对定值，审核与校对图纸，编写复杂设备与装置高中资料试卷调试方案，编写重要设备高中资料试卷试验方案以及系统启动方案；对整套启动过程中高中资料试卷电气设备进行调试工作并且进行过关运行高中资料试卷技术指导。
基因敲除小鼠介绍
基因敲除小鼠介绍展开全文持续活化的Cre敲除基因的效率较高，但敲除基因的时间点不可控，导致基因敲除可能发生在发育早期或非预期的实验时间窗。
诱导型CreER虽具有时间可控性，提高了遗传操作的精确度，但敲除基因效率较低。
为了提高诱导型CreER的基因敲除效率，需要高剂量且多次给予tamoxifen诱导，这不仅对实验小鼠有毒副作用、长期影响其健康状况，而且会引起基因敲除以外的一些混淆的表型。
Cre小鼠通常不需要纯合小鼠，通常杂合子的Cre小鼠表达量已经足够重组了。
纯合子Cre插入位点不确定，可能导致非预期表型。
Cre 小鼠可能带有毒性，对内源基因表达有影响。
Cre小鼠作用的时间点是不可控的，其剪切效率比Cre ER高。
CreER会有leaky(泄露)的情况。
CreER的结果直接取决于tamoxifen诱导时间窗口的基因表达的情况，他莫昔芬可以在胚胎期给药，可以穿过胎盘屏障。
当然也有一种和谐的解决方法：例如2020年周斌组发表的Generation of a self-cleaved inducible Cre recombinase for efficient temporal genetic manipulation文章。
该研究构建了一种新的诱导型Cre重组酶，可通过自我剪切将诱导型CreER转变成持续活化的Cre，实现时间可控的高效遗传操作。
这种新型Cre重组酶结合了诱导型CreER和持续活化的Cre重组酶的优点，既提高了重组效率又具有时间可控性，弥补了传统CreER和Cre重组酶介导的遗传操作技术的缺陷，突破了长期阻碍基因功能研究的瓶颈，可广泛应用于器官发育、组织再生和疾病进程中的基因功能研究。
生殖系统漏表达现象他莫昔芬的给药时间窗口，6-8天才会代谢，连续给药比较好雌激素诱导型 Cre-ER将雌激素受体（estrogen receptor，简称ER）的配体结合区与Cre 重组酶相融合，形成定位于胞浆中的融合蛋白（Cre-ER）。
条件性敲除小鼠
条件性敲除小鼠定义：条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。
●CKO如何实现？重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术。
Cre是重组酶（38kDa），可识别34bp 长的DNA 序列loxP。
loxP 两侧各13bp 构成回文结构，中间8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性。
（当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时，Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化，同时将loxP 两侧的序列进行连接；当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时，Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。
）●CKO敲除的是什么？条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列，这种基因称为floxed gene。
带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。
在这种小鼠中，通常采用DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。
loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠●CKO敲除何时何地发生？除了flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。
Cre 工具鼠中，将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。
Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。
（范衡宇老师课件）实验时，将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配，最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。
在这类小鼠中，凡是表达Cre 的细胞，两个loxP 之间的序列被切除，从而实现组织特异性基因敲除。
敲除小鼠常见问题与回答
敲除小鼠常见问题与回答一、什么是ES细胞显微注射答：胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。
主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。
所得嵌合体小鼠的组织，将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。
嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递，这样可能获得转基因或打靶基因（来源于胚胎干细胞）稳定的生殖系传递的小鼠。
一般情况下，大约能获得50%继承了目的基因的后代。
二、嵌合体遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。
免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产生排斥反应,相互间处在嵌合状态。
在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞，使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞，产生的个体也叫嵌合体，即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞）。
三、条件性敲除的原理答：Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。
基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。
首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。
下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。
Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre 重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。
四、如何鉴定和挑选嵌合体答：动物只有部分组织细胞整合有外源基因，则称为嵌合体动物。
它的鉴定主要根据毛色去鉴定。
注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。
条件性敲除小鼠（CKO）原理、构建与应用
条件性敲除小鼠（CKO）原理、构建与应用基因敲除小鼠作为研究基因功能重要工具，应用十分广泛，然而实际操作中大家常常遇到这样问题：①靶基因敲除造成小鼠胚胎致死无法生育；②研究靶基因在某一阶段或者某一个组织的表达情况，那么全敲小鼠并不能满足我们的研究要求。
条件性基因敲除小鼠（CKO）就应运而生了，完美地解决了上面2个棘手问题。
今天，我们就为大家介绍一下条件性基因敲除小鼠的原理、构建、鉴定与应用。
一、条件性敲除小鼠（Conditional knockout mice, CKO）原理条件性基因敲除小鼠：使靶基因缺失仅发生于小鼠生命周期的某一阶段或某一特定的组织，而在其它组织或细胞表达正常，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。
如下为全敲和条件性敲除的对比：1. 技术原理通过染色体位点特异性重组酶系统Cre-LoxP或Flp-FRT来实现的。
在待敲除目的基因一个或多个重要外显子两端各放置一个LoxP （或FRT）序列，得到flox（Flankedby LoxP)小鼠。
将flox小鼠与带有组织特异性表达的Cre(或Flp)的小鼠交配繁殖，以获得在特定组织里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。
鉴于这2种技术基本原理一致，Cre-LoxP系统更多用于动物体内编辑，下面就以Cre-LoxP具体介绍。
2. Cre/LoxP系统组成Cre-LoxP系统源于 P1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。
该系统含有两种成分：LoxP位点：一段长34bp的DNA序列，为重组酶识别的位点：含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
Cre重组酶：为一种酶，由343个氨基酸组成的单体蛋白；具有位点特异性，可使LoxP片段间的基因序列被删除或重组。
根据LoxP位点方向分以下三类重组方式：⑴两个LoxP位点方向相同：如果两个LoxP位点位于一条DNA 链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；如图下①所示。
课题-基因敲除小鼠的pcr鉴定
一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。
尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN 等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示：图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图三、制作流程图2.基因敲除鼠制作过程示意图1. Knockout载体设计与构建根据研究项目具体情况和要求把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 片段都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组的Knockout载体。
apoe敲除小鼠如何敲除？
apoe敲除小鼠如何敲除？
ApoE -/-小鼠是目前最常用的一种转基因小鼠品系[2]。
作为一种自发的动脉粥样硬化模型，其与人的动脉粥样硬化进程最为相似。
ApoE是极低密度脂蛋白(VLDL) 和高密度脂蛋白(HDL) 的组成部分，参与胆固醇的运输。
和人的脂蛋白谱相反，小鼠体内HDL较高，而低密度脂蛋白（LDL）含量较低，其胆固醇主要存在于HDL中。
敲除ApoE基因后，胆固醇转而主要分布于VLDL中，其携带的大量胆固醇无法被细胞表面脂蛋白受体结合后降解，发生蓄积导致动脉粥样硬化。
研究表明ApoE -/-小鼠可自发形成高胆固醇血症（300-500 mg/dL），并在正常饮食条件下发生显著的动脉粥样硬化病变。
而高脂肪/高胆固醇的致动脉粥样硬化饮食会使血浆胆固醇水平升高超过1000 mg/dL，加速动脉粥样硬化进程[3]。
ApoE -/-小鼠血浆中三酰甘油水平也比正常小鼠高68%，且不受年龄和性别影响，其高密度脂蛋白只有正常小鼠45%[4]。
此类小鼠的病变部位主要发生于主动脉根部、主动脉弓、无名动脉、主动脉分支及肾动脉分叉。
正常饮食条件下，早期泡沫细胞病变可在10周内发生。
15周后发展成动脉粥样硬化病变。
20周后演变成晚期纤维病变。
高脂肪/高胆固醇饮食可加速这一致病过程，包括促进胆固醇结晶、坏死核心和钙化的形成。
基因敲除小鼠技术共9页word资料
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。
尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies 于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
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敲除小鼠常见问题与回答一、什么是ES细胞显微注射？答：胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。
主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。
所得嵌合体小鼠的组织，将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。
嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递，这样可能获得转基因或打靶基因（来源于胚胎干细胞）稳定的生殖系传递的小鼠。
一般情况下，大约能获得50%继承了目的基因的后代。
二、嵌合体遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。
免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产生排斥反应,相互间处在嵌合状态。
在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞，使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞，产生的个体也叫嵌合体，即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞）。
三、条件性敲除的原理？答：Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。
基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。
首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。
下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。
Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。
四、如何鉴定和挑选嵌合体？答：动物只有部分组织细胞整合有外源基因，则称为嵌合体动物。
它的鉴定主要根据毛色去鉴定。
注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。
它们的毛色不同。
因此可以根据毛色的嵌合率来鉴定和挑选嵌合体。
五、ROSA26与定点插入？答：利用同源重组技术，把外面的cDNA片段或者其他DNA片段，定点插入到ROSA26位置。
ROSA26是一个安全区域，外源性的基因定点插入这个位点不会影响其他基因的表达。
10、何谓Flox小鼠？所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个LoxP序列。
这段序列就是Flanked by LoxP，也就叫做Flox小鼠。
这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。
11、条件性敲除设计中，为什么在抗性基因的两侧设计的是Frt-Flip重组系统，而敲除目的基因用的是Cre-Loxp重组系统？在设计中，其中的一个系统是为了把抗性基因去掉。
另一个系统是为了把目的基因去掉。
Frt-Flip系统或Cre-Loxp系统都可以用来放在抗性基因或是目的基因外显子的两侧。
理论上是没有区别的。
只所以“在抗性基因的两侧设计的是Frt-Flip重组系统，而敲除目的基因用的是Cre-Loxp重组系统”，主要有以下几个原因：1）工具鼠：Cre-LoxP系统已经用了将近20年了，科学家研发了很多的Cre工具鼠。
其实目前绝大部分工具鼠都是Cre工具鼠。
现在大家做一个Flox(Flanked By LoxP)小鼠花费很多的时间和金钱，都会希望自己的小鼠与更多的工具鼠交配，得到更多的结果。
2) Flip酶的活性比较低。
Flip酶是从酵母中分离出来的。
其最适温度是30度，而小鼠的体温是37度。
尽管现在有些实验室对Flip的37度适应性做了优化，但应该还是没有Cre的活性好。
把Frt放在抗性基因的两侧，得到小鼠之后，跟Flip Deleter小鼠交配，筛选出去掉了抗性基因的小鼠，就是Flox小鼠了。
即使Flip的活性不高，也可以得到Flox小鼠。
这些Flox 小鼠可以跟各种Cre工具鼠交配，得到条件性敲除小鼠。
反过来，如果用Cre来去掉抗性基因，得到的是Frt小鼠。
这种情况下，一是可用的工具鼠很少，二是即使有，效率也可能不高。
如果看5、6年前的文章，大家其实是把Loxp不仅放在要敲除基因的两侧，也用来敲除抗性基因(NeoR)。
那个时候筛选起来特别麻烦。
因为要做大量的筛选，筛出只敲掉抗性基因，而没有敲掉目的基因的Flox小鼠。
需要很多的时间和精力。
12、怎样用最简单的描述区分基因敲除、基因敲进、基因敲降、和转基因 1）基因敲除（Knockout)：把一个基因从基因组里面全部或部分拿掉；2）条件性基因敲除（Conditional KO): 把一个基因从特定细胞的基因组里面全部或部分拿掉；3）基因敲进（Knockin)：在基因组里放一个外源基因（如GFP, LacZ, TdTomato等）； 4）基因敲降（Knock-down): 通过降解mRNA的方法降低蛋白的表达水平（一般是用microRNA或siRNA)。
5）转基因：在体内过表达一个特定基因，就象在细胞系里用高水平表达载体表达一个蛋白。
13、嵌合鼠的嵌合率很高，但是得不到杂合子是什么原因？高嵌合率不代表种系传递就好。
许多实验室，包括我们公司，都发现特别高嵌合率的嵌合体小鼠不能交配产仔。
原因不是很清楚,这应该跟打靶的基因是不是性染色体没有关系。
可以检查一下嵌合体小鼠是不是有隐睾的现象。
另外，毛色看到的嵌合率与生殖细胞的嵌合率不一定完全一致。
也有人认为雄性ES细胞注射到雌性囊胚使得胚胎发育过程中性别转化不完全，造成的所谓不男不女现象。
现在好像还没有一个定论知道到底是什么原因。
14、ROSA26位点插入外源基因的设计原理是什么？Rosa26位点基因敲入,在原来的设计中，目的基因cDNA上游带有一段转录终止序列“Stop”（3个拷贝的SV40多聚A序列，tPA）,转录终止序列的两端各有一个Loxp位点，将此结构定点嵌入Rosa26基因位置，整个结构的转录受Rosa26启动子控制。
在没有Cre的情况下，由于Rosa26启动子与目的基因之间“STOP”的存在，目的基因不能被表达。
如果有Cre表达， Cre重组酶将去除“STOP”，Rosa26启动子就可以启动目的基因表达。
但是，由于Rosa26启动子是一个弱启动子，其启动能力有限，目的基因经常达不到研究人员需要的表达水平。
为了解决这一问题，可以对原Rosa26基因敲入系统做改进，引入了一个强效的启动子，如CAG启动子, 该启动子由鸡actin启动子和CMV增强子融合而成，用这一杂合启动子代替Rosa26启动子，从而高效地启动目的基因表达。
15、在做条件性基因敲除小鼠模型的设计时，为什么不能从exon1敲除？条件性基因敲除小鼠模型的设计，不能从exon1开始敲除，原因是loxp site 最好不要插入到启动子区域，因为很难预测启动子和所有调控元件的位置，loxp的插入很有可能会因为破坏了启动子或调节原件而影响野生型蛋白的表达，所以条件性敲除设计中，一般都不会从exon1开始敲除。
16、目前基因沉默小鼠模型存在的缺陷有哪些？1）目前用于基因沉默的技术方法主要是siRNA。
对于一个待敲除的候选基因，需要设计多个siRNA，并对每一个siRNA进行验证（一般利用细胞系），这就造成筛选具有干扰作用siRNA 的选择难度相当大。
2）一般情况下，RNAi对于基因的抑制不会很完全。
在体外细胞实验中，我们一般只是观察1-5天，以验证siRNA的抑制功能。
而在小鼠体内，siRNA尽管可以降低mRNAs的水平，从而影响蛋白的表达，但并不一定影响基因的功能。
一是蛋白表达水平虽然达不到正常水平，但可能同样发挥完整的功能；二是蛋白表达水平降低会导致蛋白降解速度降低，从而使蛋白的整体水平得到补偿。
所以，除非非常运气，siRNA转基因一般很难得到比较肯定的结果。
如果不能完全阻断基因的表达，利用siRNA进行基因敲降时沉默掉的基因仍保留一定的表达信号，可能会得到无法解释的实验数据。
除非是为了研究siRNA,或miRNA在体内的功能（而不是研究siRNA/miRNA所对应的候选基因），一般我们不建议利用siRNA法进行基因敲除的设计。
在这种情况下，我们通常会建议客户做基因敲除来达到目标基因缺失其原始蛋白功能的目的。
17、为什么来源于129背景的小鼠胚胎干细胞的模式小鼠一定要在C57BL/6背景的小鼠上进行回交？1）发明小鼠基因敲除技术以来，传统上一直用129遗传背景的小鼠胚胎干细胞进行基因打靶制备模式小鼠，然后在C57BL/6等近交系小鼠上回交（back-cross)超过10代，才能进行诸如免疫学、癌症、神经学等绝大部分生物医学研究。
回交至少需要2年多的时间，给科研工作者在时间上、金钱上造成很大损失。
比如生物实验经常进行诸如细胞器官移植等实验，我们从动物供应商得到的小鼠多数是C57BL/6或Balb/C等纯系小鼠，而很少供应大量129小鼠以进行实验。
如果由129品系ES细胞制备的模式小鼠在C56BL/6品系上回交的代次不够，就会带有很多129小鼠抗原。
将其细胞等移植到C57BL/6或其他近交系小鼠后，受体鼠会由于自身免疫排斥的原因，将转移的细胞杀死或产生耐受现象。
2）由于129品系小鼠遗传背景复杂，得到的模式小鼠需在C57BL/6等近交系小鼠上做回交，并且回交次数不同也会造成实验结果重复性差。
这对开发制作标准模式动物是一个很大的难题，对生物科研、医药企业、安评中心、药检部门等，也是一个很大的缺憾。
所以如果能够直接用C57BL/6 ES 细胞进行基因打靶，就将直接获得C57BL/6品系的模式小鼠，保证了模式小鼠的稳定性，极大的提高了制作速度缩短了科研周期。
18、既然129背景的模式小鼠不能直接用于多数实验科学研究，为什么目前仍有科研机构利用129背景的小鼠胚胎干细胞制备模式小鼠？目前常用的129品系ES细胞的优点是它们比较皮实容易操作。
与其相对应能够用于基因打靶的C57BL/6遗传背景的ES细胞品系目前世界上少之又少也很难得到，C57BL/6 ES cell比较娇嫩，比如支原体污染就容易造成没有种系传递。
现今国外做129遗传背景模式小鼠一般在35000美元，而用C57BL/6 ES 细胞研发模式小鼠，价格一般在50000－80000美元之间。
但在增加科研竞争力和省去了回交时间等多方面来考虑，制备C57BL/6敲除小鼠还是值得的。
19、KO First 技术流程KO-First技术是通过在内含子中插入一个两边带有FRT位点的基因破坏盒来达到敲除的目的，这个破坏盒含有Splice acceptor (SA)(SA发挥剪接作用后，会将基因序列剪接，相应的片段就会被KO，所以叫KO First)，报告基因和Neo。