敲除小鼠常见问题与回答
敲除小鼠模型应用于疾病研究的实验设计建议
敲除小鼠模型应用于疾病研究的实验设计建议实验设计建议：敲除小鼠模型在疾病研究中的应用引言：近年来，基因敲除小鼠模型在疾病研究中扮演着不可或缺的角色。
通过使用遗传工程技术，研究人员能够敲除或修改小鼠基因，模拟人类疾病的发展及机制，从而为疾病的预防、诊断和治疗提供重要的理论基础。
本文将探讨敲除小鼠模型在疾病研究中的应用，并提出实验设计建议，以帮助研究者更好地利用这一模型。
一、敲除小鼠模型的概述敲除小鼠模型是通过基因敲除或敲入技术，对小鼠基因进行改变，来模拟人类疾病的发展和机制。
这一模型的优势在于小鼠与人类的基因组高度相似，其生物学特性和器官结构也与人类相似，因此成为疾病研究的理想模型。
二、敲除小鼠模型在疾病研究中的应用1. 疾病机制研究敲除小鼠模型可以帮助研究人员深入了解疾病的发展机制。
通过敲除特定基因，可以观察到小鼠是否出现与人类相似的疾病症状，从而揭示该基因在疾病发生发展中的作用。
例如，敲除小鼠模型被广泛应用于研究肿瘤和遗传性疾病等领域。
2. 药物筛选和治疗评估敲除小鼠模型可以用于评估新药的疗效和毒副作用。
通过与野生型小鼠进行对比，可以观察到敲除小鼠是否对药物产生特异性反应，从而为药物的开发和临床使用提供重要依据。
三、敲除小鼠模型实验设计建议1. 确定研究目标在开始设计敲除小鼠模型实验前，研究人员应明确研究的目标和疾病模型的特点。
例如，确定是否需要针对特定基因敲除，或是敲入人类特定基因的模型，以及设计实验要素等。
2. 选择敲除方法敲除小鼠模型的创建有多种方法，包括组织特异性基因敲除、胚胎干细胞敲除和基因座敲除等。
研究人员应根据具体需求选择合适的敲除方法。
3. 选择合适的鼠株和胚胎干细胞选择合适的鼠株和胚胎干细胞对于敲除小鼠模型的成功很关键。
鼠株的选择应基于其易感性和适应性，而胚胎干细胞的选择应基于其稳定性和再生能力。
4. 设计合适的实验组和对照组根据研究问题的需要，设计敲除小鼠模型的实验组和对照组。
条件性敲除小鼠
条件性敲除小鼠定义：条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。
●CKO如何实现？重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术。
Cre是重组酶（38kDa），可识别34bp 长的DNA 序列loxP。
loxP 两侧各13bp 构成回文结构，中间8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性。
（当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时，Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化，同时将loxP 两侧的序列进行连接；当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时，Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。
）●CKO敲除的是什么？条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列，这种基因称为floxed gene。
带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。
在这种小鼠中，通常采用DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。
loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠●CKO敲除何时何地发生？除了flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。
Cre 工具鼠中，将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。
Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。
（范衡宇老师课件）实验时，将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配，最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。
在这类小鼠中，凡是表达Cre 的细胞，两个loxP 之间的序列被切除，从而实现组织特异性基因敲除。
课题-基因敲除小鼠的pcr鉴定
一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。
尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN 等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组，如图1所示：图1.基因敲除鼠制作同源重组原理示意图三、制作流程图2.基因敲除鼠制作过程示意图1. Knockout载体设计与构建根据研究项目具体情况和要求把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 片段都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组的Knockout载体。
apoe敲除小鼠如何敲除？
apoe敲除小鼠如何敲除？
ApoE -/-小鼠是目前最常用的一种转基因小鼠品系[2]。
作为一种自发的动脉粥样硬化模型，其与人的动脉粥样硬化进程最为相似。
ApoE是极低密度脂蛋白(VLDL) 和高密度脂蛋白(HDL) 的组成部分，参与胆固醇的运输。
和人的脂蛋白谱相反，小鼠体内HDL较高，而低密度脂蛋白（LDL）含量较低，其胆固醇主要存在于HDL中。
敲除ApoE基因后，胆固醇转而主要分布于VLDL中，其携带的大量胆固醇无法被细胞表面脂蛋白受体结合后降解，发生蓄积导致动脉粥样硬化。
研究表明ApoE -/-小鼠可自发形成高胆固醇血症（300-500 mg/dL），并在正常饮食条件下发生显著的动脉粥样硬化病变。
而高脂肪/高胆固醇的致动脉粥样硬化饮食会使血浆胆固醇水平升高超过1000 mg/dL，加速动脉粥样硬化进程[3]。
ApoE -/-小鼠血浆中三酰甘油水平也比正常小鼠高68%，且不受年龄和性别影响，其高密度脂蛋白只有正常小鼠45%[4]。
此类小鼠的病变部位主要发生于主动脉根部、主动脉弓、无名动脉、主动脉分支及肾动脉分叉。
正常饮食条件下，早期泡沫细胞病变可在10周内发生。
15周后发展成动脉粥样硬化病变。
20周后演变成晚期纤维病变。
高脂肪/高胆固醇饮食可加速这一致病过程，包括促进胆固醇结晶、坏死核心和钙化的形成。
基因敲除小鼠技术共9页word资料
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。
尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies 于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
基因敲除小鼠饲养繁殖技巧
基因敲除⼩⿏饲养繁殖技巧科研狗但凡要做动物实验的，哪个不需要伺候⼩⿏？每天好吃的好喝地伺候着，定期更换垫料，还要操⼼它们的⼈⽣⼤事，给它分配对象，⽣了娃还要给帮它们做“亲⼦鉴定”，看见⼩⿏脱发了，要想办法，母⿏不⽣了，要想办法。
回头再看看⾃⼰，没头发，还没对象，天天愁⽂章，担⼼毕不了业，全指望⼩⿏们加油，让⾃⼰早⽇出成果，所以可不得好吃好喝的伺候它们嘛！尤其是基因敲除⼩⿏，⾝价昂贵，从接到它的那⼀刻起，整个⼈都⼜兴奋⼜紧张，⽣怕怠慢了这些⼩家伙，那么收到基因敲除⼩⿏后要如何制定计划进⾏扩群繁殖以满⾜实验需要呢？除了了解所选品系的⽣活习性外，我们还要考虑⾃⼰需要的基因编辑⿏可能出现哪些问题，有没有解决或者是改善的⽅法，这些我们可以通过查阅⽂献看有没有关于该基因敲除⼩⿏的相关信息并作出⼀个初步判断。
1.背景品系的特点这个不⽤多说，需要做动物实验的同学，谁还没养过⼏只⼩⿏呀，养之前肯定已经把它的⽣活习性、繁殖特点、饲养要求等了解的很清楚了，举个栗⼦，⽐如说C57BL/6J,该品系的雄⿏好⽃，尤其是刚断奶后不同窝的雄⿏不宜放⼀笼饲养。
2.饲养环境的要求应尽可能地给⼩⿏提供适宜的⽣活环境和营养，这⽅⾯可以参照国家标准来进⾏饲养管理。
⽐如，⼩⿏对于噪⾳、光照⽐较敏感，所以我们应给⼩⿏提供安静的环境，尽量选在⼈员⾛动少的地⽅，也不要频繁查看⼩⿏情况，这样⼩⿏会有压⼒的。
母⿏有筑巢的天性，可以向笼中放柔软的棉垫，⿎励其筑巢，有助于提⾼产量。
3.基因敲除⼩⿏饲养管理应注意哪些问题⼤多数基因敲除⼩⿏相对野⽣型⼩⿏⽽⾔，在某些⽅⾯会存在或⼤或⼩的问题，所以我们需要查阅相关的⽂献，看看有没有该基因敲除⼩⿏的⽂献报道，该基因被修饰后会出现哪些问题？这些问题有没有解决或者是改善的⽅法。
如果是某种基因被修饰后会导致⼩⿏不能合成某种物质，那么可以给⼩⿏额外补充该物质；若是基因敲除⼩⿏的成活率低，问题有可能出现在着床期⾄成年期的任意时间段，通过代乳和改善饲养条件也许能得以解决；如果基因敲除⼩⿏的⽣殖⼒低。
基因敲除小鼠的方法
基因敲除小鼠的方法
1. CRISPR/Cas9基因编辑技术，CRISPR/Cas9技术是一种高效的基因编辑工具，可以用来精确地敲除小鼠基因。
首先，科学家设计合成一段RNA序列，使其与目标基因序列相匹配，然后将这段RNA和Cas9蛋白复合体导入小鼠胚胎内。
复合体会通过识别并切割目标基因，导致基因敲除。
2. 胚胎干细胞技术，另一种常见的基因敲除小鼠方法是利用胚胎干细胞。
科学家可以将设计好的基因敲除载体导入小鼠胚胎干细胞中，使其发生基因敲除。
然后，这些修改过的干细胞可以被植入小鼠胚胎内，从而产生基因敲除小鼠。
3. 遗传改造小鼠技术，除了CRISPR/Cas9和胚胎干细胞技术，科学家还可以利用遗传改造技术来实现基因敲除。
这种方法涉及到选择性育种和杂交，通过选择性地交配和繁殖，最终得到具有特定基因敲除的小鼠品系。
总的来说，基因敲除小鼠的方法主要包括CRISPR/Cas9基因编辑技术、胚胎干细胞技术和遗传改造小鼠技术。
这些方法都是在实验室条件下进行的，需要经过严格的实验设计和操作流程，以确保
基因敲除的准确性和有效性。
同时，这些方法也为科学家提供了强大的工具，用于研究基因在生物体内的功能和作用机制。
基因敲除小鼠原理
基因敲除小鼠原理
基因敲除是一种常用的遗传学实验技术，通过人工干预使目标基因无法正常表达。
基因敲除小鼠则是在小鼠模型中应用基因敲除技术。
基因敲除的原理是利用DNA重组技术制备特定的敲除载体。
该载体中携带有目标基因的一部分DNA序列，同时还含有选择标记基因和其他必要的DNA片段。
敲除载体经过转染进入靶细胞后，在细胞内会发生DNA重组，导致目标基因发生敲除。
继而，选择标记基因的表达使得细胞能够被筛选出来。
在基因敲除小鼠的制备上，可以通过体外受精的方式将敲除载体导入受精卵中，或者通过基因编辑技术如CRISPR/Cas9在早期胚胎阶段实现基因敲除。
随后，带有敲除基因的胚胎会被移植到代孕母鼠体内进行发育。
通过基因敲除小鼠模型，研究人员可以研究目标基因的功能以及生理、病理学功能。
这种技术广泛应用于研究基因对发育、生长、免疫应答、代谢、行为等方面的影响。
基因敲除小鼠模型也被用于疾病模拟，如研究癌症、神经系统疾病等。
总之，基因敲除小鼠是通过敲除目标基因实现对特定基因功能的研究，为深入理解基因的功能以及疾病发生机制提供了重要工具。
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敲除小鼠常见问题与回答一、什么是ES细胞显微注射？答：胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。
主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。
所得嵌合体小鼠的组织，将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。
嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递，这样可能获得转基因或打靶基因（来源于胚胎干细胞）稳定的生殖系传递的小鼠。
一般情况下，大约能获得50%继承了目的基因的后代。
二、嵌合体遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。
免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产生排斥反应,相互间处在嵌合状态。
在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞，使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞，产生的个体也叫嵌合体，即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞）。
三、条件性敲除的原理？答：Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。
基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。
首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。
下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。
Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。
四、如何鉴定和挑选嵌合体？答：动物只有部分组织细胞整合有外源基因，则称为嵌合体动物。
它的鉴定主要根据毛色去鉴定。
注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。
它们的毛色不同。
因此可以根据毛色的嵌合率来鉴定和挑选嵌合体。
五、ROSA26与定点插入？答：利用同源重组技术，把外面的cDNA片段或者其他DNA片段，定点插入到ROSA26位置。
ROSA26是一个安全区域，外源性的基因定点插入这个位点不会影响其他基因的表达。
常见问题1、你们是否接受打靶载体或者重组的胚胎干细胞之后的服务工作？目前公司主要提供基因敲除定制化的全程服务，同时也可以承担打靶载体构建、细胞转染和显微注射等服务项目。
2、您公司的C57BL/6 野生型胚胎干细胞株是否可以出售？C57BL/6 野生型胚胎干细胞株我们是不对外出售的。
这个细胞株是我们自主研发并具有自主知识产权的细胞系。
鉴于基因敲除工作的重要环节以及是否可以得到一个比较好的Germline transmission的关键就是是否有一个高质量的ES cell line，因此这个ES cell line已经成为我们公司的最核心的资产。
所以，非常抱歉！我们不能对外出售，请您谅解！3、公司最后提供给客户多少只F1代小鼠？有相关的检测方法或检测报告吗？我们最后提供给客户的是不少于两只的F1杂合子小鼠。
一般情况下，我们可以提供更多的F1代杂合子小鼠。
我们会有相关的检测方法和最终的检测报告提供给您，您也可以自己进行核实检测！也可以在我们的帮助之下完成。
4、客户委托公司制备基因敲除小鼠需要提供哪些材料？客户只需要告诉我们要操作的基因名字和您的特殊要求。
对于没有经验的客户，我们会免费为您提供咨询，了解您的需求，以及想得到的结果，为您提供最佳的设计方案。
我们会对该基因进行序列分析后，给您一个初步的设计，双方沟通没有问题后，我们会签署一份技术服务合同，然后我们进行BAC的订购，开始模型的制备。
直到您得到F1代小鼠。
5、公司是否能提供大鼠的基因敲除服务？我们公司现在主要是提供各种基因敲除小鼠模型的制备服务。
有关基因敲除的大鼠模型，我们公司正在对技术进行研发和优化。
所以现在还不能为您提供基因敲除的大鼠，非常抱歉！请关注我们公司的网站。
我们一旦开始提供大鼠基因敲除服务，我们将在公司网站上公布（估计在2013年）。
6、公司提供基因敲进服务时，对敲进的基因有哪些要求？所能接受的最大分子量是多少？公司提供基因敲进服务时，对于特殊的基因，需要客户提供cDNA信息，插入基因片段的大小一般在5K以下，效果比较好。
对于5-10kb的，效率可能会低一些。
对于大片段的敲进，由于重组效率将大大地降低，我们可能会收取较多的费用。
7、公司会安排多少个阳性克隆进行囊胚注射？我们通常在注射的时候会安排四个克隆，但是我们做阳性重组胚胎干细胞筛选的时候通常要求得到不少于6-8个克隆，以备筛选更好的注射克隆之用。
而且，我们的最终目标是要得到优良的Germ-line transmission。
8、公司如何对转染的ESC进行筛选，如何确保目的基因的正确插入?我们在构建打靶载体时会引入NEO抗性基因筛选标记，同时在打靶载体特定位置引入酶切位点。
打靶载体电转细胞后，首先进行G418的抗性初筛。
之后，我们会通过两次Southern 杂交实验，对插入位点的两端进行验证，以此确保目的基因完整的插入到正确位置，以及其它位置没有随机插入。
9、公司制备完成的小鼠如何运输？公司在根据客户的要求得到F1杂合子小鼠后，我们会根据客户的具体要求选择运输方式与运输日期。
如果您没有特殊要求，我们会通过专业的实验动物运输公司，以空运的方式安排运输。
10、何谓Flox小鼠？所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个LoxP序列。
这段序列就是Flanked by LoxP，也就叫做Flox小鼠。
这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。
11、条件性敲除设计中，为什么在抗性基因的两侧设计的是Frt-Flip重组系统，而敲除目的基因用的是Cre-Loxp重组系统？在设计中，其中的一个系统是为了把抗性基因去掉。
另一个系统是为了把目的基因去掉。
Frt-Flip系统或Cre-Loxp系统都可以用来放在抗性基因或是目的基因外显子的两侧。
理论上是没有区别的。
只所以“在抗性基因的两侧设计的是Frt-Flip重组系统，而敲除目的基因用的是Cre-Loxp重组系统”，主要有以下几个原因：1）工具鼠：Cre-LoxP系统已经用了将近20年了，科学家研发了很多的Cre工具鼠。
其实目前绝大部分工具鼠都是Cre工具鼠。
现在大家做一个Flox(Flanked By LoxP)小鼠花费很多的时间和金钱，都会希望自己的小鼠与更多的工具鼠交配，得到更多的结果。
2) Flip酶的活性比较低。
Flip酶是从酵母中分离出来的。
其最适温度是30度，而小鼠的体温是37度。
尽管现在有些实验室对Flip的37度适应性做了优化，但应该还是没有Cre的活性好。
把Frt放在抗性基因的两侧，得到小鼠之后，跟Flip Deleter小鼠交配，筛选出去掉了抗性基因的小鼠，就是Flox小鼠了。
即使Flip的活性不高，也可以得到Flox 小鼠。
这些Flox小鼠可以跟各种Cre工具鼠交配，得到条件性敲除小鼠。
反过来，如果用Cre来去掉抗性基因，得到的是Frt小鼠。
这种情况下，一是可用的工具鼠很少，二是即使有，效率也可能不高。
如果看5、6年前的文章，大家其实是把Loxp不仅放在要敲除基因的两侧，也用来敲除抗性基因(NeoR)。
那个时候筛选起来特别麻烦。
因为要做大量的筛选，筛出只敲掉抗性基因，而没有敲掉目的基因的Flox小鼠。
需要很多的时间和精力。
12、怎样用最简单的描述区分基因敲除、基因敲进、基因敲降、和转基因1）基因敲除（Knockout)：把一个基因从基因组里面全部或部分拿掉；2）条件性基因敲除（Conditional KO): 把一个基因从特定细胞的基因组里面全部或部分拿掉；3）基因敲进（Knockin)：在基因组里放一个外源基因（如GFP, LacZ, TdTomato等）；4）基因敲降（Knock-down): 通过降解mRNA的方法降低蛋白的表达水平（一般是用microRNA 或siRNA)。
5）转基因：在体内过表达一个特定基因，就象在细胞系里用高水平表达载体表达一个蛋白。
13、嵌合鼠的嵌合率很高，但是得不到杂合子是什么原因？高嵌合率不代表种系传递就好。
许多实验室，包括我们公司，都发现特别高嵌合率的嵌合体小鼠不能交配产仔。
原因不是很清楚,这应该跟打靶的基因是不是性染色体没有关系。
可以检查一下嵌合体小鼠是不是有隐睾的现象。
另外，毛色看到的嵌合率与生殖细胞的嵌合率不一定完全一致。
也有人认为雄性ES细胞注射到雌性囊胚使得胚胎发育过程中性别转化不完全，造成的所谓不男不女现象。
现在好像还没有一个定论知道到底是什么原因。
14、ROSA26位点插入外源基因的设计原理是什么？Rosa26位点基因敲入,在原来的设计中，目的基因cDNA上游带有一段转录终止序列“Stop”（3个拷贝的SV40多聚A序列，tPA）,转录终止序列的两端各有一个Loxp位点，将此结构定点嵌入Rosa26基因位置，整个结构的转录受Rosa26启动子控制。
在没有Cre的情况下，由于Rosa26启动子与目的基因之间“STOP”的存在，目的基因不能被表达。
如果有Cre表达， Cre重组酶将去除“STOP”，Rosa26启动子就可以启动目的基因表达。
但是，由于Rosa26启动子是一个弱启动子，其启动能力有限，目的基因经常达不到研究人员需要的表达水平。
为了解决这一问题，可以对原Rosa26基因敲入系统做改进，引入了一个强效的启动子，如CAG启动子, 该启动子由鸡actin启动子和CMV增强子融合而成，用这一杂合启动子代替Rosa26启动子，从而高效地启动目的基因表达。
15、在做条件性基因敲除小鼠模型的设计时，为什么不能从exon1敲除？条件性基因敲除小鼠模型的设计，不能从exon1开始敲除，原因是loxp site 最好不要插入到启动子区域，因为很难预测启动子和所有调控元件的位置，loxp的插入很有可能会因为破坏了启动子或调节原件而影响野生型蛋白的表达，所以条件性敲除设计中，一般都不会从exon1开始敲除。
16、目前基因沉默小鼠模型存在的缺陷有哪些？1）目前用于基因沉默的技术方法主要是siRNA。
对于一个待敲除的候选基因，需要设计多个siRNA，并对每一个siRNA进行验证（一般利用细胞系），这就造成筛选具有干扰作用siRNA的选择难度相当大。
2）一般情况下，RNAi对于基因的抑制不会很完全。
在体外细胞实验中，我们一般只是观察1-5天，以验证siRNA的抑制功能。
而在小鼠体内，siRNA尽管可以降低mRNAs的水平，从而影响蛋白的表达，但并不一定影响基因的功能。