胰蛋白酶的配制、过滤除菌与分装
胰酶得配制
查看文章细胞消化胰酶的配制2008-12-10 12:46适用于，无师兄、师姐、非细心、单独开展细胞培养的实验者对一般细胞0.25% 胰酶(胰蛋白酶，Trypsin)配方：100ml PBS,0.25g胰酶步骤：1先配100mlPBS(1000mlPBS:8.0gNaCl,3.4785gPO4HNa2·12H2O/2.9gPO4HNa2 ,0.2gKCl,0.2gPO4H2K溶于1000ml蒸馏水)2 称胰酶0.25g3 加入PBS中，低速搅拌〈4h冰浴中,或者4℃过夜低速搅拌0.5h冰浴中4 调PH7.45 仍在冰浴中6 过滤，分装，-20℃保存，4℃短期内用完tip:低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。
低温，防止酶失活对难消化的细胞：在上述配方中，加入0.02g的EDTA(0.02%)tip:因为EDTA可以络合Ca2 ，增加消化效力问：请问哪位仁兄能告知一下EDTA-胰蛋白酶的配制。
急用！多谢！答：1、胰酶是0.25%,这是质量体积比，就是说0.25g胰酶溶于100ml PBS,注意，尽量不要用水来溶，因为要保持渗透压。
2、EDTA的工作液溶度是0.02%－0.1%，根据细胞消化的难易程度自己调整。
EDTA并不是必须的，容易消化的细胞可不加。
EDTA对细胞贴壁性有影响，因此使用时要甚重。
如果影响贴壁，但消化时必须要用，那么在用完全培养基终止消化后，可离心弃上清，再加完全培养基培养，可去除EDTA。
如果对贴壁没影响，那么可不离心。
3、EDTA的浓度也是质量体积比。
和胰酶一起溶于PBS。
4、注意，血清可终止胰酶的作用，但不能终止EDTA的作用，对有些细胞来说，终止消化后的离心是必要的。
5、胰酶和EDTA在pH 为8左右的时候最易溶解，在配制时可先滴几滴NaOH将pH调至8，注意，胰酶可使溶液变酸，所以要边溶边测pH，随时调整。
注意，不可加过量NaOH，否则过碱，细胞会受不了。
胰蛋白酶的配制、过滤除菌与分装
20ml0.25%胰蛋白酶的配制、过滤除菌与分装（1ml）
准备样品：Try干粉，PBS缓冲液，离心管两个、冻存管20个、盒子一个、枪头1盒、灭菌器、注射器。
准备工作：将离心管、冻存管装载盒子中高温高压灭菌。
配制：
1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂50mg溶入离心管PBS（PH到7.2左右）液中。
搅拌混匀，置于4℃内过夜。
2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。
3.分装：将除菌之后的胰蛋白酶用移液枪分装到冻存管中，每个冻存管1ml，于-20℃保存以备使用。
细胞试验
细胞培养用试剂的配制1、胰蛋白酶（trypsin）：0.02 g EDTA-2Na、0.25 g胰蛋白酶，用PBS定容于100 mL容量瓶中。
2、PBS：NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 2.9 g、KH2PO4 0.2 g，用超纯水定容于1000 mL容量瓶中。
3、MTT（5 mg/mL）：噻唑蓝，一般现配现用，过滤后4℃避光保存，MTT变为灰绿色时不可以再用。
MTT不好溶解时，可以多吹打几次，或者磁力搅拌器30min，外包锡箔纸。
MTT 500 mg，用PBS定容于100 mL容量瓶中。
4、双抗：氨苄西林（U）0.5 g、硫酸链霉素（80万单位）1.25 g，用超纯水定容于100 mL容量瓶中。
注：* 有时不需要准确定容；** 细胞用试剂需用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌；*** 链霉素终浓度为100 μg/mL，氨苄西林终浓度为50 μg/mL。
（0.5÷100＝0.005 g/mL，溶于100 mL培养基，0.005 g÷100 mL＝0.05 mg/mL，即50 μg/mL）**** 为了充分溶解，4℃过夜，然后再分装于1.5 mL EP管中，-20℃保存。
细胞初代培养1、准备：培养用品消毒放入经紫外照射30min的净化台内。
组织块，培养液易受紫外损伤的物品在培养时再放入操作野中。
2、漂洗、剪切、消化组织：PBS洗组织块3次，组织块剪成3-5mm2块状，剪碎的组织放入三角烧瓶中，加入比组织量多30-50倍的0.25%的胰蛋白酶消化液，置于磁力搅拌器上（常用消化温度37℃，pH7.6-8.0），组织蓬松呈絮状可终止。
也可以采用冷消化法，即加入胰酶4℃过夜或更长。
消化时间依据组织块大小和硬度而定。
3、分离：消化过程中消化液变浑浊，可吸取少量在镜下观察，若组织分散成细胞团或者单个细胞，立即终止，低速离心（500-1000 rpm/ min）5min,去上清，Hanks液漂洗3次，离心去上清，共两次，用筛网滤去为充分消化的组织块，低速离心（500-1000 rpm/ min）5min,去上清，加入一定量的培养液。
胰酶的配制
胰酶的配制过程姓名：李达专业：预防兽医学号：2013022060 导师：汤德元一．胰酶-EDTA的配制1、专用PBS缓冲液配方：1000mlPBS: 7.000g NaCl1.100g Glucose·H2O 或 1.000g Glucose0.3700g KCl0.2g Na2PO4H3.000g Tris0.2400g KH2PO40.4000g EDTA超纯水1000ml所有试剂全部为细胞培养专用sigma试剂。
0.0010g 酚红5ml PS2.5g 胰酶（HyClone 胰蛋白酶1:250 SH30848.018）2、配制步骤：1）所用容器先泡酸12小时，后用自来水洗至无色后用蒸馏水洗净，再用超纯水洗三遍，最后高压灭菌，烘干。
2）将缓冲液配好后高压灭菌，同时洗好的广口瓶灭一瓶超纯水备用。
3）加入5ml双抗（PS）。
4）以灭菌的超纯水补足高压过程中损失的水分定容至1000ml。
5）转移到1L的试剂瓶中，加入酚红（0.0010g）。
6）调PH至7.2-7.4。
7）低温冰浴中溶解Tryspin2.5g.混匀。
此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。
8）在细胞间里用0.22um的滤膜过滤，分装入灭菌的50ml或1.5ml离心管中。
此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。
-20℃保存。
9）不可反复冻存。
每次解冻后4℃保存，并在短期内用完。
3、注意事项：1）整个分装过程在无菌条件下进行。
2）机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫酶就变性了。
低温可防止酶失活。
3）加入的EDTA可以络合细胞外基质中的Ca2+ ，增加消化效力。
4）在调节PH时一定要注意保护探头，防止损伤电极。
5）分装时不要太满，防止冻存后体积增大而溢出。
50ml离心管装45ml左右，1.5ml离心管装1.4ml左右。
6）分装后的胰酶尽快转移到-20℃冰箱中冻存。
二．0.25%胰酶（无EDTA）的配制1、250ml胰酶配制方法Tryspin 0.625gPS 2.5ml苯酚红0.1g所有试剂全部为细胞培养专用sigma试剂。
胰蛋白酶-EDTA溶液
胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25%:0.02%)产品简介：胰蛋白酶（Trypsin）是由胰脏产生没有活性的胰蛋白酶原分泌到小肠后，小肠内的肠肽酶会活化该酶原，形成胰蛋白酶。
胰蛋白酶的特点还在于已经活化的胰蛋白酶，能够继续活化更多胰蛋白酶原，这种过程即自动催化。
胰蛋白酶在小肠工作，它会将蛋白质水解为肽，进而分解为氨基酸，其最适温度约为37℃。
Leagene的 Trypsin-EDTA solution，含0.25%胰酶、0.02%EDTA。
该溶液经过过滤除菌，可以直接用于培养细胞的消化，或者一些组织的消化。
该产品通常室温消化1min 左右就可以消化下大多数贴壁细胞。
主要成分：主要由0.25%胰酶、0.02%EDTA等组成，不含酚红，过滤除菌。
自备材料：1、微量移液器2、PBS、Hanks液或无血清培养液3、显微镜4、离心机操作步骤(仅供参考)：1、贴壁细胞的消化①吸除培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。
②加入少量Trypsin-EDTA solution，略盖过细胞即可，室温放置0.5～2min，不同的细胞消化时间有所不同。
③显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。
此时吸除胰酶细胞消化液。
加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验。
④如果发现消化不足，则加入Trypsin-EDTA solution重新消化。
⑤如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。
1000～2000g离心1min，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。
2、组织的消化不同的组织需要消化的时间相差很大，通常以消化后可以充分打散组织为宜。
注意事项：1、尽量减少反复冻融的次数，以免失效。
培养用液的配制
实验一培养用液的配制、除菌与分装【实验目的】1. 掌握常见培养用液的配制方法。
2. 掌握常用的灭菌方法。
3. 了解每种培养用液的作用。
【实验原理】常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液体培养基、胰蛋白酶（Trypsin）和EDTA溶液。
PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和EDTA。
培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。
鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM 和L-15；用于动物的一般是DMEM和RPMI-1640。
胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。
EDTA 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。
细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS 和EDTA 可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。
【试剂、材料与仪器】试剂：NaCl ；KCl；Na2HPO4；KH2PO4；EDTA；胰蛋白酶；HEPES；碳酸氢钠；MEM或PRMI-1640 培养基干粉；GPS材料：三蒸水，蒸馏水瓶，精密天平，药匙，称量纸，烧杯（250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH 试纸（6.8-8.0），容量瓶（250 mL、1000 mL），一次性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，消毒纱布，酒精喷壶，已高压灭菌试剂瓶（500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸，橡胶手套，移液管（5 mL、10 mL），封口膜仪器：超净工作台，加液枪，4℃冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。
第1组配制PBS并高压灭菌，第2组配制胰蛋白酶溶液并过滤除菌和分装，第3组配制EDTA溶液并分装高压灭菌，第4组配制培养基，第5组过滤除菌培养基并分装。
每个实验小组需准备试剂有：胰酶50 mL；EDTA 50 mL；培养基90 mL（使用前加入10 mL血清）。
胰酶的配制
胰酶的配制过程姓名：李达 专业：预防兽医学号： 2013022060 导师：汤德元NaCl Glucose H 2O 或 I.OOOg Glucose KCl Na 2PO 4HTrisKH 2PO 4 EDTA1OOOml所有试剂全部为细胞培养专用sigma 试剂 O.OO1Og酚红 5ml PS2.5g 胰酶（ HyClone 胰蛋白酶 1:25O SH3O848.O18） 2、配制步骤：1 ）所用容器先泡酸 12 小时，后用自来水洗至无色后用蒸馏水洗净， 再用超纯水洗三遍，最后高压灭菌，烘干。
2）将缓冲液配好后高压灭菌，同时洗好的广口瓶灭一瓶超纯水备用。
3） 加入 5ml 双抗（ PS ）。
4） 以灭菌的超纯水补足高压过程中损失的水分定容至 1OOOml 。
5） 转移到1L 的试剂瓶中，加入酚红（O.OOIOg ）。
6） 调 PH 至 7.2-7.4。
7） 低温冰浴中溶解Tryspin2.5g.混匀。
此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。
8） 在细胞间里用0.22um 的滤膜过滤，分装入灭菌的 50ml 或1.5ml 离心管中。
此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。
-2O C 保存。
9） 不可反复冻存。
每次解冻后4 C 保存，并在短期内用完。
一．胰酶 -EDTA 的配制1、专用 PBS 缓冲液配方：1000mlPBS: 7.000g1.100g 0.3700g 0.2g3.000g 0.2400g 0.4000g 超纯水3、注意事项：1）整个分装过程在无菌条件下进行。
2）机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫酶就变性了。
低温可防止酶失活。
3）加入的 EDTA 可以络合细胞外基质中的 Ca 2+，增加消化效力。
4）在调节 PH 时一定要注意保护探头，防止损伤电极。
5）分装时不要太满，防止冻存后体积增大而溢出。
50ml 离心管装 45ml 左右， 1.5ml 离心管装 1.4ml 左右。
6）分装后的胰酶尽快转移到-20C 冰箱中冻存。
细胞培养相关常用液体配制标准SOP操作规程样本
细胞培养相关常用液体配制标准SOP操作规程样本（一）胰酶的配制：（浓度为1‰，1L）1、认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。
2、称取牛胰蛋白酶1.0g；EDTA 2 g；3、用超纯水溶解；4、磁力搅拌器搅拌至胰酶完全溶解，溶液变得澄清；5、超纯水定容至1L；6、不锈钢滤器加0.22um滤纸两张高温灭菌后，在超净工作台过滤；7、在血清瓶中加入少量滤好的胰酶，置于细胞培养箱中检测是否染菌，其余置于4℃待用；8、过滤后洗净滤器再次灭菌，避免残留的胰酶降解蛋白。
（二）DMEM配制：1、所需试剂及材料：试剂：DMEM干粉（GIBCO 10L）、超纯水（Milli-Q）、Na2CO3 （Sigma）材料：10L玻璃瓶、500ml盐水瓶（灭菌）、0.22um滤膜、滤器（事先放好两层滤膜并高压灭菌）、磁力搅拌器大号搅拌子蠕动泵胶塞2、操作步骤：(1)10L玻璃瓶洗涤，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。
(2)在10L玻璃瓶中加入超纯水9.5L，将DMEM干粉倒入，在磁力搅拌器上搅拌溶解。
(3)按照3.7g/L 加入Na2CO3 。
(4)调节pH值至7.2~7.4。
(5)过滤分装，并注明名称及配制日期。
此过程注意无菌操作！(6)最后用血清瓶取10ml左右置于细胞培养箱中检测是否染菌。
(7)清洗滤器，10L玻璃瓶，软管，将所有实验器具归位。
（三）1640、MEM培养基的配制同上，Na2CO3的用量见包装说明（四）细胞间100×双抗（青霉素、链霉素）的配制青霉素及链霉素配制的终浓度为1万单位/毫升。
配制的步骤以400ml为例：1.认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。
2.准备5瓶青霉素（80万单位/瓶）、4瓶链霉素（100万单位/瓶）。
3.加入1-2ml细胞间专用PBS进入青霉素、链霉素的瓶子内，浸泡后吹吸数次至全部溶解，溶解后的液体吸入配制容器内。
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20ml0.25%胰蛋白酶的配制、过滤除菌与分装（1ml）
准备样品：Try干粉，PBS缓冲液，离心管两个、冻存管20个、盒子一个、枪头1盒、灭菌器、注射器。
准备工作：将离心管、冻存管装载盒子中高温高压灭菌。
配制：
1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂50mg溶入离心管PBS（PH到7.2左右）液中。
搅拌混匀，置于4℃内过夜。
2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。
3.分装：将除菌之后的胰蛋白酶用移液枪分装到冻存管中，每个冻存管1ml，于-20℃保存以备使用。