实验七 叶绿体色素的提取分离及理化性质的鉴定

实验七叶绿体色素的提取及理化性质的鉴定

一、目的

1、学习应用提取分离叶绿体色素的实验方法。

2、验证叶绿素的理化性质。

3、了解叶绿体色素的荧光现象、皂化反应等理化性质。

二、原理

1、叶绿体色素：植物叶绿体色素主要有三类：1）叶绿素2）类胡萝卜素3）藻胆素。高等植物叶绿体中含有前两类，藻胆素仅存在于藻类植物中。

高等植物体内叶绿素（chlorophyll两种）主要有两种：叶绿素a、b（简写为chla、chlb，其结构式见图7-3），chla通常呈蓝绿色，而chlb呈黄绿色，chlb是chla局部氧化的衍生物。chla是chlb的三倍，二十世纪30年代，知道了叶绿素的分子结构，50年代末期，人工合成了叶绿素a，其它色素也几乎在同时发现。

叶绿体中的类胡萝卜素主要包括胡萝卜素（carotene）和叶黄素（lutein）两种，前者呈橙黄色，后者呈黄色。叶黄素是胡萝卜素的二倍。一般植物叶绿素是类胡萝卜素的三到四倍；胡萝卜素：C40H56 （有α、β、γ三种同分异构体）

叶黄素：C40H54（OH）2 (同分异构体很多)。

2、理化性质：这二大类四种色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮等。通常用80%的丙酮或丙酮：乙醇：水为4.5：4.5：1的混合液来提取叶绿素。

按化学性质来说，叶绿素是叶绿酸的酯，在碱的作用下，可使其酯键发生皂化作用，生成叶绿酸的盐，能溶于水，但由于它保留有Mg核的结构，仍保持原来的绿色。而类胡萝卜素中，胡萝卜素是不饱和的碳氢化合物，β—胡萝卜素水解可生成2分子维生素A，叶黄素是由胡萝卜素衍生的二元醇，不能与碱发生皂化反应，根据这一点，可以将叶绿素和类胡萝卜素分开。此外，叶绿素还可以在酸的作用下，其中的Mg被H所代替形成褐色的去Mg叶绿素：去Mg叶绿素能与其他金属盐中的铜、锌、铁盐等代H，又重新呈现绿色，比原来的绿色更稳定。根据这一原理可用醋酸铜处理来保存绿色标本。

3、功能：

1．叶绿体色素的功能

叶绿素和类胡萝卜素都包埋在类囊体膜中，与蛋白质结合在一起，组成色素蛋白复合体，根据功能来区分，叶绿体色素可分为二类：

（1）作用中心色素：叶绿素分子含有一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇的“尾部”，呈蝌蚪型，大卟啉环由四个小吡咯环以四个含有双键的甲烯基（-CH=）连接而成。镁原子居于卟啉环的中央，偏向于带正电荷，与其相联的氮原子则偏向于带负电荷，因而其“头部”具有极性，是亲水的，可以与膜上的蛋白质结合；而其“尾部”是叶绿酸的双羧基被甲醇和叶醇所酯化后形成的脂肪链，具疏水亲脂性，可以与膜上的双卵磷脂层结合，因此，这决定了叶绿素分子在类囊体膜上是有规则的定向排列。极少数具特殊状态的chla分子，其卟啉环上的共轭双键易被光激发而使电子与电荷分离，引起光能转化为电能的重要反应，因此这些chla分子是光合作用的重要色素，称“作用中心色素”；

（2）天线色素（聚光色素）：没有光化学活性，只有收集光能的作用，包括大部分chla 和全部chlb、胡萝卜素、叶黄素。这些色素排列在一起，象漏斗一样，把光传递集中到作用中心色素，引起光化学反应。类胡萝卜素还是一种保护性色素，在光过强时，可耗散过剩激发能，消除活性氧自由基，防止光合器官被氧化损伤。

3、形成条件：

叶绿素的形成

叶绿素在植物体内，能不断的进行新陈代谢，如菠菜的叶绿素72小时更新95.8%；烟草19天后更新50%，其合成与分解受植物遗传控制（如吊兰叶的白边），也与环境关系密切。

高等植物的叶绿素形成可以分为两个阶段，第一个阶段：主要是由α-酮戊二酸（或由其和氨形成的谷氨酸）经过一系列复杂的生化反应合成叶绿素的前身物质—无色的原叶绿酯；第二个阶段：原叶绿酯在光下被还原，成为绿色的叶绿素。

叶绿素形成的条件

1．光照光是叶绿素形成的必要条件，原叶绿素必须经过光照后才能合成叶绿素。缺乏光照或其他某些条件，影响叶绿素形成，使叶子发黄的现象，称黄化现象。由于黄化部位，机械组织不发达，肉质细嫩，生产上常用于遮光培育韭黄、蒜黄、葱白等；而光太强对叶绿素也不利，会使叶绿素氧化、褪色、去镁，并形成对膜有害的自由基。

有些植物或植物部分无光照条件也能形成叶绿素，如松、柏，莲子胚芽等，推测这些植物中含有代替可见光促进叶绿素合成的物质。

2．温度温度主要通过影响叶绿素合成酶的活性而影响叶绿素的合成。一般叶绿素形成的最低温度为2～4℃，最适26-30℃左右，最高约40℃。早春植物幼芽、叶呈黄绿色，是低温影响了叶绿素的形成的缘故。

3．矿质营养矿质元素对叶绿素形成也有很大影响。N和Mg是叶绿素的组成成分，Fe、Mn、Cu、Zn等在叶绿素合成过程中也是必不可缺少的元素，缺少这些元素会引起缺绿症。特别是氮素，植株体内氮水平高低可影响叶绿色的深浅，生产上以此来判断氮肥的丰缺。4．水分和氧气植物缺乏水和O2，不仅抑制叶绿素的形成，还会促进原有叶绿素的分解。所以严重高温、干旱缺水和涝害缺O2时，叶子常表现黄色褪绿现象。

由于叶绿素的形成受许多条件的影响，所以叶色是反映植物的营养情况和健康状况的一个很灵敏的指标，成为肥水管理和调控作物生长发育的依据之一。

5、提取：叶绿体色素为有机酯类化合物，根据相似相容原理，常用有机溶剂提取。如酒精、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等。

分离：薄层层析法是将吸附剂均匀的涂抹在玻璃板上形成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待测分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂中。流动相通过毛细管作用由下而上逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组成分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、脱吸附、再吸附……的过程。由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附能力强的物质相对移动慢一些，儿媳妇能力弱的物质相对移动快一些，从而使各组分有不同移动速度而彼此分开。叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类,这两类色素都不溶于水,而溶于有机溶剂,故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取.

提取液可用色层分析的原理加以分离.因吸附剂对不同物质的吸附力不同,当用适当的溶剂推动时,混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数,所以它们的移动速度不同,经过一定时间层析后,便将混合色素分离.

叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯,故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐,产生的盐能溶于水中,可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性,叶绿素吸收光量子而转变成激发态,激发态的叶绿素分子很不稳定,当它变回到基态时可发射出红光量子,因而产生荧光.叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素,后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素,铜代叶绿素很稳定,在光下不易破坏,故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。

6、叶绿素是一种有叶绿酸与甲醇形成的复合酯，故可发生皂化反应。叶绿素化学性质不稳定，见光分解。叶绿素中的Mg可以被H+代而形成褐色的去镁叶绿素，去镁叶绿素遇铜则变成铜带叶绿色。

纸层析法测定叶绿素

纸层析是用滤纸作为载体的一种色层分析法，其原理主要是利用混合物中各组分在；流动相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分离。滤纸上吸附的水为固定相（滤纸纤维常能吸20%左右的水），有机溶剂如乙醇等为流动相，色素提取液为层析试样。把试样点在滤纸的滤液细线位置上，当流动相溶剂在滤纸的毛细管的作用下，连续不断地沿着滤纸前进通过滤液细线时，试样中各组份便随着流动相溶剂向前移动，并在流动相和固定相溶剂之间连续一次有一次的分配。结果分配比比较大的物质移动速度较快，移动距离较远；分配比较小的物质移动较慢，移动距离较近，试样中各组分分别聚集在滤纸的不同的位置上，从而达到分离。

叶绿素等是脂溶性的有机分子，根据相似相溶的原理，叶绿素等色素分子溶于有机溶剂而不溶于有极性的水。故在研磨和收集叶绿色素时要用丙酮或乙醇等有机溶剂而不用水。

叶绿素分布于基粒的片层薄膜上，加入少许二氧化硅是为了磨碎细胞壁、质膜、叶绿体被膜和光合片成，使色素溶解于丙酮中。3. 破碎的细胞中含有草酸等有机酸，叶绿素分子中含有的Mg元素处于不稳定化合态，镁离子与有机酸结合将导致色素分子破坏。加入少许碳酸钙使得钙离子与有机酸结合，减少镁离子的转移，防止研磨时叶绿体色素的破坏。所以在研磨时加入适量的碳酸钙，同时加入碳酸钠的道理亦如此。

在过滤时选用脱脂棉或纱布，而不用滤纸。原因主要有下：（1）色素分子比较大，不容易透过滤纸；（2）滤纸有较强的吸附性而使色素吸附在滤纸上，从而降低色素浓度，影响实验效果；（3）叶绿素是脂溶性，根据相似相容的原理，脱脂棉可以减少实验过程中色素的流失，增强实验效果。根据物理学中的毛细现象，画滤纸细线前滤纸必须经过干燥处理，是为了阻止水分子堵塞滤纸中的毛细管而影响层析液的扩散。但如果用火烤的话，会使滤纸纤维变形同时破坏啦毛细管，而影响层析液的扩散。

沿滤纸边缘扩散过快，而导致色素带分离不整齐的现象。故而，在插入层析液的滤纸条一端剪去两个角。沿滤纸条向上的“壁流”而导致色素溶解。

色素分离的原理：纸层析是用滤纸作为载体的一种色层分析法，其原理主要是利用混合物中各组分在；流动相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分离。滤纸上吸附的水为固定相（滤纸纤维常能吸20%左右的水），有机溶剂如乙醇等为流动相，色素提取液为层析试样。把试样点在滤纸的滤液细线位置上，当流动相溶剂在滤纸的毛细管的作用下，连续不断地沿着滤纸前进通过滤液细线时，试样中各组份便随着流动相溶剂向前移动，并在流动相和固定相溶剂之间连续一次有一次的分配。结果分配比比较大的物质移动速度较快，移动距离较远；分配比较小的物质移动较慢，移动距离较近，试样中各组分分别聚集在滤纸的不同的位置上，从而达到分离的目的。

物理：叶绿素是植物进行光合作用的主要色素,是一类含脂的色素家族叶绿素

,位于类囊体膜.叶绿素吸收大部分的红光和紫光但反射绿光,所以叶绿素呈现绿色,它在光合作用的光吸收中起核心作用.叶绿素为镁卟啉化合物,包括叶绿素a、b、c、d、f以及原叶绿素和细菌叶绿素等.叶绿素不很稳定,光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解.酸性条件下,叶绿素分子很容易失去卟啉环中的镁成为去镁叶绿素.叶绿素有造血、提供维生素、解毒、抗病等多种用途。

化学性质：高等植物叶绿体中的叶绿素主要有叶绿素a 和叶绿素b 两种.它们不溶于水,而溶于有机溶剂,如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等.叶绿素a分子式：C55H72O5N4Mg；叶绿素叶绿素荧光仪。

b分子式：C55H70O6N4Mg.在颜色上,叶绿素a 呈蓝绿色,而叶绿素b 呈黄绿色.按化学性质来说,叶绿素是叶绿酸的酯,能发生皂化反应.叶绿酸是双羧酸,其中一个羧基被甲醇所酯化,另一个被叶醇所酯化。

高等植物叶绿体中的叶绿素主要有叶绿素a 和叶绿素b 两种。它们不溶于水，而溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等。叶绿素a分子式：C55H72O5N4Mg；叶绿素叶绿素荧光仪

b分子式：C55H70O6N4Mg。在颜色上，叶绿素a 呈蓝绿色，而叶绿素b 呈黄绿色。按化学性质来说，叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应。叶绿酸是双羧酸，其中一个羧基被甲醇所酯化，另一个被叶醇所酯化。

叶绿素分子含有一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇的“尾巴”。镁原子居于卟啉环的中央，偏向于带正电荷，与其相联的氮原子则偏向于带负电荷，因而卟啉具有极性，是亲水的，可以与蛋白质结合。叶醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶绿素的脂溶性。叶绿素不参与氢的传递或氢的氧化还原，而仅以电子传递（即电子得失引起的氧化还原）及共轭传递（直接能量传递）的方式参与能量的传递。

卟啉环中的镁原子可被氢离子、铜离子、锌离子所置换。用酸处理叶片，氢离子易进入叶绿体，置换镁原子形成去镁叶绿素，使叶片呈褐色。去镁叶绿素易再与铜离子结合，形成铜代叶绿素，颜色比原来更稳定。人们常根据这一原理用醋酸铜处理来保存绿色植物标本。叶绿醇是亲脂的脂肪族链，由于它的存在而决定了叶绿素分子的脂溶性，使之溶于丙酮、酒精、乙醚等有机溶剂中。由于在结构上的差别，叶绿素a呈蓝绿色，b呈黄绿色。在光下易被氧化而退色。叶绿素是双羧酸的酯，与碱发生皂化反应。叶绿素不很稳定，光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解。酸性条件下，叶绿素分子很容易失去卟啉环中的镁成为去镁叶绿素。叶绿素溶液能进行部分类似光合作用的反应，在光下使某些化合物氧化或还原。人工制备的叶绿素膜在光下能产生光电位和光电流，也能催化某些氧化还原反应。

三、材料与方法

1、材料：菠菜（Spinacia oleracea L. ）

2、方法：

提取绿色叶片中的色素

（1）取几片绿色的叶片，去掉叶柄和主脉，用天平称取5g 叶片，剪碎，放入研钵中。（2）向研钵中放入少许二氧化硅和碳酸钙，进行充分的研磨。用量筒量取5 ml 丙酮，倒入研钵中，迅速充分研磨。

（3）将研磨液迅速倒入小玻璃漏斗中进行过滤。将滤液收集到一个小试管中，及时用棉塞将试管目塞紧。

制备滤纸条：取一块预先干燥处理过的定性滤纸，将滤纸剪成长10 cm、宽1cm 的滤纸条，在距滤纸条一端1cm 处用铅笔画一条细的横线。

画滤液细线、用毛细吸管吸取少量滤液，沿铅笔线均匀地画出一条细而直的滤液细线。待滤液于后，再画2~3 次。

分离叶绿体中的色素：将3 mL 层析液倒入烧杯中，将滤纸条（有滤液细线的一端朝下）略微料靠着烧杯的内壁，轻轻地插入到层析液中，随后用培养皿盖盖上烧杯；（注意，不能让滤纸上的滤液细线触到层析液。纸层析法中所用的有机溶剂如丙酮等，一般有挥发性、并有一定毒性，使用时要注意密封层析，避免吸入过多有害挥发物。）

荧光现象的观察：取浓的叶绿体色素提取液化3ml,在透射光和反射光下观察叶绿体色素提取液的颜色。

四、结果与分析

结果：经过10—15分钟后，观察分离后色素带的分布。最上端橙黄色为胡萝卜素，其次黄色为叶黄素，再下面蓝绿色为叶绿素a，最后的黄绿色为叶绿素b。

分析：纸层析法依据极性相似相容原理，是以滤纸纤维的结合水为固定相，而以有机溶剂作为流动相。由于样品中各物质分配系数不同，因而扩散速度不同，从而达到分离的目的。一般用于叶绿体中色素的分离，叶绿体中色素主要包括胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b，它们在层析液中的溶解度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上扩散地快，反之则慢；含量较多者色素带也较宽。最后在滤纸上留下4条色素带，所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中的色素分离。

得图片：

荧光现象：在透射光下叶绿素提取液为蓝绿色，在反射光下为红色。

五、讨论与结论

绿叶中的色素包括叶绿素（叶绿素a 、叶绿素b）和类胡萝卜素（胡萝卜素、叶黄素）,其中叶绿素a 呈现蓝绿色,叶绿素b呈现黄绿色,胡萝卜素呈现橙黄色,叶黄素呈现黄色。

绿叶中的四种色素含量依次是：叶绿素a >叶绿素b >叶黄素>胡萝卜素（叶绿素a与叶绿素b的比约为3∶1,叶黄素与胡萝卜素之比约2∶1）。

色素在层析液中的溶解度不同,溶解度高的色素分子随层析液在滤纸上扩散得快,溶解度低的色素分子随层析液在滤纸上扩散得慢,因而可用层析液将不同色素分离.四种色素的溶解度高低依次为胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a 、叶绿素b。

在滤纸条上出现四条宽度、颜色不同的色带,从上到下依次为胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a 、叶绿素b.在滤纸条上,两色素带间距离最大的是：胡萝卜素与叶绿素b,两色素带间距离最小的是：叶绿素a 与叶绿素b,相邻两色素带间距离最大的是：胡萝卜素与叶黄素。

网上查阅资料得到图片：

叶绿素是植物进行光合作用的主要色素,是一类含脂的色素家族叶绿素

,位于类囊体膜.叶绿素吸收大部分的红光和紫光但反射绿光,所以叶绿素呈现绿色,它在光合作用的光吸收中起核心作用.叶绿素为镁卟啉化合物,包括叶绿素a、b、c、d、f以及原叶绿素和细菌叶绿素等.叶绿素不很稳定,光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解.酸性条件下,叶绿素分子很容易失去卟啉环中的镁成为去镁叶绿素.叶绿素有造血、提供维生素、解毒、抗病等多种用途。

得图片：

述结果表明,应用薄层层析法可以简单、快速、高效地提取和分离天然色素。但由于叶绿素很不稳定,光、酸、碱、氧和氧化剂等都会使其分解。因此,在整个实验过程中,应在中性条件和暗处(或弱光)进行。

六、文献资料

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作业

1、叶绿体色素的提取及其理化性质观察依据的原理是什么

色素分离的原理：纸层析是用滤纸作为载体的一种色层分析法，其原理主要是利用混合物中各组分在；流动相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分离。滤纸上吸附的水为固定相（滤纸纤维常能吸20%左右的水），有机溶剂如乙醇等为流动相，色素提取液为层析试样。把试样点在滤纸的滤液细线位置上，当流动相溶剂在滤纸的毛细管的作用下，连续不断地沿着滤纸前进通过滤液细线时，试样中各组份便随着流动相溶剂向前移动，并在流动相和固定相溶剂之间连续一次有一次的分配。结果分配比比较大的物质移动速度较快，移动距离较远；分配比较小的物质移动较慢，移动距离较近，试样中各组分分别聚集在滤纸的不同的位置上，从而达到分离的目的。

物理：叶绿素是植物进行光合作用的主要色素,是一类含脂的色素家族叶绿素

,位于类囊体膜.叶绿素吸收大部分的红光和紫光但反射绿光,所以叶绿素呈现绿色,它在光合作用的光吸收中起核心作用.叶绿素为镁卟啉化合物,包括叶绿素a、b、c、d、f以及原叶绿素和细菌叶绿素等.叶绿素不很稳定,光、酸、碱、氧、氧化剂等都会使其分解.酸性条件下,

叶绿素分子很容易失去卟啉环中的镁成为去镁叶绿素.叶绿素有造血、提供维生素、解毒、抗病等多种用途。

2.比较分析各种叶绿体色素的提取方法及其理化性质观察方法的异同点及其科学性、准确性的差异比较。

答：叶绿体色素的提取方法

（1）丙酮研磨法：叶绿体中色素的种类及其颜色；叶绿体中各种色素的相对含量。

（2）抽滤法：

在抽滤法提取色素的过程中, 由于抽滤时不好控制, 非极性溶剂难免会被

抽去, 且在几次转移中损失较多, 程序繁杂 结果色素损失较大 所得

色素提取液颜色较淡不利于实验操作。

（3）超声波提取法：具有提取温度低、时间短的优点,且色素产品提取率高、色价高。

（4）微波辐射提取法：借助微波提取天然色素是近年来发展的新技术。对于脂溶性色素,有机溶剂不易渗透细胞壁和细胞膜,不能很好地将提取物从细胞器中溶出,使提取时间延长。而采用微波辐射萃取可大大缩短时间,降低生产能源,溶剂的消耗以及废物的产生,从而可以提高萃取效。

理化性质：

叶绿素a,叶绿素b,叶黄素，胡萝卜素都不溶于水，而溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮等。通常用80%的丙酮或丙酮：乙醇：水为4.5：4.5：1的混合液来提取叶绿素。

按化学性质来说，叶绿素是叶绿酸的酯，在碱的作用下，可使其酯键发生皂化作用，生成叶绿酸的盐，能溶于水，但由于它保留有Mg核的结构，仍保持原来的绿色。而类胡萝卜素中，胡萝卜素是不饱和的碳氢化合物，β—胡萝卜素水解可生成2分子维生素A，叶黄素是由胡萝卜素衍生的二元醇，不能与碱发生皂化反应，根据这一点，可以将叶绿素和类胡萝卜素分开。此外，叶绿素还可以在酸的作用下，其中的Mg被H所代替形成褐色的去Mg叶绿素：去Mg叶绿素能与其他金属盐中的铜、锌、铁盐等代H，又重新呈现绿色，比原来的绿色更稳定。根据这一原理可用醋酸铜处理来保存绿色标本。