弹性蛋白酶产生菌的筛选及其发酵条件的初步研究

浙江大学学报!农业与生命科学版"#$!%"&’$()*+#,,-./01234/56789:32;<2:=81>:?@!A B C D E F GH D I J K E D F"文章编号&%,,P L$#,$!#,,-",%L,,’$L,)弹性蛋白酶产生菌的筛选及其发酵条件的初步研究陈启和+何国庆+邬应龙!浙江大学食品科学与营养系+浙江杭州-%,,#$"摘要&从肉联厂和屠宰场附近的土壤和污水中采集到的近%,,个样品中+经富集培养分离到%#-株能产生弹性蛋白酶的菌株+反复初筛Q复筛后+分离到一株产胞外弹性蛋白酶活较高且稳定的细菌+经初步鉴定属芽孢杆菌属!R S T U V V W X Y Z F[H-"O同时研究了其产酶最适条件+产酶最适碳源为葡萄糖+最适氮源为豆饼粉O并对碳源Q氮源和生长因子进行了正交实验+研究发现碳源对产酶的影响最大+其次为氮源O当葡萄糖的用量为)\Q豆饼粉为’\Q玉米提取液为,F#\时+其具有较高的产酶水平O最适发酵初始Z]为M F’+#’,^H最适摇瓶装液量为#,^H O在该发酵培养基中培养+-’_时达最高的产酶水平O 同时还对离心后的粗酶液进行温度和Z]试验+发现该酶最适作用温度和Z]分别为’,‘和M F*+该酶在*,‘以下保温-,^D a酶活仍较高+在),‘以上酶活全部丧失O在Z]M F*($F,的范围内比较稳定+而在Z]M F,以下时+酶活下降很快O金属离子b c#d Q e a#d Q A f-d能抑制弹性蛋白酶的活性+而g J-d QH D#d能激活弹性蛋白酶活性+螯合剂[h i A则严重抑制弹性蛋白酶活性O关键词&弹性蛋白酶j芽孢杆菌j筛选j鉴定j产酶条件j酶性质中图分类号&i k$#’F#文献标识码&Ab][l k D L_J+][m c n L o D a B+pq r D a B L f n a B!s t u S v w F x y z x x{|T U t}T tS}{~W w v U w U x}+!"t#U S}$ %}U&t v X U w’+(S}$)"x W-%,,#$+*"U}S"+,1882:2;/5843>?3>8-.1//0,:2;>?13:2>32/.1:031:1@3?0/:8>/2581082?3?:/2,/2/:?:/2>F1n c C a2f n I e_J3D2a Bq a D4J C Y D56!A B C D E F GH D I J K E D F"+#,,-+#$!%"&’$L)*78>?13,?&K5C2D a Y E2Z29f J n I Y J E C J5D a BJ:5C2E J f f c f2C J f2Y52Y J;J C J D Y n f25J<I C n^5_J Y n D f2a<;2Y5J;25J CY2^Z f J Y5_25;J C Ja J2C5_JZ C n E J Y Y D a BI2E5n C6n I Z D B^J25F=I5_J^%#-Y5C2D a YZ C n<c E J<J f2Y52Y J F K5C2D a l n F[H-;D5_5_J_D B_J Y5L6D J f<J f2Y52Y J;2Y D<J a5D I D J<2Y R S T U V V W XY Z F F>a2<<D5D n a+5_J J:Z J C D^J a52f C J Y c f5Y C J4J2f J<5_255_J^n Y5Y c D529f J E2C9n a2a<a D5C n B J aY n c C E J Y I n C J f2Y52Y J Z C n<c E5D n a ;J C JB f c E n Y J)\2a<Y n69J2aI f n c C’\+C J Y Z J E5D4J f6F i_JA l=?A C J Y c f5Y<J^n a Y5C25J<5_25;_J aB f c E n Y J;2Y)\+Y n69J2aI f n c C’\2a<E nC aY5J J ZI f n c C,F#\+D5_2<5_J_D B_J Y5J f2Y52Y J Z C n<c E5D n a Fp_J a5_JD a D5D2f Z]n I5_J^J<D c^;2Y M F’+2a<#,^H9C n5_D a#’,^H I f2Y@D5;2Yn Z5D^2f I n C J f2Y52Y J Z C n<c E5D n a F i_J E c f5c C J^2D a52D a J<^2:D^c^J f2Y52Y J2E5D4D5625-’‘I n C-’_n c C Y c a<J C5_J n Z5D^D A J<E n a<D5D n a Y F i_JJ f2Y5D n 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O等J但分离到的产酶菌都不同程度地存在着一定毒性J对人体存在潜在危害J而且筛选到的菌株产酶水平较低J难以实现工业化生产K本研究从土壤和污水中分离到一株能降解弹性蛋白且酶活较高的芽孢杆菌J经初步鉴定属芽孢杆菌属中的一个种J并对产酶条件和粗酶液性质进行了初步研究KN材料与方法b8b材料b8b8b菌株分离自肉联厂附近的土壤和污水中Kb8b8c主要试剂和仪器弹性蛋白H d?@G,公司产品I J刚果红e弹性蛋白H d?@G,公司产品I J酪蛋白H上海生化试剂公司I K酸度计) f g d e;V型J上海雷磁仪器厂/h i N j k分光光度计J惠普上海分析仪器有限公司/旋转式摇床/精密恒温仪/浙江轻工业研究所/:j l N a e m8R台式高速冷冻离心机J北京医用离心机厂Kb8c培养基b8c8b平板及斜面培养基H@n:I牛肉膏m J蛋白胨Q J酵母膏R J o,V+i J琼脂R a J 7g h8a Kb8c8c增殖培养基H@n:I弹性蛋白i J酵母膏a8N J葡萄糖N J pR g f q R N J p g R f q m i J T@d q m r h g R q a8N J7g h8a Kb8c8s初筛弹性蛋白选择性培养基H@n:I弹性蛋白t J葡萄糖N J酵母膏N J pR g f q R N J p g R f q m a8i J T@d q m r h g R q a8N J琼脂R a J 7g h8a Kb8c8u发酵培养基H@n:I酪蛋白;a J葡萄糖m a J玉米提取液R J pR g f q R N J T@d q m rh g R q a8N J7g h8a Kb8s培养方法b8s8b种子斜面及平板培养;hv培养R m W Kb8s8c复筛发酵培养发酵培养基R a G:盛于R i a G:三角瓶中J接种后在旋转式摇床上;R w;hvJ转速N t a=n G?>J发酵培养R m W K b8s8s发酵条件研究发酵培养基R a G:盛于R i a G:三角瓶中J按i x的接种量接种子培养基后在旋转式摇床上;R w;hvJ N t a=n G?>培养R m W Kb8u实验方法b8u8b胞外弹性蛋白酶产生菌的筛选方法采集到的样品先经增殖培养基培养m t W后J 稀释涂布于牛肉膏平板形成单菌落J再点种于弹性蛋白选择性培养基上进行初筛K选择细菌水解弹性蛋白所形成的透明圈直径与菌径之比较大的菌落进行摇瓶发酵复筛J测定发酵液弹性蛋白酶活力Kb8u8c菌种鉴定方法根据y一般细菌常用aQ浙江大学学报H农业与生命科学版I第R P卷鉴定方法!和"#$%#$&’细菌鉴定手册第八版对试验菌属的特征进行鉴定()&*+,-./.0生物量的测定生物量的测定方法见文献(1+,-././弹性蛋白酶活性测定方法采用23453$(6+法并参照我国现行药用弹性蛋白酶测定方法加以改进,该法以与染料偶联的不溶性底物经酶作用而溶解至水相&反应上清液的光密度反应底物被酶消化的程度,称取789%刚果红:弹性蛋白溶于;9<水中&加;9< =>6.)&8.79?@A<的硼酸缓冲液&取;9<适当稀释的酶液于B6C下振荡反应789D E&加入=>1.8F8.69?@A<磷酸钠缓冲液79<终止反应&过滤后取上清液测)G*E9处的光密度&以不加酶液和底物的反应系统为空白,在此反应条件下溶解;9%刚果红:弹性蛋白底物所需的酶量定义为一个弹性蛋白酶活性单位H I J,参照23453$方法进行制作标准曲线,7结果和讨论K.-菌株筛选从土壤和污水中采取土样和污水;88余份&采用增殖培养基富集培养&稀释涂布于牛肉膏蛋白胨平板形成单菌落&然后挑取近7888个单菌落于弹性蛋白选择性平板上&培养7)L )M5&挑取水解圈直径与菌落直径比值大于7的菌落进行摇瓶复筛,在近7888个菌落中有;M8多株能产生弹性蛋白酶&经反复发酵复筛得到;7B株产酶较稳定的菌株&选取其中比值大于B的菌株复筛测酶活&其中发现B号和7G 号菌株产酶最高且稳定&将这两菌株分别编号为N<:B和N<:7G,B号菌株7)5复筛酶活达到18I A9<,经过平板上B次自然分离&其酶活达;88I A9<,该菌株在弹性蛋白平板上培养)M5时所形成的水解圈见图;,我们选取B 号作为下一步研究的菌株,K.K菌株鉴定N<:B菌的形态特征为杆状&形成芽孢&芽孢椭圆或柱状&中生或近端生&有鞭毛&无荚膜&平板生长菌落不规则状,生理生化反应为革兰氏阳性&接触酶阳性&好氧&发酵产酸&经鉴定属图-O P Q R S S T U V W.X Y Z0菌株在[.\]的弹性蛋白平板上/\^培养产生的水解圈_D%.;N@3’‘?@a‘D434‘D b D‘a?c d e f g h h i j’=.N<:B’‘$3D E?E8.M]#@3’‘D E3%3$=@3‘#’3c‘#$)M5D E4k l3‘D?E芽孢杆菌属H d e f g h h i j’=.J,K.0菌株O P Q R S S T U V W.X Y0产生弹性蛋白酶的条件K.0.-不同碳源对产酶的影响在产酶基础培养基中试验了浓度为)]的G种碳源&在摇床上培养7)5后&分别测菌体生物量及酶活,结果表明H表;J&葡萄糖效果最好&其次为果糖和糊精,麸皮作为一种廉价的替代碳源也具有较高的产酶水平,其可能原因是麸皮中含有促进弹性蛋白酶分泌的物质,实验结果还发现菌体生物量与酶活间相关性不显著&其中葡萄糖和果糖F糊精的差别不大&考虑到果糖和糊精的价格&选用葡萄糖作为后续试验碳源,表-不同碳源对产酶的影响m3l@#;N c c#4‘?c b3$D?k’43$l?E’?k$4#’?E#@3’‘3’#=$?n k4‘D?Eo3$l?E’?k$4#N@3’‘3’#34‘D b D‘a AI p9<q;"D?93’’Ar s188t*8 u@k4?’#s#v‘$D E_$k4?’#2k4$?’#u@a4#$?@2?@k l@#’‘3$45o?$E’‘##=@D w k D n H o2<Jx5#3‘l$3E H x"Jy D4#c@?k$H y_J6;686818)*)8)*1*)88.6*)8.)688.B188.);M8.)M88.**78.)G78.)M88.*)8K.0.K不同氮源对菌体生物量及产酶的影响在基础培养基中分别加入B]的不同种类氮;1第;期陈启和&等弹性蛋白酶产生菌的筛选及其发酵条件的初步研究源!培养"#$后!测菌体生物量及酶活%结果表明&表"’!黄豆饼粉效果最佳!其次为酪蛋白%许多研究已发现!多数能分泌胞外蛋白酶的菌株!在有机氮源上都可以良好生长%而酪蛋白仅能提供部分营养!豆饼粉不仅能提供丰富的氮源!还能供给较多的(族维生素和微量元素%从实验结果还表明!无机氮源不利于菌株产弹性蛋白酶!其原因可能是使用的无机氮源属于生理酸性或碱性盐类!而影响产酶环境的)*!引起细胞生长与产酶环境的剧烈变化%表+不同氮源对产酶的影响,-./0"122034526-7859:;8475<0;:59730:5;0/-:4-:0)75=93485;>8475<0;:597301?@A B C DE F(85C -::@G H I J JK"L &>*#’"M G #>->G N A 70-,7O )45;0P 0)45;0(0020Q 47-34R 0-:40Q 47-34S -:08;M 5O .0-;2/597&M T’J L J N L #L "L N L L L I LJ U "I J J U N #J J U J N "J U N N L J U L I F J U N "V J U ##W J U I X F F U J J V+U Y U Y 碳源Z氮源和生长因子的合适浓度对产酶的影响在基础培养基中!用葡萄糖Z 豆饼粉和玉米提取液进行正交试验&D V N #’!以求得三者较适浓度%表Y 三因子正交&[\Y Y’试验结果和分析结果,-./0N ]0:9/4:52574$5<5;-/=0:8<;520Q )078C 0;4&D VN N’,0:4;9C .07?&</935:0’(&M T ’S &S M D ’H&6-3-;4’1?@A B C DE FF F &"^’F &F ^’F &J U F ^’F X X "F """I L N F N N N X J #"&#^’F "&J U "^’N #L L ""&N ^’N F X V I "N F "W L W N &I ^’F N &J U N ^’"F J #X N "F N V L V N N &L ^’"F F "J]#U F I I W F U I I N N J U V V N N "U V I J ]_N U W L "X F U #V X F J U X V #W "U I I IT"U J I J VJ U N J V FJ U F J I J注‘S M D ‘357;:400)/8a 98=b M T ‘:5O .0-;2/597对上述试验结果进行分析可知‘c 第V 个处理组合为最优组合!即在基础培养基中!以I ^的葡萄糖Z L ^的豆饼粉和J d F ^的玉米提取液为生长因子时酶活力最高b eN 个因子中!葡萄糖对产酶影响最大!其次是豆饼粉!生长因子的影响最小!说明该菌可能具有合成生长因子的能力b f 在N 个因素的不同处理水平之间可知其最佳处理组合为葡萄糖I ^Z豆饼粉L ^Z 玉米提取液J d "^%具体分析结果见表N d+U Y U g 摇瓶装量对产酶的影响在"L J C D三角瓶中装入"J C D Z N J C D Z #J C D Z L J C D ZI J C D 上述优化的产酶培养基%从实验结果可知!其酶活分别为F F J Z F J I Z V F Z X F Z W #A @C D !随着摇瓶装液量的降低!其产酶水平逐渐升高!"J C D 时产酶水平最高%考虑到再降低培养基装量会带来较大的实验误差!因此选用"J C D 为发酵培养基的装量%+U Y U h 初始)*的影响采用不同初始)*的发酵培养基进行研究!发现当培养基的初始)*为WU L 时产酶活力和生物量最高&图"’%说明在中性偏碱性的环境下有利于酶的分泌%卷等弹性蛋白酶产生菌的筛选及其发酵条件的初步研究取出后立即置于冰浴中!用"#$%&’()的硼酸缓冲液调*+至,#-!再测定酶活!以*+,#-时的活力为.""/计!计算相对酶活!见图012!可知该酶在碱性范围内较稳定!这与已报道的芽孢杆菌产弹性蛋白酶一致3其可能解释是碱性环境最有利于刚果红1弹性蛋白上负电离子的形成和弹性蛋白酶对底物的结合和降解3 4#5金属离子和螯合剂对酶活的影响在测定酶活的反应体系中添加不同的金属离子至终浓度"#6%%&’()!考察它们对酶活性的影响3结果表明!在该浓度下!金属离子7’689:;$89<=$8严重抑制酶的活性!而>?689@89)A$8能提高酶的活力!:B$8在该浓度下对酶活没有激活作用!其原因可能是钙离子浓度太低!不足以起激活作用3C D E7能抑制酶活力3这与国外已经报道的芽孢杆菌产生弹性蛋白酶的酶性质有所区别!特别是>?68对酶活的影响3-结论本研究从特殊环境中分离到一株产中性弹性蛋白酶的芽孢杆菌!其初步酶活达.""F(%)!经培养基优化后酶活达到.$"F(%)!比国内报道的酶活要高!且首次分离到产弹性蛋白酶的芽孢杆菌!具有工业化生产前景和应用的潜力3对该酶的性质进行了初步研究!发现酶的酸碱特性9温度特性以及激活或抑制特性都与以前报道的弹性蛋白酶不一致3弹性蛋白酶是一种经济价值较高的蛋白酶种!作为生化药物!它可参与机体内血管弹性纤维蛋白代谢和维持血管弹性等重要功能!同时具有促进胆固醇代谢与排泄!激活脂蛋白脂酶等改善脂质代谢的作用3此外!在食品工业9环境保护和化妆品生产上具有广泛的应用前景3目前该酶在日本已实现微生物工业化生产!而且已克隆了相关的微生物基因!并在大肠杆菌中得到了表达!但表达产量还不高3在国内!该酶仅从脏器中提取!成本高!产量有限!限制了该酶的广泛应用3G H I H J H K L H M NO.P Q7R<A1S A=T!U F7R U;&1V A&=T W颜子颖!关国雄X Y Z[;\S A=TB\]B=^?%?=[&_?’B‘[B‘?_a&%bA^a&&a T B=A‘%O c P#d e f g h i h j k l m g n o k pqf r m k s f k o k t u W微生物学通报X!.v v.!.w W x X N60x160v#W A=:y A=?‘?XO$P bB=\B’!:&y?=#2B^[?a A B’C’B‘[B‘?#z#z‘&’B[A&=!{;a A_A^B[A&=!{a&*?a[A?‘O c P#|m r e#}f k r e h~#}f k!e u i!.v x"!v.N-,106#O6P:7"c;=!:+C R Q;B=!)z U;A1_B=T!h#n o#W曹军!陈源!李桂芳!等X#Z[;\S&={a&\;^A=TC’B‘[B‘?$A[ybA^&a&a T B=A‘%O c P#j#qf r m k s f k o k t u W微生物学杂志X!.v v x!.x W6X N v1.$#W A=:y A=?‘?XO-P E y?z=‘[A[;[?&_bA^a&%A&’&T S!:y A=?‘?7^B\?%S&_ Z^A?=^?#&e h’(h g#f p f r n#f k g qh#e k(k o k t u p k m)h g h m n o}n r#h m f k o k t u O b P#2?A*A=T N Z^A?=^?{a?‘‘!.v,w#v w1.v6#O0P{?[?a+7!Z=?B[yR A^y&’B‘!ZbB A a!h#n o#}h m t h u+i qn g l n o k p,u i#h~n#f r}n r#h m f k o k t u O b P#2?A*A=T NZ^A?=^?{a?‘‘!.v w-#O x P Q7R<A1S A=T!U F7R U;&1V A&=T!<+7R U-?A1.A=!h# n o W颜子颖!关国雄!张维钦!等X Y Z[;\A?‘&=C’B‘[B‘?>a&%>’B]&%B^[?a A;%N Z[a B A=‘^a??=A=T B=\?=/S%?*;a A_A^B[A&=O c P#|r#nqf r m k s f k o k t f r n,f g f r n W微生物学报X!.v v0!60W.X N0"10,#W A=:y A=?‘?XO,P Z B^y B a)7#{y&[&%?[a A^%?[y&\_&a?‘[A%B[A&=&_ ?’B‘[B‘?B^[A]A[S O c P#0m k r#,k r#12!h#f#}f k o#qh(!.v00!v"N6$6#-x浙江大学学报W农业与生命科学版X第$v卷。