人抗凝血酶_AT_在巴斯德毕赤酵母中表达与纯化
人溶菌酶在毕赤酵母中的表达及体外抑菌活性研究
人溶菌酶在毕赤酵母中的表达及体外抑菌活性研究
人溶菌酶是一种能够破坏细菌细胞壁的酶类蛋白，在医学领域被广泛应用于消化系统
疾病和感染性疾病的治疗中。
然而，人溶菌酶的制备技术还存在一些问题，例如制备成本高、生产周期长、难以大规模生产等。
因此，寻找一种高效、便捷的生产方法就显得尤为
重要。
而毕赤酵母优秀的表达系统和相对简单的培养可以为人溶菌酶的生产提供新的思路。
本研究通过构建含有人溶菌酶基因的毕赤酵母表达载体，并通过质粒转化的方式将其
导入毕赤酵母中，以达到在毕赤酵母中表达人溶菌酶的目的。
在完成酵母工程的基础上，
我们对毕赤酵母中表达的人溶菌酶进行了体外抑菌活性的研究。
首先，我们对表达的人溶菌酶进行了酶学鉴定，结果显示表达的蛋白质具有溶菌酶酶
学特性，说明载体成功导入毕赤酵母并表达了人溶菌酶。
接下来，我们研究了不同表达条
件（包括温度、pH值、培养时间）对人溶菌酶表达和活性的影响。
结果表明，在30℃、
pH值为6.5-7.0、培养时间为48小时的条件下，人溶菌酶的表达和活性均能达到最大值。
此外，在表达过程中添加1mmol/L的CaCl2可以提高人溶菌酶的表达量和活性。
最后，我们进行了体外抑菌实验，通过测试人溶菌酶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的
杀菌效果来评价它的体外抑菌活性。
结果显示，在添加人溶菌酶的情况下，大肠杆菌和金
黄色葡萄球菌的菌落数显著降低，说明表达的人溶菌酶具有较强的体外抑菌活性。
人ω干扰素在毕赤酵母中的表达和纯化
人ω干扰素在毕赤酵母中的表达和纯化蒙翠凤;饶晓璐;郑成已;王世媛;陈清西【摘要】ω干扰素(IFN-ω)是同IFN-α功能相近但抗原性不同的一类干扰素分子,它具有同IFN-α、IFN-γ以及肿瘤坏死因子α相似的抑制病毒复制的作用.采用5L 发酵罐发酵表达IFN-ω,发酵培养液经超滤膜浓缩、SP层析柱梯度分离,得到糖基化的IFN-ω,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI TOF-TOF MS)和N 端蛋白序列分析仪分析其分子质量和N端序列,用细胞病变抑制法测定活性.结果表明,诱导约48 h时,目的蛋白表达量最高,通过SP梯度洗脱,可将糖基化和非糖基化的IFN-ω分离,质谱分析糖基化蛋白样品,质谱峰为糖基化蛋白特有的峰.纯化后糖基化的IFN-ω抗病毒活性为1.46× 108 U/mL.%IFN-w is a kind of interferon molecules, which has similar function but different antigenicity to IFN-a. It can inhibit virus replication like IFN-a, IFN-y and tumor necrosis factor alpha. 5 L fermenter was used to ferment and interference was expressed. Then,the glycosylated interferon a> was purified by a procedure stepped by ultrafiltration and gradient elution SP chromatography column. Its molecular weight and N amino acid sequence were analyzed by MALDI TOF-TOF MS and the N protein sequence analyzer, respectively. In addition,IFN-a) activity was determined by cell changes suppression method. The results showed that IFN-w expression level reached to highest in induced 48 h. The glycosylated and unglycosylated IFN-co could be separated by SP gradient elution completely. The glycosylated IFN-w showed a series of continuous peaks by mass spectrometry,which is thecharacteristic peak of glycosyl protein. The antiviral activity of the purified glycosylated IFN-w was 1. 46X108 U/mL【期刊名称】《厦门大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(051)006【总页数】5页(P1074-1078)【关键词】IFN-ω;表达;纯化;N端测序;活性测定【作者】蒙翠凤;饶晓璐;郑成已;王世媛;陈清西【作者单位】厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门特宝生物工程股份有限公司,福建厦门361022;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门特宝生物工程股份有限公司,福建厦门361022;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005;厦门特宝生物工程股份有限公司,福建厦门361022;厦门大学生命科学学院,细胞应激生物学国家重点实验室,福建厦门361005【正文语种】中文【中图分类】TQ929+.1干扰素（IFN）是一族由多种细胞产生的，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白［1］.根据产生细胞、受体和活性等综合因素可将IFN分为2种类型：Ⅰ型IFN又称为抗病毒IFN，生物活性以抗病毒为主，有3种分子形式：IFN－α、IFN－β和IFN－ω；Ⅱ型IFN 又称免疫IFN［2］，主要是指IFN－γ.IFN－α、IFN－β和IFN－ω的受体为同一种分子，表达在几乎所有类型的有核细胞表面，因此这些IFN的作用范围十分广泛［3］.IFN－ω是同IFN－α功能相近但抗原性不同的一类IFN分子，它具有同IFN－α、IFN－γ以及肿瘤坏死因子α相似的抑制病毒复制的作用［4］，目前，IFN－α已广泛应用于抗病毒、抗肿瘤的治疗，效果显著，而有关IFN－ω的研究报道则较少［5］，有研究表明IFN－ω有比IFN－α更强的抗病毒活性［6］.由于IFN－ω具有较强的抗病毒复制、抗细胞增殖和免疫调节等生物活性，而且IFN－ω 与IFN －α、IFN－β、IFN－γ 的抗原特性不同［7］，不会与IFN－α、IFN－β、IFN－γ 的抗血清或单克隆抗体发生交叉反应［8］，因此，该细胞因子有望用于治疗多种肿瘤、病毒性疾病以及对IFN－α、IFN－β或IFN－γ耐药的患者［9－10］.目前，国外已有采用多种表达系统制备IFN－ω的报道，其中既有大肠杆菌（Escherichia coli）原核表达系统，也有酵母细胞真核表达系统，均表达出具有生物活性的IFN－ω，而国内关于IFN－ω的报道和研究仍很少［11］.齐连权等在毕赤酵母中分泌表达IFN－ω，但表达量较低，只有10mg／L左右［12］.糖基化是真核细胞中常见和复杂的翻译后修饰方式之一，具有重要的生物学意义，糖蛋白的糖链能修饰并改变蛋白的内在特性，在决定蛋白质的多种生物学功能并且能保护蛋白质免受热力学降解方面发挥重要作用［13］.因此，本文构建了IFN－ω 毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统，筛选得到了较高表达量的转化子，表达约为80mg／L，经层析柱纯化，获得糖基化的IFN－ω，并对糖基化的IFN－ω进行质谱分析、N端测序及对其活性进行了初步的检测.1 材料和方法1.1 材料毕赤酵母工程菌 GS115（IFN－ωPAo815sm），由本实验室构建并保存；酵母提取物和蛋白胨为英国Oxoid公司产品；丙烯酰胺为Promega公司产品；SP Sepharose Fast Flow 填料为 GE Healthcare公司产品；IFN－ω标准品为Ebioscience公司产品；人羊膜细胞（WISH）为美国ATCC公司产品；水泡性口炎（VSV）病毒为美国ATCC公司产品；其他试剂均为国产分析纯.主要仪器：5L全自动发酵罐，德国B.Braun Biotech公司；全温振荡器，哈尔滨东明医疗器械厂；离心机，Beckman公司；P2B005A01超滤膜，Millipore公司；Basic 100蛋白纯化仪，GE Healthcare公司；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI TOF－TOF MS），Bruker公司；N 端蛋白序列分析仪（PPSQ－31），日本岛津公司；M2e酶标仪，MD公司.1.2 方法1.2.1 IFN－ω的发酵表达发酵条件参考文献［14］，将保藏菌株划线于酵母膏胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基（1%（质量分数，下同）酵母粉，2%（质量分数，下同）蛋白胨，1%（质量分数，下同）葡萄糖，1.8%（质量分数，下同）琼脂糖）上，28～30℃ 生化培养箱培养 36h，得 GS115（IFN－ω PAo815sm）单菌落.从YPD琼脂培养基上挑单菌落，接入1L三角瓶装的300mLYPD液体培养基（1%酵母粉，2%蛋白胨，1%葡萄糖）中，于200r／min 28～30℃摇床培养18h.按体积分数为10%的接种量接种，即接300mL摇瓶种子到含3 000mL酵母膏胨甘油（BMGY）培养基（1%酵母粉，2%蛋白胨，1.34%（质量分数）无氨基酵母氮源（YNB），1%（质量分数）甘油，0.4 mg／L生物素）的5L发酵罐中，参数控制：温度为28℃，pH值为6.30，溶氧为20%～30%，转速：与溶氧联动（起始最低转速150r／min）.当甘油消耗尽时（根据溶氧急剧上升判断为甘油消耗尽），补加30mL 80%（体积分数，下同）甲醇诱导表达，此后按20mL／h的流速连续补加80%甲醇，发酵过程以质量分数为14%氨水调pH值，每隔3h取5mL培养液离心取上清电泳，共诱导51 h，发酵结束离心收集发酵上清.取不同时间发酵上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，质量分数为14%聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS－PAGE），最后收集的发酵上清用于进一步纯化.1.2.2 IFN－ω的纯化超滤浓缩：用平衡缓冲液（100mmol／L NaAc，pH 6.0）将 MilliporeP2B005A01超滤膜平衡，超滤浓缩发酵上清20倍，加入等体积的平衡缓冲液替换，如此重复替换10次，最后将蛋白缓冲液体系替换成平衡缓冲液体系.强阳离子交换柱（SP）层析柱分离：A液：100 mmol／L NaAc，pH 6.0，B液：400mmol／L NaAc，pH 6.0；将超滤样品上样于Φ18mm×200mm SP Sepharose Fast Flow层析柱，然后以5mL／min流速用 A液冲洗3个柱体积冲洗未挂柱蛋白，用30%（体积分数，下同）B冲洗3个柱体积，收集30%B洗脱峰样品并电泳检测.梯度洗脱：以流速2.5mL／min，30%B→100%B，200min线性梯度洗脱，分管收集洗脱样品.收集样品分别取样进行SDS－PAGE.1.2.3 IFN－ω质谱鉴定分子质量利用 MALDI－TOF－TOF MS，Daltonics autoflexⅢ，Bruker测定Ⅱ峰样品的分子质量，线性阳离子模式（LP＿ProtMix），离子加速电压为20kV.取样品1μL与含0.1%（体积分数）三氟乙酸的70%（体积分数）乙腈溶液的饱和α－氰基－4－肉桂酸溶液（HCCA）1 μL充分混合，取1μL点样，待自然干燥后质谱分析.1.2.4 IFN－ω氨基酸序列分析采用Edman降解法测定II峰样品的N端15个氨基酸序列，N端蛋白序列分析仪可自动显示测序峰.1.2.5 IFN－ω活性测定参照文献［15］用细胞病变抑制法测定活性：37℃、5%（体积分数，下同）CO2贴壁培养人羊膜（WISH）细胞，并扩增，消化、收集细胞，将细胞配制成浓度为3×105 mL－1的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，培养至形成均匀的细胞单层.用杜尔贝科改良型（DMEM）完全培养液稀释IFN－ω标准品、自制IFN－ω，4倍梯度稀释，共8个梯度，每个梯度2复孔.将稀释好的IFN－ω标准品、自制IFN－ω加入细胞培养液中保护细胞，同时设置阴性对照组，于37℃，5%CO2培养18～24h.弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入100μL含100组织半数感染剂量（TCID50）的水泡性口炎病毒（VSV）病毒攻击细胞，于37℃，5%CO2培养24h.弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入结晶紫染色液30μL，室温放置30 min后，冲去染色液，加入脱色液100μL，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度.计算IFN－ω的活性.2 结果2.1 IFN－ω的发酵表达用SDS－PAGE检测发酵过程不同诱导时间样品，结果表明发酵上清中主要有两条蛋白条带，一条蛋白分子质量约为23ku，该蛋白相对分子质量大于IFN－ω理论分子质量，推测可能为糖基化所致（在目的蛋白的氨基酸序列中，有一个潜在的糖基化位点Asn78－Met79－Thr80），另一条蛋白分子量约为20ku，可能为非糖基化的IFN－ω，整个发酵过程中糖基化IFN－ω比非糖基化IFN－ω的表达量高（图1）.图1 IFN－ω的发酵培养液上清电泳结果Fig.1SDS－PAGE analysis of IFN－ωfermentation在发酵过程，蛋白的总表达量随着诱导时间的延长而增加.诱导27h前，非糖基化的IFN－ω的表达量高于糖基化的IFN－ω，诱导27h后糖基化的IFN－ω的表达量快速增加，而非糖基化的IFN－ω的表达量增加量较少，可能是因为随着发酵时间的延长，各种代谢产物逐渐累积，代谢产物的累积会对蛋白有降解作用，猜测糖基化的IFN－ω比非糖基化的IFN－ω的稳定性好，比较不容易降解，所以表现为糖基化的IFN－ω增加较多.在诱导33h后糖基化比非糖基化的IFN－ω表达量高，在诱导48h时糖基化和非糖基化的IFN－ω表达量均达到最高，51h的表达量与48h的表达量基本一致，表达量不再增长，说明诱导48h时表达量达最高，随后维持相对稳定，这可能与随着发酵时间的延长，各种代谢产物的累积对蛋白表达和累积有影响.通过电泳估算，在诱导48h时，糖基化和非糖基化的IFN－ω的总表达量约为80mg／L.2.2 IFN－ω的纯化超滤结果：IFN－ω的发酵培养液上清通过超滤得到浓缩（电泳结果如图2）.用毕赤酵母表达IFN－ω的培养上清中含有较少的背景蛋白，主要的杂质为色素、盐等，采用超滤方法来初步纯化，可达到快速去除色素、浓缩蛋白、降低蛋白体系中的电导的目的.SP Sepharose Fast Flow 层析柱分离结果（如图3）：30%B洗脱出一个峰（Ⅰ峰），收集1号管，经30%B→100%B，200min线性梯度洗脱得到两个峰（如图中Ⅱ峰和Ⅲ峰），其中2～5号管收集为Ⅱ峰，6～7号管收集为Ⅲ峰.SDS－PAGE检测结果（图4）：1号管样品主要为杂蛋白；2～5号管主要蛋白分子质量约为23 ku，为糖基化的IFN－ω，其中5号样品含有极少量的约20ku的非糖基化的IFN－ω；6号管样品含有糖基化和非糖基化的IFN－ω，7号管样品为非糖基化的IFN－ω.从图可以看出，通过梯度洗脱，糖基化和非糖基化的IFN－ω已得到有效分离，Ⅱ峰主要为糖基化的IFN－ω，Ⅲ峰主要非糖基化的IFN－ω.图2 IFN－ω超滤样品电泳结果Fig.2SDS－PAGE analysis of IFN－ωultrafiltration图3 IFN－ωSP液相分离图谱Fig.3Liquid chromatogram of IFN－ωSP2.3 鉴定分子质量及N端测序用autoflexTOF／TOF质谱仪分析SPⅡ峰样品，质谱图如图5.质谱分析得到的质谱峰并非一尖峰，而是一簇宽峰，这是由于糖蛋白糖基化的不均一性导致峰形展宽，所得的质谱峰约在23ku附近，其测定结果约比理论值（19 984.2u）大3 000u，猜测这是由于IFN－ω的Asn78糖基化所致.图4 IFN－ωSP液相分离样品电泳结果Fig.4SDS－PAGE analysis of IFN－ωSPN端测序结果15个氨基酸及排列顺序为：EAEACDLPQNHGLLS.图5 糖基化的IFN－ω质谱分析图谱Fig.5Mass spectrogram of glycosylation IFN－ω2.4 活性测定活性测定结果：应用 WISH－VSV细胞病变抑制法测定糖基化IFN－ω的活性，分别以IFN－ω标准品、IFN－ω待测品作标准曲线，四参数回归计算法进行处理，结果显示纯化后的糖基化IFN－ω抗病毒活性良好，ED50约小于40pg／mL，糖基化IFN－ω活性约与标准品活性相当，通过下列公式计算，抗病毒活性换算后为1.46×108 U／mL：待检样品效价（生物学活性）（U／mL）＝其中：C1为待检样品相当于标准品半效量的稀释倍数；C2为标准品半效量的稀释倍数；D1为待检样品预稀释倍数；D2为标准品预稀释倍数.3 讨论本文采用毕赤酵母表达IFN－ω，酵母是生产真核异源蛋白的宿主菌，易于遗传操作，兼有原核生物生长特性及真核蛋白的翻译后加工修饰特点.巴氏毕赤酵母在表达外源蛋白时具有可高密度培养、表达量高、稳定性高、能对所分泌的蛋白进行N－和O－糖基化修饰、适应性强、易于处理、自身分泌的蛋白较少等优点［16］，毕赤酵母在生物量扩增阶段，只需少量的抑制物，通常为甘油，既可以满足细胞生长又能有效抑制外源基因表达，在表达阶段，只需让细胞耗尽剩余的甘油，再加入甲醇诱导即可，这样高密度连续培养可以提高表达量.由于毕赤酵母自身分泌的蛋白质量很低，在培养上清中，重组蛋白的比例就相对较高，为蛋白质纯化建立基础［17］.由于该表达系统的诸多优点，人们越来越多地利用它作为外源基因的表达系统来生产目的蛋白.毕赤酵母表达IFN－ω的培养上清中含有较少的背景蛋白，主要的杂质为色素、盐等，但培养液的体积较大，因此实验过程第一步采用超滤膜来捕获目的蛋白，可达到快速去除色素、浓缩蛋白、降低蛋白体系中的电导的作用，SP层析分离过程通过延长洗脱梯度即可将糖基化和非糖基化的IFN－ω较好地分离，得到具有较高生物活性的糖基化IFN－ω.糖基化是蛋白质的一种重要的翻译后修饰，蛋白质糖基化的一个重要特点是不均一性，即在糖基化发生过程中会产生一系列结构相关的糖链（微不均一性）以及同一糖蛋白中的不同糖基化位点连接有不同的糖链（点不均一性），同时由于糖基化的发生由糖基化相关的几种酶协调作用完成的，受各种生理生化条件的影响很大，造成即使同一个位点也会有糖基化程度［18］.质谱分析糖基化的IFN－ω，质谱图谱峰并非单一的尖峰组成，而是一簇宽峰，这是由于IFN－ω的糖基化的不均一性导致峰形展宽.本实验为进一步研究IFN－ω的结构和生物学特性、发掘其药物价值以及IFN－ω的生产奠定了基础.【相关文献】［1］李臣宾.IFN－ω的研究进展［J］.国外医学免疫学分册，2005，28（1）：7－9.［2］Bekisz J，Schmeisser H，Hemandez J，et al.Human inter－ferons alpha，beta and omega［J］.Growth 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人组织因子在毕赤酵母中的表达和纯化
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人 组 织 因子在 毕 赤 酵 母 中的表 达 和 纯化
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人抗凝血酶Ⅲ研究进展
人抗凝血酶Ⅲ研究进展刘倩;符潮;唐青海;杨海【摘要】人抗凝血酶Ⅲ(Human Antithrombin,hATⅢ)是机体抗凝系统发挥其生理功能的主要因子,对血液循环、血浆渗透压平衡、止血抗凝、抗炎等机制均具有重要作用,与各种疾病的表征高度相关.该文综述了hATⅢ 的基因结构、蛋白结构、生物功能以及其重组表达等方面的研究进展,对hATⅢ 的研究进行了展望,旨在为hATⅢ 研究工作者提供参考.【期刊名称】《衡阳师范学院学报》【年(卷),期】2018(039)003【总页数】5页(P128-132)【关键词】人抗凝血酶Ⅲ;基因结构;蛋白结构;生物功能;重组表达;研究进展【作者】刘倩;符潮;唐青海;杨海【作者单位】衡阳师范学院生命科学与环境学院,湖南衡阳 421008;赣南师范大学生命与环境科学学院,江西赣州 341000;赣南师范大学生命与环境科学学院,江西赣州 341000;衡阳师范学院生命科学与环境学院,湖南衡阳 421008;衡阳师范学院生命科学与环境学院,湖南衡阳 421008;赣南师范大学生命与环境科学学院,江西赣州 341000【正文语种】中文【中图分类】Q939.92抗凝系统与纤溶系统是机体内对立统一的生理功能系统，也是维持血液动态平衡的生理机制。
作为抗凝系统发挥生理功能的主要因子，人抗凝血酶Ⅲ(Human antithrombin，hATIII)是由432个氨基酸残基组成的糖蛋白，它可与凝血系统中的多种酶类结合，使其活性得到抑制[1]，从而发挥抗凝作用，因此血浆中hATIII的含量是判断血栓形成的重要依据之一。
hATIII对血液循环、血浆渗透压平衡、止血抗凝等机制具有重要作用，与各种疾病的表征高度相关[2]，在临床医学研究中受到广泛关注。
近年研究发现，hATIII除了具有强大的抗凝功能外，还具有抗炎、抗菌、抗血管生成等重要功能，成为血液疾病和新药研究的热点。
本文综述了hATIII的基因结构、蛋白结构、生物功能以及hATIII重组表达的研究进展，旨在为人抗凝血酶及抗凝系统机理的研究提供参考。
毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化
巴 斯 德 毕 赤 酵 母 （Pichia pastoris）是 在 酿 酒 酵 母 表达体系的基础上， 用其他的酵母菌株构建的、可 高效稳定表达外源基因的新表达系统，即甲醇营养
型 酵 母 （Methy-lotrophicyeast）表 达 系 统 [1]。 作 为 第 2 代酵母表达系统，它不仅克服了大肠杆菌表达系统 不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白不能分泌 到细胞外、背景蛋白多、表达水平低等缺点，并且弥 补了哺乳类细胞、 昆虫细胞表达系统操作复杂、表 达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，此外，还具 有 其 他 酵 母 表 达 系 统 无 法 比 拟 的 优 越 之 处[2]。
亲 和 层 析 （Affinity Chromatography，AFC）是 利 用
2009 年第 3 期
高炳淼等：毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化
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偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附 目标产物，使目标产物得到分离纯化的方法。 它具 有很高的选择和分离性能以及较大的载量，只需要 一步处理即可使某待分离的生物大分子从复杂的 混合物中分离出来，达到千倍以上的纯化，并保持 较 高 的 活 性[15]，是 分 离 纯 化 以 及 分 析 生 物 大 分 子 尤 其 是 蛋 白 质 的 有 力 工 具 。 自 从 1967 年 Axen 等[16]用 溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法成功 制 备 了 固 定 化 酶 ，此 后 亲 和 层 析 在 20 世 纪 70 年 代 有了迅速的发展，目前已得到广泛应用。
2 主要纯化的方法
重组蛋白的分离纯化与传统方式相似，也是利 用其物理和化学性质的差异，即分子的大小、形状、 溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和 性 等 性 质 建 立 起 来 的 （表 1）[7]。 从 表 1 可 看 出 ，高 纯 度的蛋白质主要是依靠色谱法技术得到的。 由于重 组蛋白在组织和细胞中仍以复杂混合物的形式存 在，因此到目前为止还没有一个单独或一整套现成 的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离 出来，而只能依据目标蛋白的物理化学性质摸索一 套综合的分离程序，以获得较高纯度的蛋白产品。
巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展
巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展作者：方园园来源：《绿色大世界》2009年第12期摘要:经过近20年的不断开发和完善,巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)已经成为目前最成功的真核表达系统之一,被广泛用于医药生产、饲料添加剂开发和科学研究。
介绍了毕赤酵母的生物学特性、常用菌株和表达载体的特点及其研究进展,并阐述了其在外源蛋白的表达方面具有的独特优势。
关键词:毕赤酵母;表达载体;外源蛋白中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1005-569X(2009)12-0037-031 引言巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)是一类在缺乏葡萄糖或甘油时,能利用甲醇做为唯一碳源和能源的酵母菌,具有旺盛的生命力,可以在廉价的非选择性培养基中生长,有较宽的生长pH适应范围(3.0～8.0),有较好的发酵基础,非常有利于实现高密度发酵培养,菌体密度可高达100g干细胞/L,它们生长的适宜温度一般为28～30℃,是常用的外源蛋白表达系统。
2 巴斯德毕赤酵母宿主菌株根据对甲醇利用的情况,P.pastoris可划分为三种表型:第一型,即Mut+型,此型毕赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,在含甲醇的培养基中生长速率与野生型类似,称为甲醇利用正表型。
绝大多数毕赤酵母为Mut+表型,如GS115和SMD1168;第二型,即MutS型,此型毕赤酵母的AOX1基因部分敲除,被酿酒酵母ARG4基因所取代,AOX2虽然与AOX1有97 %的同源性,但在含甲醇的培养基内该型毕赤酵母生长缓慢,称为甲醇利用慢表型,如KM71(his4 arg4 aox1::ARG4);第三型,即Mut-型,此型毕赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,细胞不能进行甲醇代谢,无法在甲醇中生长,为甲醇利用负表型,如MC100-3(his4 arg4 aox1::ARG4 aox2::Phis4)。
后两者表达外源蛋白有时优于野生株,且需甲醇较少,有时其表达量甚至高于Mut+型。
人内皮抑素在毕赤酵母中的表达、纯化与生物功能研究
PQR?J?"?JSJSSSSJSSJ???S???J???S?SJ??SR TQ。为保证在酵母中分泌表达时信号肽正确切割加 上了识别序列R
?"? JSJ SSS SJS 5:U J/U 5L> S8.
JE 液体培养基 %&95 中 T&Z 摇床 #P&8 I 93- 培养 T@= 至 K( _ @ 后按 %’ 接种于 T5 大瓶中的 P&&95 2)JE 液体培养基中 T&Z ， 无菌条件下 #P&8 I 93- 培养 T@=， 加入 T&&95 2)R %&&&. I 93- 离心去掉 2)JE 培养基， )E 培养 基 继 续 培 养 每 隔 #W= 加 入 甲 醇 至 终 浓 度 %’ 并取样 %95， %#’ ;(;R7SJ* 电泳检验找出最佳 表达时间。 ! " !6 蛋白质的纯化 表达上清过滤除去菌体残渣， 用终浓度 \&’ 的 硫酸胺沉淀， %&&&&8 I 93- 离心 #&93- 收集沉淀的蛋 白， 用 &Y% 体 积 的 72; （ %&994/ ）重 悬，用 72; （%&994/） 透析 #W=， 期间换透析液 T 次。用 ;:<=084>: 用 P 倍 柱 床 体 积 含 &Y%94/‘5 ?5@2 装 填 层 析 柱， +0?/， %&994/‘5 "83>R?/ <!\ ] W 的结合缓冲液以流速 透析后的样品按 %PG9 I = 速度上 #&G9 I = 平衡柱子， 样， 用大量的结合缓冲液洗柱， 至 +#^& a &Y&% 用含 &YT94/ I 5， &Y@94/ I 5， %94/ I 5， # 94/ I 5 +0?/，"83>R?/ 用 <!\YW 的 洗 脱 液 梯 度 洗 脱。收 集 各 个 洗 脱 峰， %#’ ;(;R7SJ* 分析鉴定目的蛋白所在的峰。收集 的目的蛋白用 72; （ %&994/） 透析， 吹干浓缩。蛋白 浓度的测定用 2?S 法 （ 73:8G:） ， A #&Z 冻存用于分析 鉴定及生物功能试验。纯化蛋白 ;(;R7SJ* 薄层扫 描分析用本室光密度扫描仪完成。纯化产物的质谱 分析由本院仪器检测中心质谱室完成。纯化产物 + 端 %P 肽分析由北大蛋白测序组完成。 ! " !! 鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验 $ 日龄的鸡胚在气室下方开 & ] PG9# 的小洞露 出尿 囊 膜， 分 别 把 沾 有 &Y# . 6MJM， &Y# . 6MJM b ! ! # （W99 ） 放于尿囊膜 *-14>B0B3- #& . 的无菌滤纸小块 ! 上， 用 无 菌 透 明 胶 封 口， 于 T\Z 孵 箱 中 继 续 培 养 打开鸡胚观察。 W^=，
毕赤酵母高密度发酵菌株优选及分离纯化技术综述
毕赤酵母高密度发酵菌株优选及分离纯化技术综述发布时间：2021-11-01T06:56:24.297Z 来源：《科学与技术》2021年第21期作者：徐倩[导读] 巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一徐倩（义马煤业集团煤生化高科技工程有限公司，河南三门峡，472300）摘要：巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。
巴斯德毕赤酵母是单细胞真核生物，生长快，易于分子遗传学操作；巴斯德毕赤酵母的醇氧化酶I(Alcohol 0xidaSel，A0Xl)基因的启动子具有强诱导性和强启动性，适于外源基因的高水平诱导表达；目的基因整合在染色体上具有高稳定性；可高水平分泌表达重组蛋白，纯化方便；发酵工艺成熟，易放大，且培养成本低，产品易分离。
本文根据生产实践经验，就巴斯德毕赤酵母菌株的研究进展、高密度发酵菌株的优选及分离纯化技术进行了总结和综述。
关键词：毕赤酵母、菌株、优选、分离纯化1.前言1.1背景和意义近年来发酵工程迅速崛起，从“乐百氏奶”等乳酸菌饮料，到比黄金还贵的干扰素等药品，都是微生物对人类的无私奉献。
微生物在发酵过程里充当着生产者的角色，这与它的特性密不可分的。
它们对周围环境的温度、压强、酸碱度、干湿条件都有极强的适应力。
发酵的规模越大，批次所需的种子也就越多。
要使小小的微生物在短时间内完成如此巨大的发酵任务，那就必须使菌种扩大培养。
而扩大培养的前提就是必须要有相对数量、相对稳定、代谢旺盛的种子。
菌种纯化是指从菌种的细胞或孢子群体中淘汰衰退的个体，分离出优良的个体，从而保持菌种的纯度和优良的特性。
以巴斯德毕赤酵母为例：近年来毕赤酵母表达系统极受研究者的青睐，已有300多种外源蛋白在该表达系统中获得表达，主要用于人类药物的生产，还包括来自植物、动物和细菌的各种酶，膜受体蛋白，含辅基的蛋白质以及可用于研究晶体结构的蛋白质等。
它还可以同时表达酶组分比例适当的一个酶系，使全细胞作为生物催化剂。
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人抗凝血酶Ⅲ(AT 2Ⅲ)在巴斯德毕赤酵母中表达与纯化于 群3,贺 敏,宋丽雅,卜凤荣,王全立(军事医学科学院野战输血研究所,北京 100850)[摘要] 目的:在巴斯德毕赤酵母中进行表达及纯化AT 2Ⅲ,以对其功能进行深入研究。
方法:将携带AT 2Ⅲ基因的表达载体电转染G S115细胞,用G 418筛选抗性克隆,S DS 2PAGE 与Western 印迹检测及鉴定表达产物;采用生化法测定AT 2Ⅲ的表达量;利用凝血酶空斑法测定表达产物活性,经过Heparin 2hyperD 柱纯化。
结果:Western 印迹分析发现转移至膜上的表达产物能与抗AT 2Ⅲ单克隆抗体结合,证明成功地表达了AT 2Ⅲ,纯度>95%。
活性测定表明表达产物具有天然AT 2Ⅲ的生物活性。
结论:在巴斯德毕赤酵母中成功地表达与纯化AT 2Ⅲ,得到同天然蛋白相似的比活性人AT 2Ⅲ。
[关键词] 抗凝血酶Ⅲ;毕赤酵母;基因表达[中图分类号] Q786 [文献标识码] A [文章编号] 1000-5501(2004)04-0350-04E xpression and puri fication of recombinant hum an antithrombin Ⅲ(A T 2Ⅲ)in Pichia pastorisYU Qun 3,HE Min ,SONG Li 2Ya ,BU Feng 2Rong ,WANG Quan 2Li(Institute of T rans fusion Medicine ,Academy of M ilitary Medical Sciences ,Beijing 100850,China )[Abstract] Objectives :T o express and purify human antithrombin Ⅲin yeast Pichia pastoris and to evaluate its functions.Methods :The eukary otic expression vector incorporated with AT 2Ⅲgene was trans formed into P.pastoris G S115by electropora 2tion.The trans formants were selected by growth on G 418and detected for AT 2Ⅲexpression by S DS 2PAGE and Western blot.The AT 2Ⅲsecretion levels were estimated by biochemical methods ,AT 2Ⅲbiological activity was assayed by a functional assay respec 2tively.The purified protein was obtained by chromatography :Heparin 2hyperD.R esults :The Western blot analysis showed that the recombinant products could bind to McAb.The recombinant AT 2Ⅲhad natural AT 2Ⅲbiological activity.Conclusion :The re 2combinant human antithrombin Ⅲis success fully expressed and purified in P.pastoris.[K ey w ords] antithrombin Ⅲ;Pichia pastoris ;gene expression [收稿日期] 2004-01-16[作者简介] 于 群(1970-),男,辽宁省旅顺市人,博士,现从事生物制品及DNA 改组研究。
3通讯联系人 抗凝血酶Ⅲ(AT 2Ⅲ)是一种相对分子质量(M r )为58×103的血浆糖蛋白,是血浆中重要的生理性抗凝血因子,在维持血液的凝血与抗凝血平衡中起重要作用。
它还是多功能的丝氨酸蛋白酶抑制剂,承担血浆中70%的生理性抗凝血酶活性。
AT 2Ⅲ在血液凝固级联反应和维持血液流动性方面发挥主要调节作用,它的缺乏易导致血栓形成。
血浆中纯化的AT 2Ⅲ制剂广泛应用在多种疾病的治疗上,如AT 2Ⅲ缺陷(包括先天和后天)、弥散性血管内凝血、再发性凝血疾病、外伤、肝病等,因此,AT 2Ⅲ有着广泛的临床应用前景。
目前临床使用的均是血浆来源的AT 2Ⅲ,但血浆来源的AT 2Ⅲ最终将被重组产品所取代。
其原因为:①血源性病毒传播如肝炎和艾滋病病毒;②血液供应日趋紧张;③治疗费用高昂等。
本研究的目的是利用基因重组技术表达AT 2Ⅲ,为其临床应用奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种和细胞株 E.coli DH5α和G S115细胞由本室保存。
1.1.2 质粒 pPIC9K 购自Invitrogen 公司,PC 2AT 由作者构建。
1.1.3 AT 2ⅢcDNA 从人胎肝钓出,保存在pGE MT 2AT 中。
1.1.4 酶及生化试剂 各种内切酶及工具酶、质粒纯化试剂盒分别购自Promega 公司和Biolabs 公司;纯化AT 2Ⅲ由海南圣宝公司提供;G eneticin (G 2418sulfate ):G ibco BR L 公司;质粒纯化试剂Wizard ○Rplus S V M ini Preps 购自Promega 公司;片段回收试剂盒Wizard ○R plus PCR M ini Preps 由Promega 公司提供;人抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒由上海生物制品研究所提供。
1.1.5 抗体 兔抗人单克隆抗体(一抗)为北京中山公司产品;辣根酶标记山羊抗兔IgG (H +L )(二抗)购自中山公司。
1.1.6 引物 5′2CGGAATT CCACGGG A G CCCTGTGGAC AT CT G C 23′,5′2TTTAT A G CG G CC G C A GG A AG A GG T G C A AAGAAT AAGAAC 23′。
53军事医学科学院院刊 2004年8月第28卷第4期Bull Acad M il M ed Sci ,Aug 2004; V ol 28 N o 4 1.2 方法1.2.1 抗凝血酶Ⅲ活性检测(凝血酶空斑法) AT2Ⅲ和凝血酶结合形成复合物使凝血酶丧失酶活性,且在肝素存在下可以极大地加速这一反应,使检品在含肝素的凝血酶凝胶板中扩散一定时间,利用覆盖纤维蛋白原作指示剂,可以发现凝血酶凝胶的本底呈淡乳色,而被AT2Ⅲ抑制的部分则呈大小不等的圆斑,空斑直径与AT2Ⅲ活性的对数值呈比例。
1.2.2 酵母细胞的诱导表达 挑取阳性克隆到20ml BMGY 培养液的200ml的三角瓶中,30℃最大速度振荡培养,直至D600=2～3,3000g离心5min收集细胞,重悬于装有200ml BM MY培养液的1000ml三角瓶中培养,24h以后,每天补加100%甲醇至终浓度0.5%～1%,持续诱导。
适当时间后,离心取上清。
1.2.3 Western印迹检测 取细胞培养上清液,进行Western 印迹检测,利用Bio Rad公司的M ini2Protean电泳和电转移系统在S DS2PAGE电泳后,将蛋白电转移至Hybond2C硝酸纤维素膜上,具体方法参照文献[1]。
1.2.4 S DS2PAGE检测 取细胞培养上清液进行S DS2PAGE 电泳,检测AT-Ⅲ的表达情况。
1.2.5 表达产物的纯化及定量 发酵液200ml1500×g 4℃15min,离心取上清;上清液使用缓冲液0.02m ol/L pH7.5T ris2HCl缓冲液(含0.12m ol/L NaCl)稀释5倍,上述溶解液再经0.45μm膜过滤,取上清上Heparin2hyperD柱(200 ml),上样速度为5cm/h,用0.02m ol/L pH7.5磷酸缓冲液+0.12m ol/L NaCl洗脱未结合杂蛋白直至洗到基线;用0.02 m ol/L pH7.5磷酸+0.27m ol/L NaCl洗脱弱结合蛋白,直至洗到基线;用0.02m ol/L pH7.5磷酸缓冲液+2m ol/L NaCl 洗脱结合蛋白,收集蛋白吸收峰;层析柱用0.02m ol/L pH 7.5磷酸缓冲液+3m ol/L NaCl洗脱,进一步清除杂蛋白。
活性测定表明AT2Ⅲ主要集中于2m ol/L NaCl收集峰。
2 结果2.1 AT2Ⅲ基因的改构以质粒PC2AT为模板进行PCR扩增。
条件:94℃30s, 55℃45s,72℃150s,40个循环。
通过PCR切除编码32个氨基酸信号肽的96个碱基。
琼脂糖凝胶电泳检测(图1)。
2.2 表达载体的构建PA质粒经Eco RⅠ/NotⅠ双酶切后,利用Wizard○R DNA Clean2Up system纯化回收,毕赤酵母表达载体pPIC9K经过同样处理,两者在T4DNA连接酶的作用下连接,构建9K2AT表达载体,图2为9K2AT表达载体结构示意图。
用限制性内切酶对重组质粒进行鉴定,Eco RⅠ/NotⅠ双酶切可以切出约1.3kb的片段,表明人9K2AT表达载体构建成功(图3)。
由于T载体本身具有Eco RⅠ位点,为了保证表达载体酶切位点正确及不发生反向插入的问题,进行序列测定。
测序结果表明,插入方向正确,酶切位点完整,273位发生了同义突变AAG2AAA,即G变为A,但都是lys。
改建后序列如图4所示。
2.3 整合菌株的诱导表达[2～4]提取质粒9K2AT,SalⅠ酶切线性化,转化G S115感受态细胞,抗性平板上一步筛选高拷贝的G418抗性克隆,并用图1 PCR扩增去除信号肽序列1.D L2000标志物;2.PCR扩增去除信号肽序列的AT2ⅢcDNA图2 9K2AT表达载体结构示意图图3 9K2AT表达载体酶切鉴定图1.9K2AT/Eco RⅠ;2.DNA标志物D L2000;3.9K2AT/Eco RⅠ+ NotⅠ;4.9K2AT质粒;5.9K2AT/NotⅠPCR鉴定阳性克隆。
挑取几株阳性克隆,进行甲醇诱导表达(200ml表达体系),每日取样品,培养至第10天,离心取上清,测序并进行S DS2PAGE检测。
同样实验进行3批,上清液稀释30倍进行活性测定,活性测定表明在上清中表达产物有很强的AT2Ⅲ活性30000U/L,从第2天开始有活性,第7天达到高峰。