叙述悬浮细胞、半贴壁细胞和贴壁细胞的传代方法。
细胞传代培养实验
实验步骤
注意事项
1. 吹打制悬：用吸管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2. 吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入 10 ml 离心管中。 3. 平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以 1 000 转/分钟离心 5 分钟。 4. 弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入 2 ml 培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬 液。 四、分装稀释细胞 1. 分装：将细胞悬液吸出分装至 2~3 个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的 5 生长，传代细胞的密度应该不低于 5×10 /ml，最后要做好标记。 五、传代培养 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入 CO2 培养箱中继续培养。传代细胞 2 小时后开始贴附 在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积 25%时为一个+，占 50%为++，占 75%时为+++。
（细胞培养技 术）实验方法 原理
培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。 贴壁生长的细胞用消化法传代； 部分贴壁生长的细胞 用直接吹打可传代； 悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代， 或用自然沉降法吸除上 清后，再吹打传代。
实验材料
细胞
试剂、试剂盒
D-Hanks 液小牛血清 RPMI1640 双抗胰蛋白酶 EDTANHClNaHCO3
收起
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
注意事项
1. 严格的无菌操作 2. 适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消 化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立 即终止消化。 附：0.25% 胰酶（胰蛋白酶，Trypsin） 配方：100 ml PBS，0.25 g 胰酶。 步骤：先配 100 ml PBS。 称胰酶 0.25 g。加入 PBS 中，低速搅拌。调 pH7.4。过滤，分装，-20℃ 保存，4℃短期内用完。 注意：低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。低温，防止酶失活；对难 消化的细胞，在上述配方中，加入 0.02 g 的 EDTA（0.02%） 根据细胞生长的恃点，传代方法有 3 种：悬浮生长细胞传代、半悬浮生长细胞传代（Hela 细胞） 、贴壁生长细胞传代。
贴壁细胞生长传代操作流程
贴壁细胞生长传代操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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传代培养中的细胞传代培养-推荐下载
传代培养中的细胞传代培养（subculture），当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。
此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。
这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。
对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。
1．悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。
2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
3．贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。
常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。
1、附着型胞(adherentcell)（1）吸掉旧培养液。
（2）用D-PBS洗涤细胞一至二次。
（3）加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37℃作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶液。
(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用，离心后再吸掉上清液。
（4）轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。
2、悬浮型细胞(suspensioncell)（1）吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000rpm5分钟。
（2）吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。
3、融合瘤(hybridoma)（1）有些hybridomacell需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可能会失去抗体。
贴壁细胞生长传代操作流程
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贴壁细胞传代的步骤
贴壁细胞传代的步骤
嘿，朋友！今天咱们来唠唠贴壁细胞传代那些事儿。
你知道吗，贴壁细胞就像一群喜欢“扎堆”的小伙伴，它们紧紧地贴在培养瓶或者培养皿的壁上生长。
当它们越来越多，密密麻麻的时候，就得给它们搬个新家，让它们能继续开开心心地长大，这就是传代啦。
那怎么给它们传代呢？咱们得准备好要用的东西。
比如新的培养瓶或者培养皿，胰蛋白酶或者其他能让细胞从壁上下来的东西，还有培养基等等。
然后，咱们把培养瓶或者培养皿从培养箱里拿出来，放在超净工作台里。
这时候可千万要小心，别让不干净的东西跑进去捣乱。
再然后，就轮到胰蛋白酶登场啦。
往里面加适量的胰蛋白酶，让它和细胞们接触一会儿。
这时候细胞就会慢慢从壁上松开，变得圆滚滚的。
等细胞都松开得差不多了，咱们就赶紧加培养基进去，把胰蛋白酶中和掉。
不然胰蛋白酶待久了，会伤害到细胞的。
然后呢，用吸管或者移液器把细胞混悬液吸起来，轻轻吹打几下，让细胞们分散得更均匀。
接着，把一部分细胞混悬液吸到新的培养瓶或者培养皿里。
加多少细胞混悬液，得看你想要多少细胞继续生长。
加完后，再往新的培养瓶或者培养皿里加新的培养基，让细胞们能吃得饱饱的。
把新的培养瓶或者培养皿放到培养箱里，让细胞们在温暖舒适的环境里继续生长。
怎么样，贴壁细胞传代是不是也没有那么难？多做几次，你就会熟练啦！希望咱们的细胞宝宝们都能茁壮成长，为咱们的实验或者研究出一份力！。
悬浮细胞培养技术讲义
悬浮细胞传代及细胞计数一、细胞传代实验目的：掌握悬浮细胞传代技术。
进一步掌握细胞培养的操作技术。
实验原理：培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细胞密度过大，致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。
为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。
实验用品：（一）仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱；（二）玻璃器皿吸管（弯头、直头）、培养瓶、废液缸、（三）塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架（四）其他物品微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪（五）试剂1640培养液、PBS操作步骤：1.准备：打开培养液，PBS；取出离心管，拧开管盖，管盖倒放。
从吸管筒中依次取出吸管，装上吸头，插入离心管备用。
2.从培养箱内取出细胞，放在显微镜下观察其生长状态、密度。
3.首先观察培养板孔中培养液量。
用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液，转入离心管中。
再另取一只吸管吸取PBS，放入培养板孔中，轻轻吹打孔壁，吸出转入离心管。
4.离心，设置离心机1000转/分，4-5分钟。
5.取出离心管，轻轻吸出上清，倒入废液缸。
吸取培养液约7ML放入离心管，轻轻吹打细胞，使之均匀悬浮。
6.吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中，备计数用。
7.其余的细胞分别放入六个孔中，每孔约1ML。
8.吸取培养液加入板孔中至1/3孔容量。
9.镜下观察细胞是否分布均匀，放入培养箱培养。
二、细胞计数及生长曲线测定培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期潜伏期(latent phase)细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩, 胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束. 细胞贴壁速度与细胞种类, 培养基成分,载体的理化性质等密切相关。
一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24 小时或更多, 而传代细胞系贴壁速度快, 通常10-30 分钟即可贴壁。
悬浮细胞培养技术课件
悬浮细胞传代及细胞计数一、细胞传代实验目的：掌握悬浮细胞传代技术.进一步掌握细胞培养的操作技术.实验原理：培养细胞生长一定时间后,需别离再培养,否那么细胞因生存空间不够,细胞密度过大,致营养缺乏而引起细胞发老、停止生长甚至死匚.为了维持细胞的存活和生长,必须进行再培养,即将原培养瓶内细胞别离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养.实验用品：〔一〕仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱〔4C、-20 C、-70 C〕、倒置相差显微镜、培养箱；〔二〕玻璃器皿吸管〔弯头、直头〕、培养瓶、废液缸、〔三〕塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架〔四〕其他物品微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪〔五〕试剂1640培养液、PBS操作步骤：1 .准备：翻开培养液,PBS取出离心管,拧开管盖,管盖倒放.从吸管筒中依次取出吸管,装上吸头,插入离心管备用.2 .从培养箱内取出细胞,放在显微镜下观察其生长状态、密度.3 .首先观察培养板孔中培养液量.用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液, 转入离心管中.再另取一只吸管吸取PBS放入培养板孔中,轻轻吹打孔壁,吸出转入离心管.4,离心,设置离心机1000转/分,4-5分钟.5,取出离心管,轻轻吸出上清,倒入废液缸.吸取培养液约7ML放入离心管, 轻轻吹打细胞,使之均匀悬浮.6,吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中,备计数用.7.其余的细胞分别放入六个孔中,每孔约1ML8,吸取培养液参加板孔中至1/3孔容量.9.镜下观察细胞是否分布均匀,放入培养箱培养.二、细胞计数及生长曲线测定培养细胞生长过程：潜伏期-指数增生期-停滞期潜伏期(latent phase)细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩,胞体呈圆球形,然后细胞贴附于载体外表,称贴壁,悬浮期结束,细胞贴壁速度与细胞种类,培养基成分,载体的理化性质等密切相关.一般情况下,原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24小时或更多,而传代细胞系贴壁速度快,通常10-30分钟即可贴壁.细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段,才进入生长和增殖期,原代培养细胞潜伏期长,约24-96小时或更长,连续细胞系和月中瘤细胞潜伏期短,仅需6-24小时.(2)指数增生期(logarithmic growth phase)这是细胞增殖最旺盛的阶段,分裂相细胞增多.指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志.通常以细胞分裂相指数( Mitotic index, MI)表示,即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数.一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%,原代细胞分裂指数较低,而连续细胞和月中瘤细胞分裂相指数可高达3%-5%.指数增生期的细胞活力最好时期,是进行各种实验最正确时期, 也是冻存细胞的最好时机.在接种细胞数量适宜情况下,指数增生期持续3-5天后,随着细胞数量不断增多、生长空间减少,最后细胞相互接触集合成片.正常细胞相互接触后能抑制细胞运动,这种现象称接触抑制现象(contact inhibition).而恶性月中瘤细胞无接触抑制现象,能继续移动和增殖,导致细胞向三维空间扩展,使细胞发生堆积(piled up).细胞接触集合成片后,虽然发生接触抑制,但只要营养充分,细胞仍能进行增殖分裂,因此细胞数仍然在增多. 但是,当细胞密度进一步增大,培养液中营养成分减少,代谢产物增多时,细胞因营养枯竭和代谢产物的影响,导致细胞分裂停止,这种现象称密度抑制现象(Density Inhibition ).(3)停滞期(Stagnate phase)细胞数量到达饱和密度后,如不及时进行传代,细胞就会停止增殖,进入停止期. 此时细胞数持平,故也称平台期(Plateau phase ).停滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动.如不进行别离传代,细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH下降等因素中毒,出现形态改变,贴壁细胞会脱落,严重的会发生死亡,因此,应及时传代.实验目的：1 .能独立的进行细胞技术,会绘制生长曲线,了解细胞生长的发育特性.2 .学习在科研中如何应用生长曲线实验原理：生长曲线的测定(计数法)是测定细胞绝对生长数的常用方法,也是判定细胞活力的重要指标,为培养细胞生物学特性的根本参数之一. 一般细胞传代之后,经过长短不同的潜伏期,即进入大量分裂的指数生长期.在细胞到达饱和密度后, 停止生长,进入平顶期,然后退化衰亡.为了准确描述整个过程中的细胞数目的动态变化, 需连续对细胞进行计数,通常计数7天.为精确起见,一般每次计数三瓶细胞并取平均值. 典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期,成平台状的平顶期及退化衰亡四个局部.以存活细胞数对培养时间做图,即生长曲线.生长曲线常用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响.一般在对数期的1/3-1/2处加药.细胞技术的时间和次数依实验目的而定.另外,测定生长曲线的常用方法还有MTTWo计数板原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时, 通过测定一定体积悬液中的细胞的数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目.操作步骤：1 .将计数板及盖片擦拭干净,并将盖片盖在计数板,放在镜下观察.2 .制备细胞悬液：细胞从培养板孔转移到离心管, 离心1000转4-5分钟,弃去上清,参加PBS至一定体积(1MD.3 .将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片和计数板之间,静置3min,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中.4 .计算板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧和上方的.然后按公式计算：细胞数加1二四大格细胞总数/4 X 104说明：公式中除以4,由于计数了4个大格的细胞数.公式中乘以104由于计数板中每一个大格的体积为：1.0mm (长)x 1.0mm (宽)x 0.1mm (高)=0.1mm3而1ml=1000mm3(注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团, 应按单个细胞计算,假设细胞团10%Z上,说明分散不好,需重新稀释制备细胞悬液)台盼兰染色操作步骤：1、制备细胞悬液,放入EP管中.2、以1: 1的比例参加0.4%台盼兰染7取,染色2 — 3分钟.3、吸取少许悬液涂于载玻片上,加上盖片.4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数,计算细胞活力.冻存与复苏一、哺乳动物细胞冷冻保存实验目的：(1)保存种子细胞,以便随时取用.这是保存细胞的最主要目的(2)减少细胞被微生物污染的危险性.(3)减少细胞之间交叉污染的危险性.(4)减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变.(5)防止有限细胞系出现衰老或恶性转化.实验原理：细胞冻存及复苏的根本原那么是慢冻快融,实验证实这样可以最大限度的保存细胞活力.目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚碉作保护剂,这两种物质能提升细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤.复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,防止由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤.实验用品：〔一〕仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱〔4C、-20 C、-70 C〕、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱.〔二〕玻璃器皿吸管〔弯头、直头〕、培养瓶、玻璃瓶〔250ml、100ml〕、废液缸；〔三〕塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管〔10ml〕、15ml离心管、冻存管〔1〜2ml〕〔四〕其他物品微量加样枪、红血球计数板、记号笔、移液枪.〔五〕试剂1640培养液、DMSO〔分析纯〕K562细胞,慢性粒细胞白血病细胞系中的一种.操作步骤：1 .准备：翻开培养液,PBS取出离心管,拧开管盖,管盖倒放.从吸管筒中依次取出吸管,装上吸头,插入离心管备用.2 .配制冻存液：吸取9ML培养液放入离心管,用移液枪吸取1MLDMSO?液,逐滴缓慢参加离心管中.最好把离心管插在冰中.3 .从培养箱内取出细胞,放在显微镜下观察其生长状态、密度.4 .吸出1个孔中的细胞连同培养液,转入离心管中.再另取一只吸管吸取PBS放入培养板孔中,轻轻吹打孔壁,吸出转入离心管.5 .离心,设置离心机1000转4-5分钟.取出离心管,轻轻吸出上清,倒入废液缸.轻轻吸出余下的培养液,注意勿吸出细胞沉淀.6 .吸取1ML配制好的冻存液参加离心管,与细胞混匀后,转入冻存管.7 .标注：标明细胞种类、冻存日期,冻存人.8 .在4 c冰箱中放置30分钟；然后转入-20 C ,放置30分钟；然后再转入-80 C 放置16- 18小时(或过夜)；最后放入液氮中长期保存.有条件的地方, 可用冻存盒. 考前须知：(1)冻存过程需缓慢(2)冻存细胞必须处在对数生长期,活力大于90% ,无微生物污染.(3)细胞浓度限制在：1 X 107 — 5 X 107/ml.(4)使用适宜的细胞冷冻保护剂,以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏.目前,最常用的冷冻保护剂是DMSOf甲基亚碉),使用终浓度为5—10%.但是, 有些细胞系不能用DMSO为冷冻保护剂,如人白血病细胞系HL-60.由于,DMSC^ 诱导HL-60细胞分化.在这种情况下,可选用其它冷冻保护剂,如甘油(glycele ), 羟乙基淀粉等.(5) DMSO释时会释放大量热量.因此,DMSO^能直接加到细胞液中,必须事先配制.细胞复苏操作步骤：(一)准备工作1、37c水浴2、准备一个内装5-10 ml细胞完全培养液离心管.(二)复苏1、带手套,用银子将细胞冷冻管从液氮中取出,迅速放入37c水浴中,手持冻存管不断摇动.观察完全解冻后移入超净台.冷冻管在水浴中解冻时,液面不可超过冻存管盖面,否那么,易发生污染.2、翻开冻存管,迅速将细胞悬液吸到离心管中,轻轻混匀.3、1000rpm离心5 min ,弃去上清液.4、沉淀中参加适当培养基,37c常规培养,第二天观察生长情况.考前须知：1 .解冻操作过程动作要轻.由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱,不仅解冻速度要快,而且动作要轻.2 .解冻时务必注意平安,预防冷冻管爆裂.,要带手套,用银子将细胞冷冻管从液氮中取出,切不可直接用手,以免冻伤.。
生物医学实验入门（4）：细胞传代
生物医学实验入门（4）：细胞传代医工荟萃，不是萝卜开会，融合创新才是硬道理！上一讲本侠给大家说了说细胞是如何复苏的，这一讲呢，本侠要给大家说说细胞是如何传代的。
为什么要传代？细胞株在培养过程中数量会不断地增加，但是我们用来培养细胞的培养皿/瓶的空间是有限的，这就导致了细胞之间接触过于紧密，会使得细胞的增殖受到抑制，所以我们必须把其中一部分细胞挪到别的培养皿/瓶，让细胞有足够的生长空间，说白了，就是孩子大了，要“分家”。
那我们是怎么给细胞“分家”的呢？总的来说，悬浮细胞“分家”比较简单，贴壁细胞要稍微复杂一点点。
我们先来说悬浮细胞，悬浮细胞传代时，将培养皿/瓶里的所有培养基都吸到无菌的离心管里，此时，细胞也都随着培养基被吸走了，然后离心、弃上清，离下来的细胞用适量培养基重悬，分配到多个培养皿/瓶中，补足完全培养基、吹打混匀（这不起眼一步的关键性，在上一讲中本侠已经给大家解释过了）即可放培养箱培养。
接下来我们再来说说贴壁细胞是如何传代的。
贴壁细胞需要用到一种特定的试剂——蛋白酶。
使用蛋白酶的主要目的是切断细胞和容器之间（这样才能把细胞挪走），以及细胞和细胞相互之间（以防接触抑制）的黏连，用蛋白酶处理细胞的过程叫做“消化”，消化后的细胞会形成单细胞并从容器底部掉下来。
最常用的蛋白酶是胰蛋白酶（胰酶，trypsin），市面上常见的胰酶有两种，一种含有EDTA（乙二胺四乙酸），另一种不含EDTA。
含有EDTA的胰酶消化能力更强一些，因为EDTA是一种螯合剂，可以螯合金属离子（如Ca2+和Mg2+等），细胞表面的一些与容器结合的蛋白可能含有这些离子，在EDTA 的作用下，细胞会更快地从容器上脱离。
但是使用含有EDTA的胰酶，需要在消化后去除EDTA，而这一步只能通过离心实现，所以，用含有EDTA的胰酶有利有弊。
一般来说，不含有EDTA的胰酶已经可以满足消化要求，但是还是请大家根据实际情况进行选择。
含有EDTA的胰酶当然喽，也不是所有的情况都是适合使用胰酶的，比如培养黏附干细胞（要防止干细胞失去发育潜力），或体系里不能有血清（而胰酶消化作用的终止要用血清），这就需要选择使用其它作用比较柔和的蛋白酶，如Accutase等。
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6叙述悬浮细胞、半贴壁细胞和贴壁细胞的传代方法。
答：（一）悬浮生长细胞的传代：有以下两种方法：
1、直接传代法：①悬浮细胞自然沉淀瓶底；②用吸管吸去上清1/2～2/3；③轻轻吹打成细胞悬液；④等分装入数个培养瓶（皿）
2、离心传代法：①将细胞悬液转移到离心管内；②800～1000r/min离心5min，弃上清；③加新的培养液到离心管内；④吸管吹打成为细胞悬液；⑤分瓶（皿）培养。
（二）半贴壁细胞和贴壁细胞的传代：采用消化法。
消化液是：0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA、二者混合液、最好在37℃或室温（25℃以上）环境进行。
其操作步骤（以25ml培养瓶为例）: （1）弃去旧培养液；（2）漂洗：加入2mll 无Ca2+、Mg2+的PBS，漂洗1次后倒掉；（3）消化：加入消化液，使之铺满细胞表面（待肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，残液继续作用2~3min，轻轻摇动，细胞层可随残液呈片状脱落下来，显微镜下发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时立即终止消化）；（4）吹打：加入完全培养基5mll，用吸管按顺序进行反复吹打瓶壁，吹打时不要用力过大。
（5）调整至合适细胞浓度，分瓶培养。