Ilumina测序原理
Illumina测序基础知识
第一个要给大家讲的，是它这个flowcell。
Flowcell翻成中文，就叫“流动池”。
我们来看这个图片。
图片当中，我们看到一个象载玻片大小的芯片。
这个芯片里面，是做了8条通道。
在这个通道的内表面，是做了专门的化学修饰。
它的化学修饰，主要是用2种DNA 引物，把它（2种DNA引物）种在玻璃表面。
这两种（DNA引物的）序列是和接下来要测序的DNA文库的接头序列相互补的。
而且这2种引物是通过共价键，连到Flowcell上去。
之所以要用共价键连到Flowcell上去，是因为接下来有大量的液体要流过这个Flowcell，只有有共价键连接的这些DNA，才不会被冲掉。
这就是Flowcell。
再接下来，讲一下文库、和文库的制作（过程）所谓的DNA文库，实际上是许多个DNA片段，在两头接上了特定的DNA接头，型成的DNA混合物。
文库有2个特点，第1个特点，是当中这一段插入的DNA，它的序列是各种各样的。
第2个特点，它的两头的接头序列，是已知的，而且是人工特地加上去的。
要做这个文库，首先是把基因组DNA，用超声波打断。
然后打断之后，两头用酶把它补平，再用Klenow酶在3’端加上一个A碱基。
然后，再用连接酶把这个接头给连上去。
连好了接头的DNA混合物，我们就称为一个“文库”。
英文也称作“library”。
做好了Library之后，就要做桥式PCR了。
桥式PCR，实际上是把文库种到芯片上去，然后进行扩增，这样的一个过程。
这个过程，首先是把文库加入到芯片上，因为文库两头的DNA序列，和芯片上引物是互补的，所以，就会产生互补杂交。
杂交完了之后，我们在这里面加入dNP和聚合酶。
聚合酶会从引物开始，延着模板合成出一条全新的DNA链来。
新的这条链，和原来的序列是完全互补的。
接下来，我们再加入NaOH碱溶液。
DNA双链在NaOH碱溶液存在下，就解链了。
而且被液流一冲，原来的那个（模板）链，也就是没有和芯片共价连接的链，就被冲走了。
二代测序技术简介
二代测序技术简介一、什么是二代测序技术？二代测序技术，也被称为高通量测序技术，是一种快速、高效的DNA 或RNA序列测定方法。
相比传统的Sanger测序技术，二代测序技术具有较高的测序效率和容量，能够同时测序数百万到数十亿个碱基对，大大提高了测序的速度和数据产量。
常用的二代测序技术包括Illumina 测序技术、Ion Torrent PGM 测序技术等。
二、Illumina二代测序技术的原理与过程1. 原理Illumina二代测序技术基于桥式扩增和碱基扩增的原理。
DNA样本经过打断、连接和PCR扩增等处理后，将单链DNA固定于特定表面上，并在每个DNA分子之间形成成千上万个桥式扩增复合物。
在模板DNA的存在下，通过逐个反复封闭、复制和荧光标记的方式，进行碱基的逐渐扩增，并利用荧光信号记录测序结果。
2. 过程（1）样本制备：包括DNA或RNA的提取、打断、连接和PCR扩增等步骤，以获得特定长度的DNA片段。
（2）文库构建：将DNA片段连接到Illumina测序芯片上的适配器上，并进行PCR扩增，形成DNA桥式扩增复合物。
（3）测序芯片加载：将DNA桥式扩增复合物置于测序芯片上，使得每个DNA分子都与芯片上的特定区域相结合。
（4）桥式扩增：通过逐个反复封闭、复制和荧光标记的方式进行碱基的逐步扩增，形成簇团。
（5）图像获取：利用高分辨率成像系统拍摄簇团的荧光信号。
（6）数据分析：将图像数据转化为碱基序列，通过比对和组装等算法，得到原始测序数据。
三、Illumina二代测序技术的优势和应用领域1. 优势（1）高通量：能够在较短时间内产生大规模的测序数据。
（2）高准确性：其错误率低于其他二代测序技术，能够提供高质量的测序结果。
（3）可扩展性：适用于不同规模的测序项目，从几个目标区域到整个基因组的测序，具有较高的灵活性。
（4）低成本：相对于传统的Sanger测序技术，具有更低的测序成本。
2. 应用领域（1）基因组学研究：能够对物种的基因组进行全面测序和变异分析，有助于揭示基因组结构和功能。
illumina测序原理
illumina测序原理illumina测序是一种分子生物技术，是人类基因组测序领域最常用的序列技术。
Illumina测序可以帮助研究人员对物种基因组进行微观上的分析，以了解物种遗传和表型的变化，以及为药物开发和临床诊断提供技术支持。
本文将介绍illumina测序的原理、技术方法以及用于探索疾病的应用。
illumina测序的原理illumina测序以能够自动分辨双链DNA的激光荧光技术为基础。
它是一种借助微孔板的半结构化的、多芯片的平台，可以同时对多条双链DNA进行高通量测序。
其基本原理是，在介质中悬浮的DNA片段会在illumina仪器上被电场热像(piezo-electric heating)做成微型沉积，然后由四种激光激发激光（excitation laser）、发射激光（emission laser）、紫外线激光（UV laser）、紫外线破坏激光（UV destruction laser）对每个沉积的微粒进行精确的检测。
illumina测序的技术方法illumina测序通常由四个步骤组成：DNA片段制备、多聚合酶链反应(PCR)、样品分配和测序读取。
1、DNA片段制备：这一步是首先利用核酸在体外产生固定大小的DNA片段，然后加入抑制剂阻止PCR反应，最后将数据存储在微孔板中。
2、多聚合酶链反应(PCR)：多聚合酶链反应(PCR)使得每个DNA 片段可以得到大量的复制，以便illumina仪器可以测试它们。
3、样品分配：在这个步骤中，借助芯片的能力，illumina测序仪可以将样品放置在固定的位置上，并精确地控制它们的移动速度和沉积位置，以实现多个样品的定位和分配。
4、测序读取：这是最后一步，也是最重要的步骤，即对每一个沉积的DNA片段序列进行精确的测序，以获得每一条双链DNA的完整序列。
illumina测序用于疾病探索illumina测序不仅应用于普通的基因组测序，还可以用于探索疾病机制，鉴定敏感性突变，并检测基因组结构变异。
illuma测序原理(一)
illuma测序原理(一)Illumina测序1. 简介Illumina测序（Illumina Sequencing）是一种高通量测序技术，通常用于获取DNA或RNA样本的序列信息。
该技术采用Illumina公司的测序平台，具有高灵敏度、高标准化和高通量等特点，被广泛应用于基因组学、转录组学和表观基因组学等领域。
2. 工作原理Illumina测序的工作原理可以简要概括为：1.DNA建库：将待测样本中的DNA片段通过特定的方法进行文库构建，包括DNA片段的断裂、末端修复、连接接头添加等步骤。
2.簇生成：将文库DNA片段连接到微孔表面上的引物序列上，形成DNA片段簇，每个簇包含数百万个相同的DNA片段。
3.桥式扩增：通过PCR反应，使每个DNA片段形成桥状结构，并与其他DNA片段连接在一起。
这个过程在适当的条件下反复进行。
4.测序反应：引物和荧光标记的核酸碱基（dNTPs）在图案化和停止扩增的条件下进行反应，读取每一个DNA片段的碱基序列。
5.重复循环：以上步骤循环进行，每个循环会读取一个碱基，并记录下来。
6.数据分析：基于每个簇的测序结果，对测序数据进行分析和拼接，得到原始的DNA或RNA序列。
3. Illumina测序的特点•高灵敏度：Illumina测序技术能够检测到非常低浓度的DNA或RNA样本，适用于稀有序列的研究。
•高标准化：Illumina测序具有较低的错误率，并且可以高通量地测序多个样本，结果可靠且具有可重复性。
•高通量：通过Illumina平台，可以同时测序数百万个DNA片段，在较短的时间内获取大量的测序数据。
•可扩展性：Illumina测序技术可以根据研究需求进行灵活的扩展，从几百bp到数百bp的测序长度都可以满足。
4. 应用领域Illumina测序技术在众多研究领域中得到了广泛的应用，包括但不限于：•基因组学研究：用于鉴定基因组中的突变、SV（结构变异）和其他遗传变异。
•转录组学研究：用于确定细胞或组织中的RNA转录本，揭示基因表达的变化和调控机制。
illumina测序原理
illumina测序原理
Illumina测序原理是一种高通量测序技术，它通过将DNA分子切割成小段，并使用DNA聚合酶与引物使其复制，最后通过测序仪读取DNA的碱基序列信息。
这种测序技术以其高度准确性和高通量特性而闻名。
Illumina测序过程基于桥式扩增的技术，首先将待测的DNA 分子随机切割成称为文库的小片段。
然后，这些DNA片段会与适配体（adapter）相连，适配体上含有特定序列的引物。
引物具有与DNA片段相互互补的序列，可以与DNA片段的末端结合。
接下来，这些连接好的DNA片段会被附着到玻璃芯片上的千余万片段连接“桥”的位置。
通过引物的作用，DNA片段与芯片上的DNA密切相连，形成以桥为中心的DNA聚集体。
这个过程被称为桥式扩增，同时也是Illumina测序技术的关键步骤。
在桥式扩增完成之后，双链DNA会被解旋成两条单链，之后使用DNA聚合酶和碱基以及荧光标记的核苷酸作为底物进行扩增。
聚合酶会根据DNA模板选择相应的碱基，并将其与底物结合形成新的DNA链。
当荧光标记的核苷酸被加入时，会释放出荧光信号，这个信号会通过摄像机被探测到。
在测序过程中，每次加入的碱基都会进行检测和记录。
通过重复这个过程，每个DNA片段的碱基序列将会被测定。
当测序完成后，可以通过计算机软件分析这些测定的碱基序列，获得
DNA样本的整体序列。
总的来说，Illumina测序原理基于桥式扩增技术，通过测序仪读取每个DNA片段的碱基序列信息，从而实现高通量、高精度的测序。
这种技术被广泛应用于基因组学、转录组学、表观遗传学等领域的研究和应用。
Illumina平台测序原理及常见测序文库构建
应用： 转录本的种类和基因 定量 基因的转录结构 可变剪切 发现新的转录本
真核生物
总RNA
原核生物
利用Oligo (dT)富 集mRNA
去除 rRNA
将mRNA 随机打断成 ~200 nt
桥式PCR：
冲走单链DNA模板，以合成的第一链 为模板进行35循环的桥式PCR
线性化：
将与P5接头连接的DNA链从Flow Cell 上去除
阻断3’–OH： 防止在后续测序过程中继续延伸DNA链
杂交测序引物
DNA模板杂交和一链合成
单链DNA分子与FlowCell 表面的对应接头杂交
以杂交的单链DNA为模板， FlowCell上的接头ng Primer
此单链部分与 FlowCell表面上P7接
头相同
此单链部分与 FlowCamples
cBot HiSeq2500
MiSe液相杂交
• 液相杂交是通过在溶液中， 利用链碱基配对的原理， 将DNA片段与探针杂交， 然后洗脱，富集目的片段。
Exon测序
特点
• 优点：
• 不足：
• 1、 与全基因组测序相比，外 显 • 1、与全基因组测序相比，不能
子测序具有测序覆盖度更深、 数 检测到基因组内较大的结构性
4种 Fl-NTP’s +
聚合酶
拍照，收集信号
去阻断，切除荧光基团
X 36 - 151
可逆终止化学反应
• 一次加入4种修饰的dNTP(可逆终止子) • 准确度高 • 可以得到同聚物序列
• 合成 • 照相，收集信号 • 去阻断，切除荧
光基团
下一个碱基合成
Illumina-测序的原理
on 簇生成
序
流
程
Sequencing
测序
Data Analysis 数据分析
Sequencing 测序
Two flow cell
Hiseq2500
1. 测序引物与衔接子序列杂交
3‘端 测 序 引 物
5‘端
2. 当3'末端被阻断时，每个周期只添加一个核苷酸
测
Cluster Generation 簇生成
序
流
程
Sequencing
测序
Data Analysis 数据分析
Cluster Generation 簇生成
Flow cell ：流动槽，有8个通道，每个lane中整齐排列了无数个tail。
Cluster Generation 簇生成
Illumina测序流程
3. 切开荧光并释放3'端，然后重复上述步骤进行下一个循环
3. 切开荧光并释放3'端，然后重复上述步骤进行下一个循环
Illumina测序流程
eneration 簇生成
序
流
程
Sequencing
测序
Data Analysis 数据分析
illumina—高通量测序原理
Qian Xi’an, ShanJxiin, Cghina
Illumina公司的新一代测序仪Genome Analyzer最早由Solexa公司研发， 利用其专利核心技术“DNA簇”和“可逆性末端终结（reversible terminator）”，实现自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平 行测序。Illumina公司于2007年花费6亿美金的巨资收购了Solexa，就 是为了促成Genome Analyzer的商品化。Genome Analyzer作为新一代测 序技术平台，具有高准确性，高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出 优势，可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组 学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。
illumina测序技术原理
illumina测序技术原理Illumina测序技术原理Illumina测序技术是一种高通量测序技术，广泛应用于基因组学、转录组学和表观基因组学等研究领域。
该技术基于DNA合成和荧光标记的原理，通过大规模并行测序的方法，快速高效地获得DNA序列信息。
一、Illumina测序技术的基本原理Illumina测序技术主要包括文库构建、测序反应和数据分析三个步骤。
1. 文库构建文库构建是Illumina测序的第一步。
首先，需要将待测样本的DNA 进行提取和纯化。
然后，将DNA进行打断，得到较短的DNA片段。
接下来，在DNA片段的末端添加特定的适配器序列，适配器序列包含了引物结构和荧光标记。
适配器序列的引物结构可以与测序芯片上的引物结合，使得DNA片段在芯片上固定。
最后，将DNA片段经过PCR扩增，得到文库。
2. 测序反应测序反应是Illumina测序的核心步骤。
首先，将文库中的DNA片段固定在测序芯片的表面上形成单分子颗粒。
然后，通过桥式PCR的方法，将DNA片段扩增成cluster。
每个cluster都由数百个相同的DNA片段组成，这些片段形成桥状结构，与芯片表面连接。
接下来，将荧光标记的碱基加入到扩增的DNA链上，然后通过激光照射，激活荧光标记。
这样，每个碱基都会发出特定的荧光信号，然后由摄像机进行拍摄。
拍摄的图像会被转化为电信号，并通过计算机进行处理和分析，得到DNA序列信息。
3. 数据分析数据分析是Illumina测序的最后一步。
通过计算机软件对测序得到的图像进行处理，将图像转化为原始的碱基序列。
然后，根据碱基荧光信号的强度，对原始序列进行质量控制和过滤，去除低质量的碱基。
接下来，将原始序列与参考序列进行比对，以确定DNA片段的位置和序列。
最后，通过数据分析软件将测序结果进行整理和解读，得到最终的测序数据。
二、Illumina测序技术的优势Illumina测序技术具有以下几个优势：1. 高通量：Illumina测序技术可以同时进行数百万次的测序反应，大大提高了测序效率和通量。
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1. Illumina测序仪原理：
Illumina新一代测序技术可以高通量、并行对核酸片段进行深度测序，测序的技术原理是采用可逆性末端边合成边测序反应，首先在DNA片段两端加上序列已知的通用接头构建文库，文库加载到测序芯片Flowcell上，文库两端的已知序列与Flowcell基底上的Oligo序列互补，每条文库片段都经过桥式PCR扩增形成一个簇，测序时采用边合成边测序反应，即在碱基延伸过程中，每个循环反应只能延伸一个正确互补的碱基，根据四种不同的荧光信号确认碱基种类，保证最终的核酸序列质量，经过多个循环后，完整读取核酸序列。
利用该技术，可以对任何物种（包括动物、植物、细菌、病毒、寄生虫等）在DNA水平上进行全基因组测序、基因组靶向区域测序，检测基因组范围内的遗传变异或多态性，在细菌、病毒等病原溯源上分辨率最高；在RNA水平上进行基因的表达测序分析，准确检测基因表达量和表达片段的序列信息；对DNA处理后，可以对基因组甲基化水平进行检测，从表观遗传学角度对影响基因表达的因素进行分析；利用转录因子的抗体对DNA进行处理，寻找转录因子影响的DNA序列信息，定位影响基因表达的片段；自然界存在的微生物基本上都是混合物，传统的Sanger法测序技术无法对混合物中的各微生物进行准确检测，利用新一代测序的高通量、并行性特点，通过宏基因组分析方法，可以从整体上对自然界本来状态进行分析，得到最客观信息。
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精品。