菌种生化反应检查标准操作规程
菌种鉴定SOP
微生物的鉴定1 原则微生物鉴别应遵循逐步缩小范围的原则，用分类学的知识，一步步地将未知微生物逐步落实到科、属，然后选择相应的鉴定系统将未知的微生物鉴定到种。
鉴定包括以下几个环节：①菌种采集②菌种纯化；3菌落形态学观察如形状、大小、色泽；4细胞形态观察如球状、杆状、螺旋状、弧状、丝状及其排列方式；5革兰氏染色反应，阳性或阴性；6氧化与发酵试验；7接触酶与氧化酶试验；鞭毛与动力等等。
通过上述基础试验结果再结合细菌鉴定检索表，从而确定微生物所属范围，并选择合适的鉴别试验条，将微生物鉴定到种。
也可采用分子生物学鉴定方法，提取DNA后通过扩增、序列分析等方法，测定DNA序列，得到鉴定结果。
2基本定向生化试验在细菌鉴定过程中，需要最先完成的一些实验成为基本定向生化试验。
以下详细介绍这些基本定向生化试验的原理、操作步骤和试剂配制的内容。
A革兰染色试验原理：由于革兰阳性细菌的细胞壁较厚，细胞壁中的肽聚糖含量高且网格结构紧密，含脂量又低，当用结晶紫复合溶液染色细胞后用脱色时，引起了细胞壁肽聚糖层网状结构的孔径缩小以至关闭，从而阻止了结晶紫-碘复合物的逸出，故而菌体呈现深紫色；而格兰阴性细菌细胞壁中肽聚糖含量低，含脂量又高，当酒精脱色时，脂类物质被溶解，细胞壁通透性增大，结晶紫-碘复合物被抽提出来，从而使菌体呈现复染液的红色。
制片、染色操作在洁净的载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌龄为18-24小时的菌苔与水滴充分涂抹成均匀的菌膜，自然烘干或在酒精灯火焰上方微热烘干，并在火焰上通过几次，以固定涂片。
滴加结晶紫液，初染1分钟，用自来水冲去结晶紫液。
滴加卢戈碘液冲去残水并媒染约1分钟后，再用自来水冲去卢戈碘液，将玻片上的水甩干。
滴加95%乙醇脱色约20-30秒，并立即用水冲净。
滴加沙黄液染1-2分钟后，用水洗净沙黄液，晾干供镜检。
镜检观察在载玻片的菌膜上滴一滴香柏油，用显微镜的油镜观察标本，菌体呈红色为革兰阴性菌；菌体呈蓝紫色为革兰阳性菌。
微生物生化和血清学试验标准操作规程
触酶试验标准操作规程1.目的规范触酶试验标准操作规程。
2．原理具有触酶(过氧化氢酶)的细菌，能催化过氧化氢，放出新生态氧，继而形成分子氧，出现气泡。
3．试剂3％过氧化氢溶液。
4．质控金黄色葡萄球菌ATCC 25923阳性，肺炎链球菌ATCC 4961 9阴性。
5．操作步骤取3％过氧化氢溶液0．5 ml，滴加于不含血液的细菌琼脂培养物上，或取1～3 ml滴加入盐水菌悬液中。
6．结果判断培养物出现气泡者为阳性。
7．注意事项7．1细菌要求新鲜。
7．2不宜用血琼脂平板上的菌落作触酶试验，因红细胞内含有触酶，可能出现假阳性。
7．3需用已知阳性菌和阴性菌作对照。
8．临床意义在革兰阳性球菌中，链球菌触酶试验阴性，葡萄球菌及微球菌均阳性，因此可用于革兰阳性球菌的初步分群。
氧化酶试验标准操作规程1．目的l规范氧化酶试验标准操作规程。
{2.原理氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的酶。
具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。
3 . 试剂盐酸二甲基对苯二胺(或四甲基对苯二胺)0.1g，加蒸锱水10ml，置于棕色瓶内可用一周。
冰箱保存，或分装于棕色瓶内密封。
4. 质控铜绿假单胞菌ATCC27853阳性，大肠埃希菌ATcc 25922阴性。
5.操作步骤去洁净的滤纸一小块，蘸取菌苔少许，加1滴10g／L盐酸二甲基对苯二胺溶液于菌落上，观察颜色变化。
6．结果判断立即呈粉红色并迅速转为紫红色者为阳性。
7. 注意事项7．1 试剂在空气中易氧化，故应经常更换新试剂，或配置时试剂内加入0．1％维生素c以减少自身氧化。
7. 2 不宜采用含葡萄糖培养基上的菌落(葡萄糖发酵可抑制氧化酶活性)。
7．3实验时应避开含铁的培养基等含铁物质，因本实验过程中，遇铁时会出现假阳性。
8 . 临床意义8. 1 用于奈瑟菌属﹑非发酵等细菌的鉴定。
如果肠杆菌科不进行本试验，则可能将氧化8．2所有的革兰阴性菌均应进行氧化酶试验，如果肠杆菌科不进行本试验，则可能将氧化酶阳性的嗜水气单胞菌错误地鉴定为大肠埃希杆菌或沙雷菌。
0040沙门氏菌生化试验检验操作规程
目的建立沙门氏菌生化检验操作规程，确保检验数据的准确性。
依据《中国药典》2000版一部附录XIIIC-（80-81页）。
范围本标准适用于沙门氏菌生化检验操作。
责任人QC负责人、化验员。
内容1使用仪器、玻璃器皿、培养基、染色剂及试剂。
1.1仪器：托盘天平1.2玻璃器皿：150ml锥开瓶、试管、载玻片1.3试液：1.3.1靛基质试液：取对二甲基苯甲醛5.0g，加入乙醇75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入（边滴边振摇，以免骤热使溶液色泽变深）即得。
1.3.2 0.9%氯化钠溶液：取氯化钠0.9g，加入蒸馏水100ml，微热使溶解，121℃灭菌30分钟，放冷，备用。
1.4染色剂：1.4.1结晶紫染液：取结晶紫1.0g，加入95%乙醇20ml使溶解，加1%草酸铵水溶液80ml，混匀，静置48小时使用，置密闭棕色瓶中贮存。
1.4.2碘液：取碘化钾2.0g，加水3-5ml使溶解，加入碘片1.0g，使全部溶解后加水稀释至300ml，置密闭棕色瓶贮存。
1.4.3沙黄试液：取沙黄0.25g，加95%乙醇10ml，使完全溶解后，加水100ml。
1.5培养基：1.5.1营养肉汤增菌液：取营养肉汤试药22g，加蒸馏水1000ml微热使溶解，按每瓶100ml分装，121℃灭菌15分钟，备用。
1.5.2四硫磺酸盐增菌液：取四硫磺酸盐试药4.6g，加蒸馏水100ml微热使溶解，121℃灭菌30分钟，备用。
1.5.3胆盐硫化琼脂培养基：取胆盐硫化琼脂培养基试药48g，加蒸馏水1000ml加热溶化后，116℃灭菌30分钟，冷却至60℃灭菌，倾注平皿，备用。
1.5.4曙红亚甲蓝琼脂培养基：取营养琼脂培养基（取营养琼脂试药4g，加水100ml，116℃灭菌备用）加热溶化后，取100ml，冷至60℃按无菌操作加入灭菌的20%乳糖溶液5 ml，曙红钠指示液2ml和亚甲蓝指示液1.5ml，摇匀，倾注平皿。
1.5.5沙门、志贺菌属琼脂：取沙门、志贺菌属琼脂试药60g，加蒸馏水1000ml，放置20分钟，用石棉网微火煮沸使完全溶解，冷至50℃左右倾入无菌平皿中凝固后，备用。
菌种检定操作规程
菌种检定操作规程
《菌种检定操作规程》
一、目的
菌种检定操作规程旨在规范菌种检定过程，确保检定结果准确可靠，保障实验室菌种质量。
二、适用范围
本规程适用于各类实验室对菌种进行检定的操作。
三、设备和试剂
1. 必备设备：无菌工作台、培养箱、平板计数器等。
2. 必备试剂：琼脂培养基、生理盐水、甘油等。
四、菌种检定操作流程
1. 取样准备：将待检菌种进行悬浮液制备或直接取样，保证单一菌种在接种时的质量。
2. 培养基接种：将取样溶液均匀涂敷于琼脂培养基表面，将琼脂培养基放入培养箱进行培养。
3. 孵化：将接种后的琼脂培养基置于培养箱中，进行相应的温度和时间的培养。
4. 菌落计数：使用平板计数器对菌落进行计数，记录结果。
5. 结果分析：根据计数结果，对菌种进行鉴别和鉴定。
五、结果确认与报告
1. 只有经过两名以上实验人员的确认，结果方可出具。
2. 将检定结果填写在检定记录表上，并进行备份存储。
六、质量控制
1. 定期对实验室设备和试剂进行检验、校正。
2. 定期进行内部质量控制，对检定结果进行复核和比对。
七、附则
1. 对于异常情况的处理：出现异常结果时，要及时进行排查并记录处理过程。
2. 本规程未尽事宜，由实验室主管负责进行详细规定。
以上即为《菌种检定操作规程》的内容，希望各实验室严格按照此规程进行菌种检定工作，确保实验室菌种质量及检定结果的准确性。
菌种检验程序
菌种开启GNA 或GNA+B划线于基础 革兰阳性杆菌阴性阳性GNA+B 有芽孢无芽孢BacillusListeria阴性 阳性Strep Staph氧化酶触酶血浆凝固酶动力 25℃+ 37℃-附 录 A 菌种检验流程图附录 B鉴定条使用说明书B.1 GN-ID 鉴定条使用说明书B.1.1 接种和培养（1）挑取培养18～24h的纯培养物至3～5ml无菌生理盐水中，混合均匀；（2）小心打开鉴定条的粘性封口膜（不要丢弃），用无菌滴管加3～4滴（约100微升）菌悬液至每个小管，然后在管上有黑色圈标志的管1、2、3、9（GN A）和管20、24（GN B）中滴加3～4滴矿物油；注：如果培养物为氧化酶阳性，则管（黑色虚线）20不加矿物油。
（3）用粘性封口膜封住管口，检查管7、11、12（GNA）和14（GNB）上面的封口膜上是否有透气小孔，然后放至35～37℃的培养箱中孵育；（4）对于肠杆菌科的培养物，在18～24小时后读结果，而氧化酶阳性培养物则在48小时后读结果。
B.1.2结果判读和添加配套试剂B.1.2.1 结果判读打开粘性封口膜，参考结果对照图和反应结果对照表读GN A和GN B的反应结果，并将结果记录于报告单上。
B.1.2.2 添加配套试剂（管的上部为绿色标志）：加2滴Kovac试剂于管8（GNA）中，60秒后记录结果，红色为阳性；加1滴VPⅠ和一滴VPⅡ于管10（GNA）中，15-30分钟后记录结果，深红色表明为阳性结果；加1滴TDA于管12（GNA）中，60秒后记录结果，桃红色标明阳性。
记录ONPG的结果之后，在管7中加1滴Nitrate A和1滴Nitrate B试剂，60秒后记录反应结果，红色表示阳性，黄色或无色表示阴性(若为黄色或无色，可加少量锌粉，如果仍保持无色或黄色，则表示硝酸盐已被彻底还原为氮气，判断为阳性，若变红色，则说明硝酸盐仍保留在管内，被锌粉还原，判断为阴性)；如：加入NITA+ NITB红色——阳性无色或黄色——阴性加入锌粉：无色或黄色——阳性红色——阴性B.1.3 结果记录和读取在GN-ID A+B的结果记录单上，将每三个反应分为一组，每组中反应底物下面均标有1、2、4数值，将每组中阳性反应对应的数值加起来，将得到一个四位数（GN A）、或者八位数（氧化酶阴性GN A+B）或者九位数（氧化酶阳性GN A+B），将这个数值输入microgen 电脑鉴定软件系统，系统将显示数据库中 5 个最接近结果的菌种，以及每个结果的可能性几率以及相似性，从而得到鉴定结果。
菌种鉴定标准操作规程
菌种鉴定标准操作规程目的：建立菌种鉴定标准操作规程范围：适用于******鉴定标准操作职责：内容：1整体操作步骤1.1纯化、分离待鉴定菌用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。
1.2挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。
1.3如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。
如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。
1.4如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。
如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。
1.5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。
1.6选定正确的试剂条以后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。
鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。
2革兰氏染色2.1染色剂的配制2.1.1结晶紫染色液：甲液：结晶紫 1.0g95%的酒精20ml乙液：草酸铵0.8g水80ml将甲液和乙液混合均匀，静置48h使用，置密闭棕色瓶中储存。
2.1.2碘液：碘 1.0g碘化钾 2.0g水300ml配制时先用3～5ml水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再加水稀释至300ml，摇匀，分装在棕色瓶中储存。
2.1.3稀石碳酸红溶液:碱性品红 1.0g石碳酸 5.0ml95%乙醇10.0ml配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml，摇匀。
2.2操作:2.2.1涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。
菌种鉴定仪标准操作规程
菌种鉴定仪标准操作规程《菌种鉴定仪标准操作规程》一、前言菌种鉴定仪是一种用于快速鉴定微生物菌株的设备，广泛应用于医疗、食品、环境监测等领域。
为了保证鉴定结果的准确性和操作的规范性，制定本规程。
二、适用范围本规程适用于使用菌种鉴定仪进行微生物菌株鉴定的实验室及相关人员。
三、操作人员1. 操作人员应具备相关微生物鉴定的基本知识和实践经验。
2. 操作人员应经过培训，并取得相关操作资格证书。
四、仪器及试剂1. 菌种鉴定仪应符合国家标准，保证设备的正常运行。
2. 试剂应来自正规厂家，保证试剂的质量。
五、操作流程1. 准备待测菌株：将待测菌株培养于适宜的培养基上，保证菌株的纯度。
2. 设置菌种鉴定仪：根据待测菌株的品种和特性设置菌种鉴定仪的相应参数。
3. 载玻片制备：将待测菌株悬浮于载体上，进行薄膜制备。
4. 菌种鉴定：将载玻片放入菌种鉴定仪中进行快速鉴定。
5. 结果判读：根据仪器显示的结果进行判读，并与其他方法进行对比分析。
六、结果记录与报告1. 记录：对每次鉴定实验的结果进行详细记录，并按规定保存相关数据。
2. 报告：将鉴定结果进行整理，并向相关部门或客户提交鉴定报告。
七、设备维护和质控1. 设备维护：定期对菌种鉴定仪进行维护和保养，保证设备的正常运行。
2. 质控：定期进行质控实验，保证菌种鉴定的准确性和可靠性。
八、处罚与奖励1. 对违反本规程造成损失的个人或单位，将给予相应的处罚。
2. 对严格执行本规程并取得良好成绩的个人或单位，将给予相应的奖励。
九、附则1. 本规程由实验室管理者负责执行，并定期进行评估和更新。
2. 对本规程中未尽事宜，由实验室管理者负责解释和裁决。
十、生效日期本规程自颁布之日起生效。
菌种生化反应检查标准操作规程
菌种生化反应检查标准操作规程依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。
范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。
目的：通过生化试验鉴定所用的菌种是否为标准的大肠杆菌。
原理：枸椽酸盐利用试验原理：枸椽酸盐培养基中仅含一种氮源（铵盐）和唯一碳源（枸椽酸钠）一般细菌能利用磷酸二氢铵作为氮源，但不一定能分解枸椽酸盐而取得碳源，因此可否利用该盐，能将不同细菌鉴别。
吲哚试验原理：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，吲哚本身没有颜色，不能直接观察，所以加入二甲基氨基苯甲醛试剂，使之与吲哚作用形成红色的玫瑰吲哚。
甲基红试验原理：大肠杆菌和产气杆菌在糖代谢中都能分解葡萄糖产生丙酮酸。
产气杆菌能将两个分子丙酮酸脱羧生成一个分子中性乙酰甲基甲醇，故培养物中形成酸类较少，使酸碱度PH可在5.4以上，因此加入甲基红指示剂后呈桔黄色，是为甲基红试验阴性，而大肠杆菌能进一步分解丙酮酸，产生酸类较多，使培养物的酸碱度在PH4.5或更低，故甲基红指示剂呈红色，是为甲基红试验阳性。
V-P试验原理：测定细菌分解葡萄糖后能否产生乙酰甲基甲醇，产气杆菌可使丙酮酸脱羧变为中性的乙酰甲基甲醇，在碱性条件下被空气中的氧气氧化成二乙酰，后者又与培养基蛋白胨中精氨酸所含胍基起作用，生成红色化合物，称为U-P试验阳性。
内容：1 材料、设备1．1 材料：1．1．1 菌种：PBV888/DH5α，来源于主种子批或工作种子批。
1．1．2注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。
1．1．3 试剂蛋白胨氯化钠 NaCl 分析纯葡萄糖 C6H12O6 分析纯溴麝香草酚兰 C27H28Br2O5S 分析纯对二甲基氨基苯甲醛 C9H11NO 分析纯戊醇 C5H15O 分析纯浓盐酸 HCl 分析纯甲基红 C15H15N3O2 分析纯无水乙醇 CH3CH2OH 分析纯氢氧化钠 NaOH 分析纯氢氧化钾 KOH 分析纯α-萘酚 C10H7OH 分析纯硫酸镁 MgSO4•7H2O 分析纯磷酸氢二钾 K2HPO4 分析纯磷酸二氢铵 NH4H2PO4 分析纯枸椽酸钠 C6H5Na3O7·2H2O 分析纯琼脂粉 分析纯1．2 器皿盐水瓶、中试管、胶头滴管、烧杯、量筒（100ml、500ml、1000ml）、吸管（10ml）、试剂瓶（250ml、500ml）。
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菌种生化反应检查标准操作规程依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。
范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。
目的：通过生化试验鉴定所用的菌种是否为标准的大肠杆菌。
原理：枸椽酸盐利用试验原理：枸椽酸盐培养基中仅含一种氮源（铵盐）和唯一碳源（枸椽酸钠）一般细菌能利用磷酸二氢铵作为氮源，但不一定能分解枸椽酸盐而取得碳源，因此可否利用该盐，能将不同细菌鉴别。
吲哚试验原理：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，吲哚本身没有颜色，不能直接观察，所以加入二甲基氨基苯甲醛试剂，使之与吲哚作用形成红色的玫瑰吲哚。
甲基红试验原理：大肠杆菌和产气杆菌在糖代谢中都能分解葡萄糖产生丙酮酸。
产气杆菌能将两个分子丙酮酸脱羧生成一个分子中性乙酰甲基甲醇，故培养物中形成酸类较少，使酸碱度PH可在5.4以上，因此加入甲基红指示剂后呈桔黄色，是为甲基红试验阴性，而大肠杆菌能进一步分解丙酮酸，产生酸类较多，使培养物的酸碱度在PH4.5或更低，故甲基红指示剂呈红色，是为甲基红试验阳性。
V-P试验原理：测定细菌分解葡萄糖后能否产生乙酰甲基甲醇，产气杆菌可使丙酮酸脱羧变为中性的乙酰甲基甲醇，在碱性条件下被空气中的氧气氧化成二乙酰，后者又与培养基蛋白胨中精氨酸所含胍基起作用，生成红色化合物，称为U-P试验阳性。
内容：1 材料、设备1．1 材料：1．1．1 菌种：PBV888/DH5α，来源于主种子批或工作种子批。
1．1．2注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。
1．1．3 试剂蛋白胨氯化钠 NaCl 分析纯葡萄糖 C6H12O6分析纯溴麝香草酚兰 C27H28Br2O5S 分析纯对二甲基氨基苯甲醛 C9H11NO 分析纯戊醇 C5H15O 分析纯浓盐酸 HCl 分析纯甲基红 C15H15N3O2分析纯无水乙醇 CH3CH2OH 分析纯氢氧化钠 NaOH 分析纯氢氧化钾 KOH 分析纯α-萘酚 C10H7OH 分析纯硫酸镁 MgSO4•7H2O分析纯磷酸氢二钾 K2HPO4分析纯磷酸二氢铵 NH4H2PO4分析纯枸椽酸钠 C6H5Na3O7·2H2O 分析纯琼脂粉分析纯1．2 器皿盐水瓶、中试管、胶头滴管、烧杯、量筒（100ml、500ml、1000ml）、吸管（10ml）、试剂瓶（250ml、500ml）。
1．3 仪器、设备PH计 PHC-3C型上海大中分析仪器厂电子秤 ES-200A型沈阳腾龙电子仪器公司电子天平 ACS 太原恒温培养箱 HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂水浴箱 6 Liter LKB生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂1．4 其它材料硫酸纸、牛皮纸、片带、橡皮膏、吸球（1ml及10ml）玻棒、接种环、透气栓。
2 方法2．1 准备工作2．1．1 工作环境：在十万级洁净室内进行，确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌，挂上“使用中”标志牌。
2．1．2 器皿清洁要求经本室洗刷间处理烤干后用二层硫酸纸、一层牛皮纸包好，用线绳系紧，经121.3℃，60分钟高压蒸汽灭菌备用。
2．1．3调试仪器设备2．1．3．1 确认PH计运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。
2．1．3．2 确认电子秤运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。
2．1．3．3 确认电子天平运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。
2．1．3．4 确认培养箱运行状态良好，已挂有“运行”标志牌。
2．1．3．4 确认水浴箱运行状态良好。
已挂有“备用”标志牌。
2．1．4溶液及培养基的配制：2．1．4．1 1N NaOH 100ml摘下电子秤“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，接通电源，校零。
用电子秤称取NaOH 4克，加注射用水80ml溶解，用量筒定容至100ml，置试剂瓶中，标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。
2．1．4．2 1%的溴麝香草酚兰（BTB）100ml摘下电子天平“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，接通电源，校零。
用电子天瓶称取1克溴麝香草酚兰，加1N NaOH 1.6ml，加注射用水定容至100ml。
置试剂瓶中，标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。
2．1．4．3 0.4%的溴麝香草酚兰（BTB）100ml用电子天平称取溴麝香草酚兰0.4克加1N NaOH 0.64ml，加注射用水至100ml装入试剂瓶中，标明名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。
2．1．4．4 95%乙醇500ml量取475ml无水乙醇，加注射用水定容500ml，装入试剂瓶中，标明名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。
2．1．4．5 甲基红试剂 500ml用电子天平称取甲基红0.1克，溶于95%乙醇300ml，然后加注射用水定容至500ml，置试剂瓶中，标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。
2．1．4．6 枸氏试剂 100ml摘下水浴箱“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，接通电源，设定56℃，预热。
用电子天平称取对二甲基氨基苯甲醛5克，加入到75ml戊醇内，置于56℃水浴中，不断摇动使其溶解，取出冷却后徐徐滴入浓盐酸25ml，滴加时随滴随摇，以免骤热。
放置一夜，即成淡褐色透明液体，置250ml试剂瓶中，标明名称、浓度、体积、批号、配制日期，保存于冷暗处或冰箱内。
2．1．4．7 40%氢氧化钾溶液100ml用电子秤称取40克KOH，充分溶于80ml注射用水，补足体积至100ml，摇匀，盛于250ml 试剂瓶中，标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期、放室温待用。
2．1．4．8 6% α-萘酚酒精溶液100ml用吸管吸取6mlα-萘酚，用无水乙醇定容至100ml，置250ml试剂瓶中，标明名称、浓度、体积、批号、配制日期，放室温待用。
2．1．4．9 75%乙醇的配制取无水乙醇75ml，用注射用水定容至100ml，混匀，装入250ml试剂瓶中，贴标签，标明液体名称、浓度、体积、批号、日期。
室温备用。
2．1．4．10 培养基的配制2．1．4．10．1 蛋白胨水培养基（吲哚试验用）1000ml：摘下pH计“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。
用电子秤称取蛋白胨10克，NaCl 5克，加入800ml注射用水，混匀，调PH值7.4-7.6，定容1000ml， 115.6℃，30分钟高压灭菌。
2．1．4．10．2 葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红和U-P试验用）1000ml用电子秤分别称取蛋白胨5克，葡萄糖5克，磷酸氢二钾5克，加800ml注射用水，混匀，调PH7.2-7.4，定容1000ml， 115.6℃，30分钟高压灭菌。
2．1．4．10．3 枸椽酸盐培养基1000ml用电子天平分别称取NaCl5克，MgSO4·7H2O 0.2克，磷酸氢二钾1克，磷酸二氢铵1克，枸椽酸钠2克，琼脂20克，溶于注射用水1000ml，调PH6.8-7.2，加入1% BTB指示剂10ml，摇匀，115.6℃，30分钟高压灭菌。
2．2操作步骤2．2．1 吲哚试验2．2．1．1 摘下生物安全台“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。
用75%酒精棉擦拭台内，接通电源，打开风机，吹30分钟。
在生物安全台内，将蛋白胨水培养基用吸管分装于灭菌中试管，每管2ml。
用接种环（经火焰灭菌，冷却后）取细菌接种于蛋白胨水培养基中，盖上透气栓。
2．2．1．2 于37℃恒温培养箱中培养48小时后取出，每管加2-3滴枸氏试剂，轻轻振摇，使戊醇分散于液体中，将培养物静置，待戊醇升至培养液面后，如有吲哚存在，就可以被提取在戊醇层中，反应呈玫瑰红色者为阳性，以“+”表示，仍呈黄色者为阴性以“-”表示。
2．2．2 甲基红试验2．2．2．1 在生物安全台中将葡萄糖蛋白胨水培养基分装于灭菌中试管中，每管2ml。
用接种环（火焰灭菌，冷却后）接种细菌于葡萄糖蛋白胨水培养基中，用透气栓盖好。
2．2．2．2 37℃恒温培养箱培养2-3天后，取出滴加甲基红试剂2-3滴，可立即观察，显现红色为阳性，用“+”表示，否则为阴性，用“-”表示。
2．2．3 V-P试验2．2．3．1 在生物安全台中将葡萄糖蛋白胨水培养基用吸管分装于灭菌中试管中，每管2ml。
用接种环（火焰灭菌，冷却后）取细菌，接种于该培养基中，用透气栓盖好。
2．2．3．2 37℃恒温培养箱培养2-3天取出后，在每管中加入0.4ml 4%的KOH和1ml 6% α-萘酚酒精溶液，混匀，室温下静置5-15分钟，如出现红色为阳性，以“+”表示，否则为阴性以“-”表示。
2．2．4 枸椽酸盐利用试验2．2．4．1 将灭菌后的枸椽酸盐培养基冷却至50℃左右，在生物安全台中用吸管分装于试管中，每管5ml，倾斜放置。
斜面培养基冷却后，用接种环（经火焰灭菌，冷却后）取细菌，接种于该斜面培养基中，用透气栓盖好。
2．2．4．2 37℃恒温培养箱中培养24小时，观察，有菌生长，培养颜色由绿变为深兰者为阳性，以“+”表示，否则为阴性以“-”表示。
工作场地摘下“使用中”标志牌，挂上“待处理”标志牌。
3 结果判定3．1判定标准吲哚、甲基红、U-P及枸椽酸盐利用四项试验，合称为IMVIC试验，鉴别大肠杆菌的结果应为“++--”。
3．2判定结果判定结果经二人复核，填写检定记录，注明菌种名称、批号、判定日期、检定结果、工作者及复核者等。
4 清场4．1配液清场4．1．1称取药品之后将药品瓶盖好，放回药品柜中。
4．1．2将电子秤、电子天平和PH计切断电源后，清洁干净，放回原处，填写使用记录，摘下“运行”标志牌，挂“备用”标志牌。
生物安全台，用75%酒精棉擦拭台内，继续吹10分钟后，关闭风机，切断电源，摘下“运行”标志牌，挂上“备用”标志牌，并填写使用记录。
4．1．3清洁操作台面，用专用抹布擦净。
4．1．4地面用专用拖布拖净。
4．2操作清场4．2．1试验完毕，含细菌的中试管121.3℃，60分钟高压灭菌。
4．3 清场结束后，由车间工序负责人或质量监督员检查合格后，摘下“待处理”标志牌，挂上“清场合格”标志牌，并填写清场记录。
5 注意事项5．1 各种培养基的标识一定要醒目，以免判定时失误。
5．2 清场时，必须将带菌的器皿先送高压灭菌处理后，再送洗刷组处理。
5．3 所有工作均应经二人复核，并及时填写工作记录。