免疫电镜技术(immunoelectron-microscopy-IEM)又称为免
免疫电镜的原理和应用
免疫电镜的原理和应用1. 免疫电镜的原理免疫电镜（Immunoelectron microscopy）是将免疫学技术和电子显微镜技术相结合的一种研究方法。
免疫电镜可以用来研究细胞和组织中的抗原及其与抗体之间的特异性相互作用。
免疫电镜的基本原理如下： - 在待检样品（细胞或组织）中，使用特异性的抗体识别和结合目标抗原。
- 抗体与抗原结合后，通过标记抗体（如金粒标记抗体）来可视化目标抗原的位置。
- 经过特殊的处理和固定，样品被覆盖上一层的金粒标记抗原。
- 样品经过电镜观察，金粒标记的抗原会显示为黑色点，从而可以确定抗原的位置。
2. 免疫电镜的应用免疫电镜在生物医学研究中有广泛的应用。
以下列举了一些常见的免疫电镜应用：2.1 亚细胞结构研究免疫电镜可以用于研究细胞和亚细胞结构的相关问题。
通过标记抗体，可以识别和定位细胞中的特定蛋白质、酶、受体等，从而揭示细胞内的分布和定位。
免疫电镜在细胞器分析、分泌途径研究和细胞内信号传导等方面有重要应用。
2.2 病毒研究免疫电镜被广泛应用于病毒学研究中。
通过标记与病毒抗原结合的抗体，可以确定病毒颗粒在细胞中的位置和分布。
这对于研究病毒寄生、复制和传播的机制非常重要。
2.3 免疫组化研究免疫电镜也可以用于免疫组化研究。
免疫组化是一种检测某个特定分子或蛋白质在组织中分布的方法。
通过将组织样品与特定抗体结合，然后通过免疫电镜观察标记的抗体位置，可以确定该蛋白质在组织中的定位。
2.4 病理诊断和研究免疫电镜在病理诊断和研究中也有重要应用。
通过观察和定位细胞或组织中的抗原，可以为病理学家提供更准确的诊断信息。
同时，免疫电镜也可以用于研究疾病的发病机制、新药的研发等领域。
2.5 细胞分子生物学研究免疫电镜在细胞分子生物学研究中发挥着重要的作用。
通过免疫电镜的观察，可以研究特定蛋白质或分子在细胞内的分布和相互作用方式。
这对于揭示细胞内分子机制、信号传导和细胞功能非常重要。
3. 总结免疫电镜是一种结合了免疫学和电子显微镜技术的研究方法。
4.免疫电镜细胞化学技术
铁蛋白标记抗体是由Singer（1959）首创的一种
免疫细胞化学技术。这技术曾广泛应用于病毒和细胞 表面抗原的检测。铁蛋白作为电镜观察的标记物，具 有颗粒大、分辨率高、散射力强的特点，可用于细胞 膜表面抗原的准确定位。所以，虽然40年后的今天已 发展了多种免疫电镜细胞化学技术，但铁蛋白标记法 仍然是一种基本技术。
优点：
①胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的
生物活性不发生明显的变化。
②金颗粒具有很高的电子密度，在电镜下金颗粒
清晰可辨，易精确定位。
③不仅可以用于透射电镜的超薄切片观察，也可以用于 扫描电镜对细胞表面的抗原、受体进行标记定位观察。 ④胶体金标记物易于制备，而且可以根据需要制备不同 大小的胶体金，因此可以进行免疫电镜的双重标记。 ⑤根据抗原抗体反应部分结合金颗粒数量的多少，可进 行粗略的免疫细胞化学定量研究。
（2）电镜包埋前免疫金染色
① 新鲜组织经适当固定（0.5%戊二醛-2%多聚甲 醛固定0.5～1h），制成厚切片。 ② 0.05mol/L TBS pH7.4漂洗3次，每次 15min。 ③ 0.1mol/L甘氨酸漂洗10min，灭活自由醛基。 ④ TBS漂洗，5min×3次， ⑤ 1%牛血清孵育组织块30min。
3）样品与染液的均匀分散度为促进样品与染料的均匀
分散提高染色效果，可以采用某些分散剂 4）悬液与染液的酸碱度 一般以中性或略偏酸性（PH 6.4－7）为宜。 5）染色时机的把握 吸去过多样品悬液后尽快滴加负染色液
1、标本－染液混合染色法：
病毒悬液和2％的磷钨酸染液等量混合
用毛细管滴到有膜的载网上（吸去过多的病毒－
（3）电镜包埋后免疫金染色法 ①超薄切片50～70nm，置于镍网或金网中。
常用的免疫标记技术
常用的免疫标记技术免疫标记技术是一种用于检测和分析生物分子的方法，其中利用特定的抗体或其他免疫物质标记目标分子，从而使这些分子能够被观察和测量。
以下是一些常用的免疫标记技术：1.免疫荧光技术（Immunofluorescence）：在这种技术中，用于检测目标分子的抗体被标记上荧光染料。
通过荧光显微镜观察样本，可以定位和定量目标分子的位置和数量。
2.免疫酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）：这是一种广泛用于检测抗体或抗原的技术。
ELISA 利用酶标记的抗体或抗原与目标分子结合，然后通过酶的底物反应来产生可测量的信号。
3.免疫印迹技术（Western Blot）：Western Blot用于检测蛋白质。
蛋白质被电泳分离，然后通过免疫印迹将其转移到膜上。
接着使用特定抗体标记的酶或荧光物质来检测目标蛋白质。
4.免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）：IHC用于在组织切片中检测特定抗原的存在。
切片上的抗原与标记有酶、荧光染料或其他标记的抗体结合，通过显微镜观察抗原的分布。
5.流式细胞仪技术（Flow Cytometry）：该技术通过激光照射细胞，测量细胞表面或内部的荧光标记物，以分析细胞的类型、状态和功能。
6.蛋白质质谱法（Mass Spectrometry）：将样品中的蛋白质离子化，并通过质谱仪测量质量。
免疫质谱结合了免疫标记和质谱技术，可用于检测和鉴定蛋白质。
7.免疫电镜技术（Immunoelectron Microscopy）：在电子显微镜下观察样本，通过标记的抗体来可视化细胞或亚细胞结构中的特定蛋白质。
8.免疫磁珠技术（Immunomagnetic Bead Assay）：使用带有磁珠的抗体，通过磁场将目标分子分离出来。
常用于细胞分离和分析。
这些免疫标记技术在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域发挥着关键作用，可以用于检测和定量各种生物分子，如蛋白质、抗体、核酸等。
免疫电镜技术
组织或游离细胞内抗原
• 需对样品进行特殊处理－增加膜的通透性 固定剂+1%Triton X100，10-20min 0.1MPB冲洗，10min 0.5% 1%Triton X100，30min 0.1MPB冲洗，10min －接包埋前法标准程序
包埋后法：
• 适用： 组织细胞（内或外）抗原 游离细胞内部抗原
• 预先冷却好全部用具
3. 浸透与包埋
[目的]使包埋剂浸透样品后，固化成硬块 低温包埋剂：丙稀酸类，水溶性
不含环氧基 低温下可聚合 两种： Lowicryl K4M(德国)：紫外线照射下聚合 LR White(英国)：55 ℃ 聚合,不需紫外线照射
低温(0-4℃)聚合，需用加速剂
低温包埋剂（Lowicryl K4M）
• 常规电镜：形态结构 • 免疫学方法： 组分 • 免疫电镜：形态结构+组分
免疫电镜延伸了免疫光镜 免疫化学技术与电镜技术结合的产物
在超微结构水平定位某些分子: Ag, 受体
Pancreas
Ultrastructure and chromogranin A immunogold labelling of ECL cell carcinoids. APMIS 113: 506–12, 2005
• 制备免疫电镜超薄切片 免疫标记
免疫电镜超薄切片的制备
• 低温包埋超薄切片法 • 冰冻超薄切片法
1.冷固定
• 取材 • FA+GA固定液中4°C， 2~3h(中间1-2h可取
出修块) • 封闭游离醛基（0.5M NH4Cl in 0.1M PB）
4°C， 2h • 冲洗（0.18M蔗糖in 0.1M PB） 4°C 2h或过
• 羟丙基/甲基丙烯酸酯（基本成分） • 乙二醇丙烯酸酯（交连固化剂） • 苯甲酸烷基乙醚（激活剂,引发剂）
常用免疫组织化学染色方法
常用免疫组织化学染色方法免疫组织化学染色是通过将抗原与抗体结合来检测组织中特定蛋白质的染色方法。
它是现代生物医学中常用的一种技术，可以用于研究分子生物学、细胞生物学、病理学等领域。
以下是一些常用的免疫组织化学染色方法介绍：1. 免疫组化染色(Immunohistochemistry, IHC)：免疫组化染色是免疫组织化学中最常用的方法之一、其基本原理是使用一种与目标抗原特异性结合的抗体，将抗原与抗体结合，然后通过染色方法将表达该抗原的细胞或组织可视化。
常用的染色剂包括多聚酶、酶标、荧光素和放射性同位素。
IHC可以用于检测细胞表面抗原、细胞器中的抗原以及胞内蛋白质的定位。
2. 免疫荧光染色(Immunofluorescence, IF)：免疫荧光染色利用荧光标记的抗体来检测特定抗原。
它可以提供高度特异性和灵敏度的探测，可以用于研究蛋白质的亚细胞定位、蛋白质相互作用等。
利用该方法可以用于检测多种类型的标记（单标记、双标记、复合标记等），从而实现多重染色或共定位染色。
3. 免疫电镜染色(Immunoelectron microscopy, IEM)：免疫电镜染色是一种将金粒标记的抗体用于电子显微镜下观察并定位特定抗原的方法。
通过将金粒结合到抗原-抗体复合物上，可以在电子显微镜下清晰地观察到抗原的位置和分布。
这种方法具有高分辨率和高特异性的优点，广泛应用于超微结构的研究。
4. 免疫酶标染色(Immunoenzyme staining, IES)：免疫酶标染色是使用酶作为标记物，通过化学反应将抗原与酶标记的抗体结合，从而显示出特定抗原的位置和分布。
常用的标记物包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)等。
在检测抗原时，标记物可以与染色底物产生反应生成可见色素，形成染色，以显示抗原的位置和分布。
5. 免疫组织化学原位杂交(Immunohistochemical in situ hybridization, IHC-IS)：免疫组化原位杂交技术是一种结合了原位杂交和免疫组化技术的方法。
免疫电镜检查与诊断b
免疫电镜检查与诊断b免疫电镜检查与诊断免疫电镜检查（immunoelectron microscopy，简称IEM）是一种结合免疫学和电镜技术的高级检测方法，广泛应用于诊断医学、病理学和分子生物学领域。
它通过利用电镜技术观察标本中的免疫反应产物，从而实现对细胞结构、组织病变及病原体感染的捕捉和诊断。
在现代医学中，免疫电镜检查已成为研究和诊断关键性疾病的重要工具，其在传染病学、肿瘤学、肾脏病学以及免疫研究等领域的应用越来越广泛。
1. 免疫电镜检查的基本原理与技术免疫电镜检查是将电子显微镜技术与免疫学相结合的方法。
通过首先用抗体重新标记细胞、组织或病原体的特定抗原，然后使用底物与抗原结合，最后用电子显微镜观察结合物的形态和分布。
常用的底物包括胶质黄金颗粒、酶标记抗体和荧光标记抗体。
其中，胶质黄金颗粒是最常用的标记物，它具有稳定且易于观察的特性。
2. 免疫电镜检查的应用领域2.1 传染病学免疫电镜检查在传染病学中起着重要作用。
对于病毒感染的诊断和研究，免疫电镜检查可以直接观察到病毒颗粒，帮助确定感染病毒的种类和数量。
免疫电镜检查可用于研究病毒感染的机制、病毒定点突变和抗病毒药物的研发。
2.2 肿瘤学在肿瘤学中，免疫电镜检查可用于检测和鉴定特定的肿瘤标记物、判断肿瘤分化程度以及评估治疗效果。
通过观察肿瘤细胞中的特定抗原和抗体结合物，免疫电镜检查可以确定肿瘤类型和肿瘤细胞特征。
免疫电镜检查还可以用于研究肿瘤抗原的表达、肿瘤免疫机制以及肿瘤治疗的新策略。
2.3 肾脏病学免疫电镜检查在肾脏病学的诊断和研究中起着重要作用。
通过观察肾组织中的免疫复合物，免疫电镜检查可以确定肾脏疾病的类型和程度。
在肾小球疾病中，免疫电镜检查可以帮助识别不同类型的肾小球病变，如膜性肾病、硬化性肾病和免疫球蛋白A肾病等。
免疫电镜检查还可以评估抗肾小球基底膜抗体和免疫球蛋白在肾脏中的沉积情况。
2.4 免疫研究免疫电镜检查在免疫研究中也得到广泛应用。
动物免疫学实验技术-免疫电镜技术
第十四章免疫电镜技术(Immune electron microscopy technique)一、概述（一）原理免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。
它主要分为两大类：一类是免疫凝集电镜技术，即采用抗原抗体凝集反应后，再经负染色直接在电镜下观察；另一类则是免疫电镜定位技术。
该项技术是利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合，在电子显微镜下观察，由于标准物形成一定的电子密度而指示出相应抗原所在的部位。
免疫电镜的应用，使得抗原和抗体定位的研究进入到亚细胞的水平。
（二）影响免疫电镜的一些因素1．标记物用于电镜观察的标记物有三类：一类是电子密度致密的标记物，如铁蛋白、辣根过氧化物酶等。
另一类则是放射性同位素，如135I、35S、32P、14C、3H等，第三类则是有独特形状的标记物，如血兰蛋白、噬菌体等。
对标记物的要求是：具有特定的形状、不影响抗原抗体复合物的特性与形状。
目前用于免疫电镜的标记物主要是铁蛋白和HRP。
两者各有其优点，铁蛋白电子密度致密。
观察时反差大，优于酶标记，但铁蛋白分子量大(460 000)，穿透能力差，所以适于细胞表面抗原的定位，另外铁蛋白的标记过程比较复杂。
HRP分子量小(40 000)，穿透力强，有利于标记抗体进入细胞内，适于细胞内的抗原定位。
2．固定剂固定是免疫电镜较关键的一步，免疫电镜中的固定与一般超薄切片中的固定的不同之点在于既考虑保存细胞的超微结构,又要考虑到抗原的失活性问题。
（1）固定剂的要求：①不损害细胞内抗原的活性；②固定速度快、效果好；③分子量小，易于渗透；④固定后,不引起交联，造成空间的阻碍，影响标记抗体进入抗原位。
• 1 •（2）影响固定的因素有：①采用固定剂的种类；②固定剂的浓度，浓度过大，对抗原的活性有影响，浓度过小，固定效果差；③固定剂的pH；④固定剂的温度,一般采用2℃～4℃冷固定；这样能降低细胞的自浴作用和水分的抽提；⑤固定时间与温度有关，温度高，固定快，也与缓冲系的离子强度有关，离子强度大，渗透压大，穿透力强，固定要快。
免疫标记电镜技术
免疫标记电镜技术
（1）原理：是利用电镜下可见的示踪标记物标记特异性抗体（或抗原），使之与组织超薄切片中的相应抗原（或抗体）反应，形成不溶
性免疫复合物，用电镜观察可见的标记物，间接证实免疫反应的发生。
（2）常用的免疫标记电镜技术：
①铁蛋白标记免疫电镜技术：抗体与铁蛋白通过低分子量的双功
能试剂结合为一种双分子复合物。
②酶标记免疫电镜技术：是以酶作为抗原抗体反应的标记物，与
相应的酶底物作用，形成一种不溶性的反应产物。
包括酶标记抗体法、非标记抗体酶法和非标记的过氧化物酶-抗过氧化物酶技术（即PAP 法）。
③胶体金标记免疫电镜技术：是利用胶体金在碱性环境中带有负
电的性质，使其与抗体相吸附，从而将抗体标记。
当用金标记的抗体
与抗原反应时，在光镜水平胶金液呈现鲜艳的樱红色，不需外加染色。
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免疫电镜技术（immunoelectron microscopy，IEM）又称为免疫细胞化学技术，是在免疫组织化学技术（immunohistochemistry）的基础上发展起来的，它是利用抗原与抗体特异性结合的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的技术方法。
该方法为精确定位各种抗原的存在部位、研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效的手段。
免疫电镜技术主要经历了铁蛋白标记技术、酶标记技术以及胶体金标记技术三个主要发展阶段。
铁蛋白标记技术适用于细胞膜表面抗原的定位，由于其分子量较大，不易穿透细胞膜，定位细胞内抗原较为困难。
铁蛋白对电镜包埋剂的非特异性吸附很强，不适用于包埋后免疫标记，使其应用受到一定限制。
酶标记免疫电镜技术是将酶（主要是过氧化物酶）与抗体相交联，抗原抗体反应后，加底物显示酶的活性部位，酶反应产物经OsO4处理变为具有一定电子密度的锇黑，可在电镜下观察。
过氧化物酶的相对分子量较小，与其交联的抗体较易穿透经处理的细胞膜，可用于细胞内抗原的定位。
但是酶反应产物比较弥散，因此分辨率不如颗粒性标记物高。
胶体金标记免疫电镜技术是目前应用最广的免疫电镜标记物，该技术是将胶体金作为抗体的标记物，用于细胞表面和细胞内多种抗原的精确定位。
胶体金主要具有以下几个优点：（1）胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明显改变，可制备抗体-胶体金、蛋白A-胶体金、卵白素-胶体金、植物凝集素-胶体金等用于免疫电镜；（2）在电镜下金颗粒电子密度高、圆形且界线清晰，易于辨认，定位比酶反应物更精确；（3）胶体金标记物易于制备，并可以根据需要制备大小不同（1～150nm）的胶体金，因此可进行免疫电镜的双重或多重标记；（4）金颗粒能发射强烈的二次电子，是扫描电镜的理想标记物；（5）胶体金经过银显影增强后，金颗粒外周吸附大量银颗粒而呈现黑色或黑褐色，因此也能用于光学显微镜观察。
此外，胶体金还能用于冷冻蚀刻标本的免疫标记。
抗体的制备，标本的处理，免疫标记，对照实验、结果的观察和解析。
抗体的制备特异性高、亲和力强的高效价抗体是获得理想的免疫标记结果的首要条件要。
抗体可购买或自己制备。
大分子完全抗原，可直接免疫动物如家兔、山羊、豚鼠、小鼠来获得抗体。
半抗原，用偶联剂使半抗原与大分子物质结合成复合物，再去免疫动物产生抗体，大分子物质称为载体蛋白，以甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白或血蓝蛋白最为常用。
偶联剂为戊二醛或碳二酰亚胺等。
目前细胞杂交瘤技术制备的单克隆抗体最为理想。
标本的处理为了既能将抗原准确定位甚至定量，又能观察到近似于生活状态下的细胞超微结构，必须选择合适的固定剂，慎重处理样品。
取材单细胞：培养细胞或血细胞应随用随取。
悬浮培养细胞可先离心（800 rpm，5 min），用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗1次后进行固定。
贴壁细胞则可先将其培养在玻片上，用PBS轻轻冲洗后立即固定，也可用胰酶将细胞消化下来，按悬浮培养细胞的制备方法制备。
组织：取组织块时做到越快越好，最好在没有停止血流前就取材。
若观察的对象为肺、大脑、脊髓或内分泌器官等比较柔软的组织，应先做灌注固定，再用锐利的刀片将其切成约2 mm×2 mm×l mm大小的组织块，切时要避免挤压与牵拉，然后投入到固定液中继续固定。
固定固定剂常会对抗原的活性产生不同程度影响，为了保存细胞的超微结构和抗原的活性，应通过预试验，确定固定剂的种类、浓度、温度、pH及固定时间和方式，可用已知效价的抗原进行试验，选择合适的固定方法。
常用的免疫电镜标本固定液多聚甲醛-戊二醛固定液（简称PG）：1％多聚甲醛对组织细胞的抗原性影响不大，若加入超过0.1％戊二醛，抗原性就会迅速减弱；当戊二醛的浓度低到0.01％～0.05％时，对抗原性的影响便不显著，而细胞超微结构的保存也可获得很大改善。
所以推荐用1％多聚甲醛加0.01％～0.05％戊二醛作为免疫电镜标本的固定剂，固定时间为4～5 h。
对有些抗原性较强的标本，也可采用4％多聚甲醛加0.05％～0.5％戊二醛进行固定。
某些抗原对戊二醛极其敏感，固定液只能用2～4%多聚甲醛，而不能加戊二醛。
不充分的固定会造成抗原提取或移位，同时醛类等交联固定剂会改变蛋白质分子的结构而影响其抗原性，所以在不明显影响抗原性的前提下，选择合适的固定浓度和时间，尽可能强一些为好。
这里我们特别推荐使用美国EMS 公司的多聚甲醛溶液和戊二醛溶液，常用货号为157-8和16220。
过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛混合固定液（简称PLP）：PLP液含0.01 mol/L过碘酸钠、0.075mol/L 赖氨酸、2％多聚甲醛及0.037mol/L磷酸缓冲液。
其机制是借助过碘酸盐氧化抗原，一般为糖蛋白的糖类部分，使其羟基变为醛基，这样赖氨酸的双价氨基就能与醛基结合从而把抗原交联起来。
由于大多数组织抗原含蛋白质与糖类，抗原决定簇位于蛋白部分，该固定剂有选择性地固定糖类，这样既稳定了抗原，又不影响抗原决定簇与抗体的结合。
加入低浓度的多聚甲醛则能稳定蛋白与脂类。
因为赖氨酸价格较贵，此固定液不如PG固定液经济。
苦味酸-多聚甲醛-戊二醛固定液（简称PAPG）：PAPG液含4％多聚甲醛、15％（V/V）苦味酸、0.5％戊二醛、pH为7.3。
苦味酸穿透迅速，可在不影响抗原活性的前提下固定蛋白质，改善对膜和胞质的保存。
特别是不能采用高浓度的戊二醛与锇酸做后固定时（如包埋后的免疫标记），在前固定液中加入苦味酸对超微结构的保存有很大帮助。
固定方法与时间灌注固定：这是固定效果最好的方式，能使超微结构得到很好的保存。
以大鼠为例，麻醉后，用注射针头经左心室向主动脉灌注固定液，静脉压为120mm Hg柱，在5～15 min内每200g体重灌注150 ml固定液。
浸没固定：将手术或灌注后切成的标本块浸没在固定液中固定，浸没固定时间常为2～5h，游离细胞固定0.5～1h。
包埋包埋剂类型：环氧树脂包埋剂和低温包埋剂。
包埋前免疫标记：即对已固定的样品先进行免疫标记，然后进行包埋、超薄切片并观察结果，一般选用环氧树脂包埋剂。
环氧树脂本质是疏水性的，在包埋前样品必须先进行完全脱水，然后在温箱中进行热聚合。
热聚合会使大多数抗原变性，因此该包埋剂不适用于包埋后免疫标记。
包埋后免疫标记：指组织标本经固定及树脂包埋，制作成超薄切片后再进行免疫化学标记的方法，此方法多用低温包埋剂，如Lowicryl系列包埋剂、LR White包埋剂和LRGold包埋剂。
这三种包埋剂均能在低温下（-35℃～-80℃）用紫外光（波长315～360nm）进行聚合，避免了高温对抗原性的负面影响，提高了阳性标记率，而且对胶体金的非特异性吸附少，对温度敏感的抗原应选择使用低温包埋剂。
免疫标记根据免疫标记与标本包埋之间的不同关系，可分为包埋前免疫标记、包埋后免疫标记和不用包埋的冷冻超薄切片免疫标记。
根据具体的标本、抗原的部位及性质并结合实验室的具体条件选择恰当的方法。
这三种免疫标记方法，都包括非特异性位点的封闭、抗体与抗原特异性结合的免疫反应、反应部位的示踪显示等基本步骤。
包埋前免疫标记优点一是切片在免疫标记前不经锇酸固定、脱水、树脂包埋及高温聚合的过程，抗原活性不会受到上述过程的影响，而且抗原暴露充分，标记的阳性率高，非特异性反应少。
二是免疫标记后还可进行半薄切片，在免疫反应阳性部位做定位超薄切片，进一步提高电镜的检出率。
三是免疫标记完毕后，用戊二醛与锇酸再次固定组织，可使抗原抗体的结合更加牢固，并有利于膜结构的保存。
包埋前免疫标记主要用于细胞膜表面抗原的免疫定位，以及用于某些易被脱水剂和树脂成分溶解和变性的抗原的检测。
包埋前免疫标记细胞内抗原受到标记抗体的穿透性限制，为了提高对细胞内抗原的标记率可以采取以下措施：厚切片厚切片进行包埋前免疫标记，需将固定后的组织厚切片（单细胞团不需厚切片），以利于标记抗体的穿透。
厚切片的方法有以下几种：冰冻切片：用恒冷箱冰冻切片机将固定后的组织块切成8μm左右的厚片。
将切下的厚片放入盛有PBS的小玻璃瓶内备用。
也有的将厚片直接贴在载玻片上进行免疫标记，这样做虽然操作比较方便，但因抗体只能与厚片的一面接触，所以会在一定程度上影响标记的阳性率。
震动切片：震动切片可以切出20μm～30μm的厚片，免疫电镜用只需20μm～80μm的切片。
震动切片的优点是可以避免冰冻对组织带来的损害，但它切出来的切片过厚，即使在使用穿透剂的条件下，免疫试剂也仅能穿透切片表面8μm～9μm，而更深层的组织就不易被标记。
增加细胞膜的通透性用0.01％Saponin或0.1％Triton X-100等活性剂处理5～8min，以增加细胞膜的通透性。
但这些化学物质会对超微结构产生一定程度的破坏，所以应根据不同的组织或细胞，严格控制活性剂的应用浓度与时间。
也可用冻融的方法增加细胞膜通透性，标本先进行防冰晶处理（厚片在含15％甘油、20％蔗糖的PBS 中振摇沉底），在液氮中速冻0.5～1min后用PBS迅速回温。
选用相对分子质量较小的标记物辣根过氧化物酶与IgG的Fab片段交联物，分子质量较小，约100kD，较易进入细胞内。
也可用IgG Fab-lnm金作为标记物，标记后经银加强染色的纳金包埋前标记法。
由于该标记物较易穿透到组织和细胞内，且定位比酶标抗体精确，因此被广泛用于膜受体的精确定位。
包埋后免疫标记包埋后免疫标记具有超微结构保存较好、方法简便可靠、阳性结果重复性高的优点，可对同一组织块的连续切片做各种对照免疫标记，能十分准确地解释免疫标记结果，而且还能在同一张切片上进行多重免疫标记，尤其适合于颗粒性标记物（胶体金标记）的免疫化学定位标记，是目前应用最广的免疫电镜技术。
但是该方法也有明显的缺点，抗原在脱水、浸透及树脂包埋过程中可能被破坏，且抗原被树脂遮盖不易与抗体接触，使免疫标记的阳性率下降。
尤其是后固定剂锇酸对抗原的破坏较严重，因此常常避免使用。
为了得到精细的超微结构并提高阳性标记率，必须注意以下几个方面：通过预实验确定合适的固定液，在保存抗原活性的前提下，也能得到较好的超微结构。
固定液一般不用四氧化锇，因其会使抗原活性明显降低。
选用低温包埋剂。
免疫电镜用载网要选用镍网或金网，而不用铜网，因铜网会与某些化学物质产生反应而影响标记结果。
冷冻超薄切片免疫标记冷冻超薄切片免疫电镜技术的特点是组织不经脱水包埋直接冷冻，在冷冻状态下进行超薄切片，然后进行免疫标记。
该项技术克服了上述两种方法的缺点，能更理想地保存一些生物大分子的活性，极大地提高了免疫标记的敏感性，但在冷冻过程中超微结构会受到冰晶的破坏。
1996年，LiouW等改良了冷冻超薄切片技术，用甲基纤维素和醋酸铀混合液（含1.5％～2％甲基纤维素，0.3％～3％醋酸铀的水溶液）代替传统的蔗糖溶液作为将冷冻切片从冷冻槽中转移到镍网上的溶液，得到了保存良好的超微结构，使该项技术更加完美，应用也越来越广泛。