免疫电镜技术(immunoelectron microscopy,IEM)又称为免
第十五章现代免疫技术[整理后]可编辑全文
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免疫电镜技术常用标记技术 II
酶标记
胶体金标记
胶白一体样金具是有氯高金电酸子(H密Au度Cl，4)的在水电溶镜胶比颗铁粒蛋，白如颗同粒铁更蛋致 密，易于辨认，定位比酶反应物精确。 胶体金容易和多种大分子物质、包括抗体、A蛋白、 凝集素等结合。 根据制备方法不同，可以得到直径在3—150nm之 间的各种大小的胶体金颗粒；分别使用不同直径的 胶体金颗粒制备标记物，可以在同一标本片上显示 两种或多种抗原物质，即所谓双标记或多标记。 胶体金标记物还可代替铁蛋白作为扫描免疫电镜的 标记物。因此，胶体金成为当前免疫电镜工作者最 感兴趣的标记物。
Western blot method
第六节 酶联免疫分析技术
免疫技术为检测体液中微量物质的固相免疫测 定方法，称为酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。 其基本原理是先将已知的抗体或抗原结合在某 种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时， 将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固 相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。 用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。 然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或 定量测定。
流式细胞仪
第五节 免疫印迹技术
免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效 方法。 该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展 起来的一种新的免疫生化技术。 将含有目标蛋白(抗原)的样品首先用SDS—聚丙烯 酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)或非变性电泳(Native— PAGE)等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤 维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再 用抗原抗体反应进行特异性检测。
免疫电镜的原理和应用
免疫电镜的原理和应用1. 免疫电镜的原理免疫电镜（Immunoelectron microscopy）是将免疫学技术和电子显微镜技术相结合的一种研究方法。
免疫电镜可以用来研究细胞和组织中的抗原及其与抗体之间的特异性相互作用。
免疫电镜的基本原理如下： - 在待检样品（细胞或组织）中，使用特异性的抗体识别和结合目标抗原。
- 抗体与抗原结合后，通过标记抗体（如金粒标记抗体）来可视化目标抗原的位置。
- 经过特殊的处理和固定，样品被覆盖上一层的金粒标记抗原。
- 样品经过电镜观察，金粒标记的抗原会显示为黑色点，从而可以确定抗原的位置。
2. 免疫电镜的应用免疫电镜在生物医学研究中有广泛的应用。
以下列举了一些常见的免疫电镜应用：2.1 亚细胞结构研究免疫电镜可以用于研究细胞和亚细胞结构的相关问题。
通过标记抗体，可以识别和定位细胞中的特定蛋白质、酶、受体等，从而揭示细胞内的分布和定位。
免疫电镜在细胞器分析、分泌途径研究和细胞内信号传导等方面有重要应用。
2.2 病毒研究免疫电镜被广泛应用于病毒学研究中。
通过标记与病毒抗原结合的抗体，可以确定病毒颗粒在细胞中的位置和分布。
这对于研究病毒寄生、复制和传播的机制非常重要。
2.3 免疫组化研究免疫电镜也可以用于免疫组化研究。
免疫组化是一种检测某个特定分子或蛋白质在组织中分布的方法。
通过将组织样品与特定抗体结合，然后通过免疫电镜观察标记的抗体位置，可以确定该蛋白质在组织中的定位。
2.4 病理诊断和研究免疫电镜在病理诊断和研究中也有重要应用。
通过观察和定位细胞或组织中的抗原，可以为病理学家提供更准确的诊断信息。
同时，免疫电镜也可以用于研究疾病的发病机制、新药的研发等领域。
2.5 细胞分子生物学研究免疫电镜在细胞分子生物学研究中发挥着重要的作用。
通过免疫电镜的观察，可以研究特定蛋白质或分子在细胞内的分布和相互作用方式。
这对于揭示细胞内分子机制、信号传导和细胞功能非常重要。
3. 总结免疫电镜是一种结合了免疫学和电子显微镜技术的研究方法。
免疫电子显微镜成像技术的优化研究
免疫电子显微镜成像技术的优化研究一、背景介绍随着现代生命科学研究的不断深入，人们对生物分子和细胞结构的认识也越来越深入。
在这个过程中，电子显微镜技术成为了其重要的工具之一。
免疫电子显微镜（Immuno-electron Microscopy，简称IEM）技术是近年来发展起来的一种新技术。
本文主要关注免疫电子显微镜成像技术的优化研究。
二、免疫电子显微镜成像技术简介免疫电子显微镜是一种基于抗体分子的电子显微镜技术。
基本原理是将特定的抗体与要被检测的生物分子或结构上的特定部分结合，通过抗体-抗原的结合来实现标记和识别，从而显示出被检测的特定结构或分子。
目前，IEM广泛应用于生命科学研究中，特别是在细胞结构，细胞器、膜、细胞内通讯、蛋白质酶分子和信号传递等方面取得了突破性进展，为生物分子和细胞结构的研究提供了重要的工具。
三、免疫电子显微镜成像技术的优化研究优化免疫电子显微镜成像技术是为了提高其检测灵敏度、精度和抗体特异性。
以下是优化免疫电子显微镜成像技术的方法：1. 抗体选择抗体选择是影响IEM结果的最主要因素。
在IEM分析中，抗体选择需要考虑多个因素，例如抗原特异性、亚型特异性、亲和力、特异性、染色效率等。
同时，还需要确定检测的标记，如金颗粒、荧光标记探针等。
因此，在IEM实验之前，必须要进行足够的抗体和样品的前体实验。
2. 样品处理在IEM操作中，样品的处理也是十分关键的一个环节。
样品处理的关键是开放细胞或细胞内结构，以便于抗体能够与其特定区域的抗原结合。
理想的样品处理程序不但可以清除大量的脂质和其他非特异性结构，而且可以使细胞表面上的特定区域保持稳定的状态。
3. 标记探针的缩小标记探针的大小也影响着IEM成像质量。
传统的标记方法中金颗粒大小一般在10-20nm左右，这样的大小已经足够小，使得探針能夠更好的穿过细胞膜。
但是，随着现代高分辨率成像技术的发展，标记探针的尺寸也在逐渐缩小。
有研究者在标记探針上使用了1-2nm的金颗粒来标记抗体。
一名词解释
一、名词解释1．cell （细胞）：是由膜包围的能独立进行繁殖的原生质团，是生物体最基本的结构和功能单位，具有进行生命活动的最基本的要素。
2．prokaryotic cell （原核细胞）：无核膜，DNA 游离在细胞质中；染色体为环状，仅有一条；缺少发达的内膜系统；细胞小，多在0.2~10μm 之间；至今未发现细胞骨架。
3．eukaryotic cell （真核细胞）：有膜结构围成的细胞核，DNA 与蛋白质结合，形成染色质（体），基因组至少有两条染色体；有内膜系统，包括内质网、高尔基体、溶酶体、线粒体、叶绿体等；具有细胞骨架系统。
4．archaeobacteria （古细菌）：又称原细菌、古核生物，使一些生长在极端特殊环境中的细菌；最早发现的古核生物为产甲烷细菌，后来又陆续发现盐细菌、硫氧化菌等。
5．plasmid （质粒）：细菌内除了核区的DNA 外，存在的可自主复制的遗传因子。
一、名词翻译并解释1.resolution （分辨率）：是指区分开两个质点间的最小距离。
2.fluorescence microscopy （荧光显微镜技术）：分子由激发太回到基态时，由于电子跃迁而由被激发分子发射的光称为荧光。
荧光显微镜技术包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术 。
荧光显微镜技术用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。
3.autoradiograply （放射自显影）：是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr 或AgCl ）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与定量的一种细胞化学技术。
4.scanning electron microscopy （扫描电子显微镜，SEM ）：扫描电子显微镜是1965年发明的较现代的细胞生物学研究工具，主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生各种效应，其中主要是样品的二次电子发射。
免疫电镜实验步骤
免疫电镜实验步骤免疫电镜（immuno-electron microscopy，IEM）是一种结合了免疫学和电镜技术的方法，能够直接在细胞或组织水平上观察和定位特定抗原。
它是一种有力的工具，可以帮助研究人员研究细胞和组织中的蛋白质相互作用，了解其在亚细胞水平的功能和定位。
免疫电镜实验步骤如下：1. 细胞或组织固定：首先，需要处理样品以使其具有电镜处理所需的高度稳定性。
通常，细胞或组织样本会使用交联剂如戊二醛进行固定。
固定的目的是保持样本的形态和结构，并防止其在后续处理过程中发生破坏。
2. 裁剪：将固定的细胞或组织样品切成适当的尺寸和形状以适应电镜的观察要求。
这通常需要非常小的块，以便于后续处理。
3. 过渡液处理：将样品经过一系列的过渡液处理，以去除残留的固定剂和使样品适应后续处理步骤。
这些过渡液通常是缓冲液，比如磷酸盐缓冲液。
4. 与抗原特异性的抗体结合：将样品与抗原特异性的抗体结合，以实现对特定抗原的检测。
这一步骤是免疫电镜实验的核心。
抗体可以直接标记电镜可见的标记物，如金颗粒，或作为未标记抗体来标记后续参与复合物的二级抗体。
5. 渗透处理：对样品进行渗透处理，旨在增强电镜对样品的可见度。
渗透剂的选择基于具体的研究问题，可以使用醋酸铀、酸酮铀等物质。
6. 样品固化：使用适当的聚合剂，如聚合酮树脂，对样品进行固化，以使其能够保持其形态和结构，并便于切片后的后续处理。
7. 切片：将固化的样品切成极薄的切片，通常在50-100 nm的范围内。
切片过程通常通过使用超微切片机或超声刀来完成。
8. 样品染色：对切片的样品进行染色以增强对抗原的可见度。
可以使用核苷酸染料如乌尔红，或金标记等染色剂。
9. 电镜观察：将样品放置在电子显微镜中，并使用适当的电压和放大倍数进行观察和记录。
通过观察电镜图像，可以获得关于抗原的位置、分布和亚细胞定位的信息。
总结：免疫电镜实验是一种强大的技术，可以帮助研究人员观察和定位特定抗原。
医学细胞生物学名词解释（3）
医学细胞生物学名词解释（3）医学细胞生物学名词解释大全27.细胞骨架系统(cytoskeletonicsystem)细胞骨架是由蛋白质与蛋白质搭建起的骨架网络结构，包括细胞质骨架和细胞核骨架。
细胞骨架系统的主要作用是维持细胞的一定形态，使细胞得以安居乐业。
细胞骨架对于细胞内物质运输和细胞器的移动来说又起交通动脉的作用;细胞骨架还将细胞内基质区域化；此外，细胞骨架还具有帮助细胞移动行走的功能。
细胞骨架的主要成分是微管、微丝和中间纤维。
28.细胞社会学(cellsociology)细胞社会学是从系统论的观点出发，研究细胞整体和细胞群体中细胞间的社会行为(包括细胞间识别、通讯、集合和相互作用等)，以及整体和细胞群对细胞的生长、分化和死亡等活动的调节控制。
细胞社会学主要是在体外研究细胞的社会行为，用人工的细胞组合研究不同发育时期的相同细胞或不同细胞的行为;研究细胞之间的识别、粘连、通讯以及由此产生的相互作用、作用本质、以及对形态发生的影响等。
细胞生物学名词解释(王金发版)——2.细胞生物学研究方法2017-04-09 20:54 | #2楼1．分辨率(resolution)分辨率是指能分辨出的相邻两个物点间最小距离的能力，这种距离称为分辨距离。
分辨距离越小，分辨率越高。
一般规定∶显微镜或人眼在25cm明视距离处，能清楚地分辨被检物体细微结构最小间隔的能力，称为分辨率。
人眼的分辨率是100 μm;光学显微镜的最大分辨率是0.2μm。
2. 荧光(fluorescence)分子由激发态回到基态时，由于电子跃迁而由被激发分子发射的光。
物质经过紫外线照射后发出荧光的现象可分为两种情况，第一种是自发荧光，如叶绿素、血红素等经紫外线照射后，能发出红色的荧光，称为自发荧光;第二种是诱发荧光，即物体经荧光染料染色后再通过紫外线照射发出荧光，称为诱发荧光。
3. 荧光显微镜(fluorescence microscope)以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。
常用的免疫标记技术
常用的免疫标记技术免疫标记技术是一种用于检测和分析生物分子的方法，其中利用特定的抗体或其他免疫物质标记目标分子，从而使这些分子能够被观察和测量。
以下是一些常用的免疫标记技术：1.免疫荧光技术（Immunofluorescence）：在这种技术中，用于检测目标分子的抗体被标记上荧光染料。
通过荧光显微镜观察样本，可以定位和定量目标分子的位置和数量。
2.免疫酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）：这是一种广泛用于检测抗体或抗原的技术。
ELISA 利用酶标记的抗体或抗原与目标分子结合，然后通过酶的底物反应来产生可测量的信号。
3.免疫印迹技术（Western Blot）：Western Blot用于检测蛋白质。
蛋白质被电泳分离，然后通过免疫印迹将其转移到膜上。
接着使用特定抗体标记的酶或荧光物质来检测目标蛋白质。
4.免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）：IHC用于在组织切片中检测特定抗原的存在。
切片上的抗原与标记有酶、荧光染料或其他标记的抗体结合，通过显微镜观察抗原的分布。
5.流式细胞仪技术（Flow Cytometry）：该技术通过激光照射细胞，测量细胞表面或内部的荧光标记物，以分析细胞的类型、状态和功能。
6.蛋白质质谱法（Mass Spectrometry）：将样品中的蛋白质离子化，并通过质谱仪测量质量。
免疫质谱结合了免疫标记和质谱技术，可用于检测和鉴定蛋白质。
7.免疫电镜技术（Immunoelectron Microscopy）：在电子显微镜下观察样本，通过标记的抗体来可视化细胞或亚细胞结构中的特定蛋白质。
8.免疫磁珠技术（Immunomagnetic Bead Assay）：使用带有磁珠的抗体，通过磁场将目标分子分离出来。
常用于细胞分离和分析。
这些免疫标记技术在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域发挥着关键作用，可以用于检测和定量各种生物分子，如蛋白质、抗体、核酸等。
免疫电镜技术
组织或游离细胞内抗原
• 需对样品进行特殊处理－增加膜的通透性 固定剂+1%Triton X100，10-20min 0.1MPB冲洗，10min 0.5% 1%Triton X100，30min 0.1MPB冲洗，10min －接包埋前法标准程序
包埋后法：
• 适用： 组织细胞（内或外）抗原 游离细胞内部抗原
• 预先冷却好全部用具
3. 浸透与包埋
[目的]使包埋剂浸透样品后，固化成硬块 低温包埋剂：丙稀酸类，水溶性
不含环氧基 低温下可聚合 两种： Lowicryl K4M(德国)：紫外线照射下聚合 LR White(英国)：55 ℃ 聚合,不需紫外线照射
低温(0-4℃)聚合，需用加速剂
低温包埋剂（Lowicryl K4M）
• 常规电镜：形态结构 • 免疫学方法： 组分 • 免疫电镜：形态结构+组分
免疫电镜延伸了免疫光镜 免疫化学技术与电镜技术结合的产物
在超微结构水平定位某些分子: Ag, 受体
Pancreas
Ultrastructure and chromogranin A immunogold labelling of ECL cell carcinoids. APMIS 113: 506–12, 2005
• 制备免疫电镜超薄切片 免疫标记
免疫电镜超薄切片的制备
• 低温包埋超薄切片法 • 冰冻超薄切片法
1.冷固定
• 取材 • FA+GA固定液中4°C， 2~3h(中间1-2h可取
出修块) • 封闭游离醛基（0.5M NH4Cl in 0.1M PB）
4°C， 2h • 冲洗（0.18M蔗糖in 0.1M PB） 4°C 2h或过
• 羟丙基/甲基丙烯酸酯（基本成分） • 乙二醇丙烯酸酯（交连固化剂） • 苯甲酸烷基乙醚（激活剂,引发剂）
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免疫电镜技术（immunoelectron microscopy，IEM）又称为免疫细胞化学技术，是在免疫组织化学技术（immunohistochemistry）的基础上发展起来的，它是利用抗原与抗体特异性结合的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的技术方法。
该方法为精确定位各种抗原的存在部位、研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效的手段。
免疫电镜技术主要经历了铁蛋白标记技术、酶标记技术以及胶体金标记技术三个主要发展阶段。
铁蛋白标记技术适用于细胞膜表面抗原的定位，由于其分子量较大，不易穿透细胞膜，定位细胞内抗原较为困难。
铁蛋白对电镜包埋剂的非特异性吸附很强，不适用于包埋后免疫标记，使其应用受到一定限制。
酶标记免疫电镜技术是将酶（主要是过氧化物酶）与抗体相交联，抗原抗体反应后，加底物显示酶的活性部位，酶反应产物经OsO4处理变为具有一定电子密度的锇黑，可在电镜下观察。
过氧化物酶的相对分子量较小，与其交联的抗体较易穿透经处理的细胞膜，可用于细胞内抗原的定位。
但是酶反应产物比较弥散，因此分辨率不如颗粒性标记物高。
胶体金标记免疫电镜技术是目前应用最广的免疫电镜标记物，该技术是将胶体金作为抗体的标记物，用于细胞表面和细胞内多种抗原的精确定位。
胶体金主要具有以下几个优点：（1）胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明显改变，可制备抗体-胶体金、蛋白A-胶体金、卵白素-胶体金、植物凝集素-胶体金等用于免疫电镜；（2）在电镜下金颗粒电子密度高、圆形且界线清晰，易于辨认，定位比酶反应物更精确；（3）胶体金标记物易于制备，并可以根据需要制备大小不同（1～150nm）的胶体金，因此可进行免疫电镜的双重或多重标记；（4）金颗粒能发射强烈的二次电子，是扫描电镜的理想标记物；（5）胶体金经过银显影增强后，金颗粒外周吸附大量银颗粒而呈现黑色或黑褐色，因此也能用于光学显微镜观察。
此外，胶体金还能用于冷冻蚀刻标本的免疫标记。
抗体的制备，标本的处理，免疫标记，对照实验、结果的观察和解析。
抗体的制备特异性高、亲和力强的高效价抗体是获得理想的免疫标记结果的首要条件要。
抗体可购买或自己制备。
大分子完全抗原，可直接免疫动物如家兔、山羊、豚鼠、小鼠来获得抗体。
半抗原，用偶联剂使半抗原与大分子物质结合成复合物，再去免疫动物产生抗体，大分子物质称为载体蛋白，以甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白或血蓝蛋白最为常用。
偶联剂为戊二醛或碳二酰亚胺等。
目前细胞杂交瘤技术制备的单克隆抗体最为理想。
标本的处理为了既能将抗原准确定位甚至定量，又能观察到近似于生活状态下的细胞超微结构，必须选择合适的固定剂，慎重处理样品。
取材单细胞：培养细胞或血细胞应随用随取。
悬浮培养细胞可先离心（800 rpm，5 min），用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗1次后进行固定。
贴壁细胞则可先将其培养在玻片上，用PBS轻轻冲洗后立即固定，也可用胰酶将细胞消化下来，按悬浮培养细胞的制备方法制备。
组织：取组织块时做到越快越好，最好在没有停止血流前就取材。
若观察的对象为肺、大脑、脊髓或内分泌器官等比较柔软的组织，应先做灌注固定，再用锐利的刀片将其切成约2 mm×2 mm×l mm大小的组织块，切时要避免挤压与牵拉，然后投入到固定液中继续固定。
固定固定剂常会对抗原的活性产生不同程度影响，为了保存细胞的超微结构和抗原的活性，应通过预试验，确定固定剂的种类、浓度、温度、pH及固定时间和方式，可用已知效价的抗原进行试验，选择合适的固定方法。
常用的免疫电镜标本固定液多聚甲醛-戊二醛固定液（简称PG）：1％多聚甲醛对组织细胞的抗原性影响不大，若加入超过0.1％戊二醛，抗原性就会迅速减弱；当戊二醛的浓度低到0.01％～0.05％时，对抗原性的影响便不显著，而细胞超微结构的保存也可获得很大改善。
所以推荐用1％多聚甲醛加0.01％～0.05％戊二醛作为免疫电镜标本的固定剂，固定时间为4～5 h。
对有些抗原性较强的标本，也可采用4％多聚甲醛加0.05％～0.5％戊二醛进行固定。
某些抗原对戊二醛极其敏感，固定液只能用2～4%多聚甲醛，而不能加戊二醛。
不充分的固定会造成抗原提取或移位，同时醛类等交联固定剂会改变蛋白质分子的结构而影响其抗原性，所以在不明显影响抗原性的前提下，选择合适的固定浓度和时间，尽可能强一些为好。
这里我们特别推荐使用美国EMS 公司的多聚甲醛溶液和戊二醛溶液，常用货号为157-8和16220。
过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛混合固定液（简称PLP）：PLP液含0.01 mol/L过碘酸钠、0.075mol/L 赖氨酸、2％多聚甲醛及0.037mol/L磷酸缓冲液。
其机制是借助过碘酸盐氧化抗原，一般为糖蛋白的糖类部分，使其羟基变为醛基，这样赖氨酸的双价氨基就能与醛基结合从而把抗原交联起来。
由于大多数组织抗原含蛋白质与糖类，抗原决定簇位于蛋白部分，该固定剂有选择性地固定糖类，这样既稳定了抗原，又不影响抗原决定簇与抗体的结合。
加入低浓度的多聚甲醛则能稳定蛋白与脂类。
因为赖氨酸价格较贵，此固定液不如PG固定液经济。
苦味酸-多聚甲醛-戊二醛固定液（简称PAPG）：PAPG液含4％多聚甲醛、15％（V/V）苦味酸、0.5％戊二醛、pH为7.3。
苦味酸穿透迅速，可在不影响抗原活性的前提下固定蛋白质，改善对膜和胞质的保存。
特别是不能采用高浓度的戊二醛与锇酸做后固定时（如包埋后的免疫标记），在前固定液中加入苦味酸对超微结构的保存有很大帮助。
固定方法与时间灌注固定：这是固定效果最好的方式，能使超微结构得到很好的保存。
以大鼠为例，麻醉后，用注射针头经左心室向主动脉灌注固定液，静脉压为120mm Hg柱，在5～15 min内每200g体重灌注150 ml固定液。
浸没固定：将手术或灌注后切成的标本块浸没在固定液中固定，浸没固定时间常为2～5h，游离细胞固定0.5～1h。
包埋包埋剂类型：环氧树脂包埋剂和低温包埋剂。
包埋前免疫标记：即对已固定的样品先进行免疫标记，然后进行包埋、超薄切片并观察结果，一般选用环氧树脂包埋剂。
环氧树脂本质是疏水性的，在包埋前样品必须先进行完全脱水，然后在温箱中进行热聚合。
热聚合会使大多数抗原变性，因此该包埋剂不适用于包埋后免疫标记。
包埋后免疫标记：指组织标本经固定及树脂包埋，制作成超薄切片后再进行免疫化学标记的方法，此方法多用低温包埋剂，如Lowicryl系列包埋剂、LR White包埋剂和LRGold包埋剂。
这三种包埋剂均能在低温下（-35℃～-80℃）用紫外光（波长315～360nm）进行聚合，避免了高温对抗原性的负面影响，提高了阳性标记率，而且对胶体金的非特异性吸附少，对温度敏感的抗原应选择使用低温包埋剂。
免疫标记根据免疫标记与标本包埋之间的不同关系，可分为包埋前免疫标记、包埋后免疫标记和不用包埋的冷冻超薄切片免疫标记。
根据具体的标本、抗原的部位及性质并结合实验室的具体条件选择恰当的方法。
这三种免疫标记方法，都包括非特异性位点的封闭、抗体与抗原特异性结合的免疫反应、反应部位的示踪显示等基本步骤。
包埋前免疫标记优点一是切片在免疫标记前不经锇酸固定、脱水、树脂包埋及高温聚合的过程，抗原活性不会受到上述过程的影响，而且抗原暴露充分，标记的阳性率高，非特异性反应少。
二是免疫标记后还可进行半薄切片，在免疫反应阳性部位做定位超薄切片，进一步提高电镜的检出率。
三是免疫标记完毕后，用戊二醛与锇酸再次固定组织，可使抗原抗体的结合更加牢固，并有利于膜结构的保存。
包埋前免疫标记主要用于细胞膜表面抗原的免疫定位，以及用于某些易被脱水剂和树脂成分溶解和变性的抗原的检测。
包埋前免疫标记细胞内抗原受到标记抗体的穿透性限制，为了提高对细胞内抗原的标记率可以采取以下措施：厚切片厚切片进行包埋前免疫标记，需将固定后的组织厚切片（单细胞团不需厚切片），以利于标记抗体的穿透。
厚切片的方法有以下几种：冰冻切片：用恒冷箱冰冻切片机将固定后的组织块切成8μm左右的厚片。
将切下的厚片放入盛有PBS的小玻璃瓶内备用。
也有的将厚片直接贴在载玻片上进行免疫标记，这样做虽然操作比较方便，但因抗体只能与厚片的一面接触，所以会在一定程度上影响标记的阳性率。
震动切片：震动切片可以切出20μm～30μm的厚片，免疫电镜用只需20μm～80μm的切片。
震动切片的优点是可以避免冰冻对组织带来的损害，但它切出来的切片过厚，即使在使用穿透剂的条件下，免疫试剂也仅能穿透切片表面8μm～9μm，而更深层的组织就不易被标记。
增加细胞膜的通透性用0.01％Saponin或0.1％Triton X-100等活性剂处理5～8min，以增加细胞膜的通透性。
但这些化学物质会对超微结构产生一定程度的破坏，所以应根据不同的组织或细胞，严格控制活性剂的应用浓度与时间。
也可用冻融的方法增加细胞膜通透性，标本先进行防冰晶处理（厚片在含15％甘油、20％蔗糖的PBS 中振摇沉底），在液氮中速冻0.5～1min后用PBS迅速回温。
选用相对分子质量较小的标记物辣根过氧化物酶与IgG的Fab片段交联物，分子质量较小，约100kD，较易进入细胞内。
也可用IgG Fab-lnm金作为标记物，标记后经银加强染色的纳金包埋前标记法。
由于该标记物较易穿透到组织和细胞内，且定位比酶标抗体精确，因此被广泛用于膜受体的精确定位。
包埋后免疫标记包埋后免疫标记具有超微结构保存较好、方法简便可靠、阳性结果重复性高的优点，可对同一组织块的连续切片做各种对照免疫标记，能十分准确地解释免疫标记结果，而且还能在同一张切片上进行多重免疫标记，尤其适合于颗粒性标记物（胶体金标记）的免疫化学定位标记，是目前应用最广的免疫电镜技术。
但是该方法也有明显的缺点，抗原在脱水、浸透及树脂包埋过程中可能被破坏，且抗原被树脂遮盖不易与抗体接触，使免疫标记的阳性率下降。
尤其是后固定剂锇酸对抗原的破坏较严重，因此常常避免使用。
为了得到精细的超微结构并提高阳性标记率，必须注意以下几个方面：通过预实验确定合适的固定液，在保存抗原活性的前提下，也能得到较好的超微结构。
固定液一般不用四氧化锇，因其会使抗原活性明显降低。
选用低温包埋剂。
免疫电镜用载网要选用镍网或金网，而不用铜网，因铜网会与某些化学物质产生反应而影响标记结果。
冷冻超薄切片免疫标记冷冻超薄切片免疫电镜技术的特点是组织不经脱水包埋直接冷冻，在冷冻状态下进行超薄切片，然后进行免疫标记。
该项技术克服了上述两种方法的缺点，能更理想地保存一些生物大分子的活性，极大地提高了免疫标记的敏感性，但在冷冻过程中超微结构会受到冰晶的破坏。
1996年，LiouW等改良了冷冻超薄切片技术，用甲基纤维素和醋酸铀混合液（含1.5％～2％甲基纤维素，0.3％～3％醋酸铀的水溶液）代替传统的蔗糖溶液作为将冷冻切片从冷冻槽中转移到镍网上的溶液，得到了保存良好的超微结构，使该项技术更加完美，应用也越来越广泛。