电镜教学(病毒)

/ 病毒的形态研究则以电镜技术最为重要。 烟草花叶病毒是最早进行电镜观察的一 种病毒。Kausche等（1939）首次用电镜 证明烟草花叶病毒是一种棒状颗粒，并 测出它的近似大小，但图象极不清晰。
50年代末，由于高分辨率电镜的出
现、 负染色制样技术的建立，使电 镜成为目前研究病毒形态的一个重 要的工具。 电镜观察不仅可以区别各种病毒的 形态，而且还可以分辨病毒蛋白质 外壳的亚基是如何有序的排列。
标本处理：
粪便用Eagle氏或Hanks液（或生理盐水） 制成10%的原液，为了增加病毒含量， 将细胞残渣里的病毒全部释放，可用超 声波充分振荡后，经离心，取上清液做 病毒悬液进行电镜检查。 如果电镜下未发现病毒，可离心，取沉 淀滴加蒸馏水重新悬浮，进行琼脂扩散 和电镜检查。 如果有恢复期病毒的血清，亦可做免疫 电镜检查。
样品制备步骤：
取0.9ml病毒悬液加0.1ml 1：10稀释的 恢复期病人血清充分混匀 ↓ 37℃1小时后，置4℃冰箱过夜 ↓ 然后用琼脂扩散法或假复型法制作 电镜标本 ↓ 负染色后，电镜检查
根据抗体凝聚的病毒颗粒的多少和
程度以（+）表示 如果检查不到抗体包被的病毒颗粒， 可离心，将沉淀重悬浮于1-2滴蒸馏 水中，再用同样方法滴膜、负染。 利用免疫电镜技术发现和鉴定了许 多重要的病毒。
（五）鼻咽分泌物
从鼻咽分泌物和洗液中发现呼吸道
病毒（流感、副流感、呼吸道细胞 融合病毒、冠状病毒等）是可能的, 其中尤以冠状病毒较易发现。 用电镜检查鼻咽分泌物中的病毒， 效果较差，必要性不大。
四、病毒的基础研究：
(一)病毒形态结构研究：
电镜技术 X线衍射技术 物理化学技术 \ 在病毒结构研究中起重要作用
电子显微镜技术 在病毒学中的应用
一、概述 二、病毒学研究中所用电镜样本制作 三、临床材料的取样和处理 四、病毒的基础研究
一、概述
病毒学的发展历程与电镜技术的 发展相辅相成，互相促进。

电镜技术的发展对病毒学发展 起了极大的促进作用。 在研究病毒侵入宿主细胞后，发生 了一系列的变化，又推动电镜技术 从简单的形态学观察发展到一个动 态的示踪过程。
（一） 负染色技术

负染色也叫阴性反差染色。
Hall（1955）和Huxley（1957） 首先采用的这种染色技术。

用磷钨酸（PTA）对灌木病毒及
烟草花叶病毒进行染色后，观察到 前所未见的细微结构。
1、 负染色的原理
负染色技术用重金属染液里的金属 原子作为电子“染料”，把密度较低的 生物标本（病毒）包绕而形成明显反差 的方法。 电子光束能够通过低电子密度的病 毒颗粒，而不能通过金属背景，从而使 病毒颗粒呈现出明亮清晰的结构，即负 反差。

复合型病毒

痘病毒：病毒体成砖形或卵圆形 噬菌体：大肠杆菌T2、T4、T6或λ 噬菌体， 均有非常复杂的结构，包括一个头部和 一个尾部。 它们有双对称结构，某些成分具有二十 面体对称，而有些成分是螺旋对称结构 。
4、电镜下病毒鉴别的主要依据
（1）衣壳的对称性：
病毒的基本结构：由 DNA或RNA构成的核心 、 蛋白质构成的衣壳。大多数病毒的衣壳属于立体 对称型，只有少数病毒，如正粘液病毒，副粘液 病毒的衣壳是螺旋对称型
在电镜照片上 (与正染色相反) 在黑背景中呈现出“白色”的样品。 负染色技术目前在病毒形态和结 构研究中最为成功。
负染色

正染色
阳性反差染色 染色剂与细胞微细结构 成分相结合 增加标本结构本身密度 增加其散射电子能力 细微结构呈黑色 未被染色的背景浅淡


阴性反差染色 细微结构本身不被 染色结构周围染色 背景被染色 散射电子的能力强 样品周围成暗色 结构本身成像浅
2）样品的浓度：
被检查的样品要有适当的浓度。太浓 太稀均影响电镜观察。
3）样品与染液的均匀分散度
为促进样品与染料的均匀分散提高染 色效果，可以采用某些分散剂
4） 悬液与染液的酸碱度
一般以中性或略偏酸性（PH 6.4－7）为宜。
5）染色时机的把握
吸去过多样品悬液后尽快滴加负染色液
注意：
进行负染色观察样品，应多次重
（一）皮肤病损：
皮肤的病毒病很多，主要是痘疱、 软疣和瘊类 例如：单纯疱疹（I型，II型） 水痘-带状疱疹 传染性软疣（痘病毒科） 寻常疣（乳多空科）
取材方便：
病损都在皮肤表面或皮肤粘膜交界处， 故采样方便。
易于识别：
这些病毒比较大（除乳多空病毒） 具有典型的形态，易于识别。
水疱状病损： 吸取疱液，滴在载网上，经 负染色后，电镜观察。
（2）漂浮法
带有支持膜的铜网，在悬液样品
的液滴上漂浮 再置于负染液的液滴上漂浮 漂浮期间，样品与染液吸附在铜 网的支持膜上 待干后电镜观察
（3）喷雾法
样品悬液
负染色液 等量混合 特制喷雾器喷到带有支持膜的铜网上 待干后电镜观察
优点：雾滴小，样品分布均匀 缺点：消耗较多的样品及染料 易使病毒扩散，不常用。

（三）尿液：
经超速离心浓缩尿液； 再进行假复型技术或琼脂扩散等进一步 浓缩。 尿中可检查到巨细胞病毒：

孕妇 巨细胞病毒可引起胎儿先天畸形。

人乳多空病毒：
肿瘤化疗和肾移植病人，由于免疫功能抑制， 潜伏的病毒被激发活跃。
（四）血清和脑脊液：

我国乙型肝炎带病毒率可高达12% 电镜在发现乙型肝炎病毒中起了重大作用。 乙型肝炎病毒40-42nm圆形Dane颗粒， 20-22nm的小圆形颗粒和管状颗粒都是 在电镜下鉴定出来的。 脑脊液中发现病毒机会罕见，电镜不 适于进行常规诊断。
标本－染液混合染色法：
病毒悬液和2％的磷钨酸染液等 量混合 用毛细管滴到有膜的载网上（吸 去过多的病毒－染液混合物）， 待干后进行电镜观察。 一般认为病毒浓度在105以上时不 难发现病毒。

5. 影响因素：
1）样品的纯度： 负染色样品纯度要求不是很高，最好进 行适当纯化；样品杂质太多，如大量的 细胞碎片、培养基残渣、糖类、各种盐 类结晶均会干扰染色效果及电镜观察。
2、优点
（1） 负染色技术反差好，分辨率高 o （可达20A 左右） （2） 简单易行、快速等优点。

在生物学研究中广泛的应用
主要用于细菌、病毒、分离的细胞器、
核酸大分子、蛋白质晶体及其他大分子
材料等研究，尤其是在病毒学领域。
3. 染色剂：
1）较高密度：染色剂应具有较高的 电子密度和较强的电子散射能力， 产生足够的反差。 2）溶解度高：优良的染色剂在水中 需要有良好的溶解度；染色剂不形 成颗粒状结构或析出结晶。 3）熔点较高：在电子束照射下不升 华挥发；
复实验，慎重作结论 应该做必要的对照，以排除某些 假象
（二）琼脂扩散技术：
检测的材料中病毒含量不足时，为了达 到浓缩病毒的目的，并去除材料中所含盐分， 可采用琼脂扩散法。
用0.8%琼脂铺好的琼脂块，把含病毒的悬 液滴到琼脂块上，然后把载网倒悬在这滴悬 液上。琼脂块把水分吸收，浓缩的病毒沾附 在载网上，再经过负染色后进行电镜观察。
（直接取材法）
皮肤结痂和疣类病损： 取下病损，加少许蒸馏水研磨 成悬液，弃细胞碎片，过滤、 超速离心，取沉淀染色、电镜 观察。（离心提纯法）
（二）粪便：

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病毒性腹泻、甲型肝炎、小儿麻痹及许多肠道 病毒感染性疾病可以从粪便中排出病毒。 抗体--病毒凝集法 取材原则： 1、发病早期取材，病毒含量较多； 2、取病程中几份大便，发现病毒机会多； 3、收集较多的大便：发现新病毒需深入 研究。
（三） 假复型技术：
琼脂或琼脂糖表面上粘附的病毒颗粒，
以假复型的形式转移到火棉胶膜上或 Formvar膜上。
此种方法：
能去除标本中的盐分、浓缩病毒； 减少不必要的杂质；比较费时。
方法：
1）将20%的琼脂糖块放到载玻片上，滴上 含病毒的悬液，将它放到紫外灯下照射 消毒，直到悬液被琼脂吸干。 2）在琼脂块的表面加一滴0.5%Formvar溶 液，把多余的Formvar用滤纸片吸走。 3）用刀片将琼脂块的边缘切除（为便于剥 离）轻轻将载有琼脂块的载玻片浸入 PTA或醋酸铀溶液中，并把Formvar膜剥 离和漂浮到染液水面上。
1） 糖蛋白：暴露在病毒体外表面， 有一个糖基化的亲水末端和一个 保持在脂质双层中的疏水末端 2） 基质蛋白： 电镜下可见病毒体外表面的糖蛋 白是穗状突起。
2、病毒形态
1）螺旋对称的棒状病毒 2）二十面体对称球状病毒 3）复合型病毒



裸露的螺旋对称型：烟草花叶病毒 有包膜的螺旋对称型：粘病毒 裸露的二十面体立体对称型：腺病毒、呼肠病 毒、乳多空病毒 有包膜的二十面体立体对称型：疱疹病毒、白 血病病毒 复合型：痘病毒、噬菌体
4）分子细小，容易在不规则的样品表 面渗透到各个细微角落； 5）与样品不发生化学反应；这样才能 客观地显示样品的真实形态。 凡密度比生物标本大4倍以上的金属 溶液均可作为负染色液； 在病毒研究中最常使用： 1-3%磷钨酸盐水溶液 0.1-1%醋酸铀水溶液

4. 负染色方法：
（1）滴染法： 样品悬液滴到有支持膜的铜网上 将染色剂溶液滴到样品上 自然干燥后即可电镜观察
棒状病毒：
烟草花叶病毒是棒状病毒的代表。 弹状病毒或正粘和付粘病毒的核衣壳也是 螺旋对称。 无囊膜的病毒之螺旋对称衣壳非常紧密; 有囊膜的病毒之螺旋对称衣壳则较柔和， 以便能盘绕在囊膜中。 电镜照相可见到螺旋对称衣壳的旋转螺旋 结构。

球状病毒：
是一类分布范围最广的病毒，包括小 DNA病毒、乳多空病毒、小RNA病毒、 呼肠孤病毒。 所谓球状病毒实际具有二十面体对称。蛋 白质亚基组成的球状衣壳。根据立方对称 的原则，二十面体应有5，3，2三种对称 形式。 二十面体对称衣壳：蛋白质单体形成衣壳 子粒结构。衣壳子粒在电子显微镜照相中 可见。