免疫电镜技术
免疫电镜技术步骤
免疫电镜技术步骤下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by the editor. I hope that after you download them, they can help yousolve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts,other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!免疫电镜技术是一种高分辨率的电子显微镜技术，结合了免疫学和电子显微镜技术的优势，可用于检测细胞和组织中的特定抗原。
免疫电镜技术基本原理
免疫电镜技术基本原理
免疫电镜技术是一种结合了免疫学和电镜学的高级技术，它可以用来检测细胞和组织中的蛋白质、抗原和抗体等分子。
免疫电镜技术的基本原理是利用抗体与抗原的特异性结合来标记细胞或组织中的分子，然后通过电镜观察标记物的位置和形态。
免疫电镜技术的步骤包括样品制备、抗体标记和电镜观察。
首先，需要将样品制备成超薄切片，通常使用冷冻切片技术来保持样品的原始结构和形态。
然后，将抗体与标记物结合，通常使用金粒子或荧光染料等标记物来标记抗体。
标记后的抗体可以与样品中的抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
最后，使用电镜观察样品中的标记物，可以通过电镜的高分辨率来观察标记物的位置和形态。
免疫电镜技术的优点是可以在细胞和组织水平上观察分子的位置和形态，可以提供高分辨率的图像，可以检测低浓度的分子，可以检测细胞和组织中的多种分子。
但是，免疫电镜技术也存在一些缺点，如样品制备复杂、标记物选择有限、标记效率低等。
免疫电镜技术是一种重要的生物学研究技术，它可以用来研究细胞和组织中的分子，可以提供高分辨率的图像，可以帮助我们更好地理解生物学现象。
免疫电镜的原理和应用
免疫电镜的原理和应用1. 免疫电镜的原理免疫电镜（Immunoelectron microscopy）是将免疫学技术和电子显微镜技术相结合的一种研究方法。
免疫电镜可以用来研究细胞和组织中的抗原及其与抗体之间的特异性相互作用。
免疫电镜的基本原理如下： - 在待检样品（细胞或组织）中，使用特异性的抗体识别和结合目标抗原。
- 抗体与抗原结合后，通过标记抗体（如金粒标记抗体）来可视化目标抗原的位置。
- 经过特殊的处理和固定，样品被覆盖上一层的金粒标记抗原。
- 样品经过电镜观察，金粒标记的抗原会显示为黑色点，从而可以确定抗原的位置。
2. 免疫电镜的应用免疫电镜在生物医学研究中有广泛的应用。
以下列举了一些常见的免疫电镜应用：2.1 亚细胞结构研究免疫电镜可以用于研究细胞和亚细胞结构的相关问题。
通过标记抗体，可以识别和定位细胞中的特定蛋白质、酶、受体等，从而揭示细胞内的分布和定位。
免疫电镜在细胞器分析、分泌途径研究和细胞内信号传导等方面有重要应用。
2.2 病毒研究免疫电镜被广泛应用于病毒学研究中。
通过标记与病毒抗原结合的抗体，可以确定病毒颗粒在细胞中的位置和分布。
这对于研究病毒寄生、复制和传播的机制非常重要。
2.3 免疫组化研究免疫电镜也可以用于免疫组化研究。
免疫组化是一种检测某个特定分子或蛋白质在组织中分布的方法。
通过将组织样品与特定抗体结合，然后通过免疫电镜观察标记的抗体位置，可以确定该蛋白质在组织中的定位。
2.4 病理诊断和研究免疫电镜在病理诊断和研究中也有重要应用。
通过观察和定位细胞或组织中的抗原，可以为病理学家提供更准确的诊断信息。
同时，免疫电镜也可以用于研究疾病的发病机制、新药的研发等领域。
2.5 细胞分子生物学研究免疫电镜在细胞分子生物学研究中发挥着重要的作用。
通过免疫电镜的观察，可以研究特定蛋白质或分子在细胞内的分布和相互作用方式。
这对于揭示细胞内分子机制、信号传导和细胞功能非常重要。
3. 总结免疫电镜是一种结合了免疫学和电子显微镜技术的研究方法。
免疫电镜的原理及应用范围
免疫电镜的原理及应用范围原理免疫电镜是一种结合了免疫学和电子显微镜技术的高分辨率成像方法。
它利用电子显微镜的高分辨率特性，配合免疫学的高度特异性，可用于检测和观察细胞和组织中特定抗原的位置和分布。
其基本原理如下：1.样品制备：首先，需要将待检的细胞或组织样品固定，并通过切片的方式制备出极薄的电镜切片。
2.特异性抗原标记：使用特异性抗体标记待检的抗原。
这可以通过直接标记或间接标记的方法来完成。
直接标记利用已标记的抗体直接与待检抗原结合；间接标记则需使用第二抗体与一抗体结合。
3.增强标记：为了提高抗原的可见性，常常会使用金颗粒或其他荧光染色方法来增强标记的信号。
4.电子显微镜观察：用已标记的样品进行电子显微镜的观察，利用电子束与标记物的相互作用来产生高清晰度的图像。
免疫电镜的原理基于电子束和抗原之间的相互作用方式，因此只有与抗原发生特异性反应的标记物才会被观察到。
这使得免疫电镜具有高度的特异性和灵敏度。
应用范围免疫电镜在生物医学研究中有着广泛的应用范围。
以下是免疫电镜的一些主要应用领域：细胞学研究免疫电镜可以用来观察细胞中特定抗原的位置和分布情况。
通过对细胞内部结构和膜特异性蛋白的定位，可以更好地理解细胞的功能和亚细胞结构。
例如，通过免疫电镜可以观察到线粒体、内质网、高尔基体等细胞器的位置和形态。
病原体研究免疫电镜可用于检测和定位病原体中的抗原，并研究它们与宿主细胞之间的相互作用。
通过观察病毒、细菌、寄生虫等病原体的抗原定位，可以深入了解它们在感染过程中的作用机制和侵袭策略。
免疫电镜在病原体的病理学研究和疫苗研发中具有重要意义。
免疫学研究免疫电镜可用于检测和研究免疫反应中产生的抗体和抗原。
通过观察抗体与抗原结合的位置和数量，可以评估免疫反应的强度和效果。
此外，免疫电镜还可用于研究自身免疫性疾病、免疫组织病理学以及免疫细胞相互作用等免疫学问题。
肿瘤研究免疫电镜在肿瘤学研究中也有广泛应用。
通过观察肿瘤细胞中特定抗原的表达和定位，可以提供关于肿瘤的类型、分级和预后信息。
免疫电镜观察方法
免疫电镜观察方法
免疫电镜是一种结合了免疫学和电镜学的技术，用于观察细胞和组织中的特定蛋白质。
其主要步骤包括样品制备、抗体标记、电镜观察等。
样品制备包括固定、切片、染色等步骤。
固定方法根据不同的细胞和组织类型可以选择不同的固定剂，比如戊二醛、硫酸铜等。
切片和染色方法也会根据样品类型的不同而有所差异。
抗体标记是免疫电镜的关键步骤之一。
该步骤主要包括一次抗体和二次抗体标记。
一次抗体是用于识别目标蛋白的抗体，通常是从动物中提取的。
二次抗体是一种针对一次抗体的抗体，通常会被标记上金粒子等物质以便于观察。
电镜观察是最终的步骤，其中需要使用电子显微镜观察样品中的金粒子标记。
由于金粒子的直径很小，通常需要使用高分辨率的电子显微镜来观察。
观察时需要注意样品的厚度和金粒子的分布情况。
免疫电镜技术具有高分辨率、高灵敏度和高特异性的优点，可以在细胞和组织水平上观察蛋白质分布和亚细胞结构等信息，对研究细胞和组织功能及其相关疾病具有重要意义。
- 1 -。
4.免疫电镜细胞化学技术
2．通过冰冻切片或震动切片获得厚切片。 冰冻切片 8µm ，震动切片20～80µm。
用0.8%琼脂铺好的琼脂块，把含病毒的悬液滴到琼脂 块上，然后把载网倒悬在这滴悬液上。琼脂块把水分吸收， 浓缩的病毒沾附在载网上，再经过负染色后进行电镜观察
。
3、假复型技术：
琼脂或琼脂糖表面上粘附的病毒颗粒，以假复型的 形式转移到火棉胶膜上或Formvar膜上。 此种方法：能去除标本中的盐分、浓缩病毒；减少不 必要的杂质；比较费时。
（2）电镜包埋前免疫金染色
① 新鲜组织经适当固定（0.5%戊二醛-2%多聚甲醛固 定0.5～1h），制成厚切片。 ② 0.05mol/L TBS pH7.4漂洗3次，每次15min。 ③ 0.1mol/L甘氨酸漂洗10min，灭活自由醛基。 ④ TBS漂洗，5min×3次， ⑤ 1%牛血清孵育组织块30min。
免疫电镜细胞化学技术
电镜细胞化学技术
电镜细胞化学技术是电镜技术与细胞化学技术相结合 产生的一门新技术，也称超微结构细胞化学。
目的：将化学研究与形态观察相统一，要求在细胞 超微结构水平上研究细胞内各种生化物质（蛋白质、核 酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情况以及这些生化物 质在细胞内的动态变化，用以阐明细胞、细胞器结构与 功能的相互关系。
基本原理：
铁蛋白是一种直径10～12nm的球形的蛋白质（分 子量450kD）,它含有致密的铁胶粒核心（直径约7.5nm ），该核心含2000～5000个铁原子，分布于四个区域 ，形成四个圆形致密区，具有很高的电子密度，因此 可用于电镜观察。抗体与铁蛋白通过低分子量的偶联 剂形成抗体-铁蛋白复合物，此复合物既保留抗体的免 疫活性，同时因为铁蛋白含有高电子密度的铁胶粒核 心，便于电镜观察。
免疫胶体金细胞电镜制样
免疫胶体金细胞电镜制样免疫胶体金细胞电镜制样是一种常用的技术手段，用于观察和研究细胞和组织中的抗原和抗体的相互作用。
本文将详细介绍免疫胶体金细胞电镜制样的方法和步骤，以及其在生物学研究中的应用。
一、胶体金的特性和应用胶体金是一种粒径较小的金颗粒悬浮液，具有良好的生物相容性和稳定性。
在光线照射下，胶体金颗粒呈现出特殊的颜色，可以方便地观察和分析。
由于胶体金颗粒表面具有丰富的官能团，可以与抗体或其他生物分子进行特异性的结合，因此被广泛应用于免疫学研究中。
免疫胶体金细胞电镜制样的原理基于抗原和抗体的特异性结合。
首先，将待观察的细胞或组织样品固定、包埋和切片。
然后，用特异性的一抗与样品中的目标抗原结合。
接着，加入与一抗结合的二抗，二抗上结合有胶体金颗粒。
最后，通过电镜观察和分析胶体金颗粒的位置和分布，从而得到目标抗原的位置和表达情况。
三、免疫胶体金细胞电镜制样的步骤1. 样品的固定：将细胞或组织样品用适当的固定液固定，保持其形态和结构的完整性。
2. 包埋和切片：将固定后的样品进行包埋和切片处理，制备出适合电镜观察的超薄切片。
3. 抗原解露：将切片进行抗原解露处理，使目标抗原暴露在切片表面，方便抗体的结合。
4. 一抗的结合：加入特异性的一抗，使其与目标抗原结合，并进行适当的洗涤，去除非特异性结合物。
5. 二抗的结合：加入与一抗结合的二抗，二抗上结合有胶体金颗粒，形成免疫复合物。
6. 后续处理：对切片进行适当的洗涤和固定处理，以稳定免疫复合物的结构和位置。
7. 电镜观察：使用电镜对样品进行观察和拍摄，分析胶体金颗粒的位置和分布，得到目标抗原的位置和表达情况。
四、免疫胶体金细胞电镜制样的应用免疫胶体金细胞电镜制样技术广泛应用于生物学研究中。
通过该技术，可以观察和研究细胞和组织中的抗原和抗体的相互作用，揭示细胞和组织的分子结构和功能。
具体应用包括以下几个方面：1. 免疫细胞化学：通过观察细胞中特定抗原的表达情况，研究细胞的功能和分化状态。
免疫电镜实验步骤
免疫电镜实验步骤免疫电镜（immuno-electron microscopy，IEM）是一种结合了免疫学和电镜技术的方法，能够直接在细胞或组织水平上观察和定位特定抗原。
它是一种有力的工具，可以帮助研究人员研究细胞和组织中的蛋白质相互作用，了解其在亚细胞水平的功能和定位。
免疫电镜实验步骤如下：1. 细胞或组织固定：首先，需要处理样品以使其具有电镜处理所需的高度稳定性。
通常，细胞或组织样本会使用交联剂如戊二醛进行固定。
固定的目的是保持样本的形态和结构，并防止其在后续处理过程中发生破坏。
2. 裁剪：将固定的细胞或组织样品切成适当的尺寸和形状以适应电镜的观察要求。
这通常需要非常小的块，以便于后续处理。
3. 过渡液处理：将样品经过一系列的过渡液处理，以去除残留的固定剂和使样品适应后续处理步骤。
这些过渡液通常是缓冲液，比如磷酸盐缓冲液。
4. 与抗原特异性的抗体结合：将样品与抗原特异性的抗体结合，以实现对特定抗原的检测。
这一步骤是免疫电镜实验的核心。
抗体可以直接标记电镜可见的标记物，如金颗粒，或作为未标记抗体来标记后续参与复合物的二级抗体。
5. 渗透处理：对样品进行渗透处理，旨在增强电镜对样品的可见度。
渗透剂的选择基于具体的研究问题，可以使用醋酸铀、酸酮铀等物质。
6. 样品固化：使用适当的聚合剂，如聚合酮树脂，对样品进行固化，以使其能够保持其形态和结构，并便于切片后的后续处理。
7. 切片：将固化的样品切成极薄的切片，通常在50-100 nm的范围内。
切片过程通常通过使用超微切片机或超声刀来完成。
8. 样品染色：对切片的样品进行染色以增强对抗原的可见度。
可以使用核苷酸染料如乌尔红，或金标记等染色剂。
9. 电镜观察：将样品放置在电子显微镜中，并使用适当的电压和放大倍数进行观察和记录。
通过观察电镜图像，可以获得关于抗原的位置、分布和亚细胞定位的信息。
总结：免疫电镜实验是一种强大的技术，可以帮助研究人员观察和定位特定抗原。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
组织或游离细胞内抗原
• 需对样品进行特殊处理－增加膜的通透性 固定剂+1%Triton X100，10-20min 0.1MPB冲洗，10min 0.5% 1%Triton X100，30min 0.1MPB冲洗，10min －接包埋前法标准程序
包埋后法：
• 适用： 组织细胞（内或外）抗原 游离细胞内部抗原
• 预先冷却好全部用具
3. 浸透与包埋
[目的]使包埋剂浸透样品后，固化成硬块 低温包埋剂：丙稀酸类，水溶性
不含环氧基 低温下可聚合 两种： Lowicryl K4M(德国)：紫外线照射下聚合 LR White(英国)：55 ℃ 聚合,不需紫外线照射
低温(0-4℃)聚合，需用加速剂
低温包埋剂（Lowicryl K4M）
• 常规电镜：形态结构 • 免疫学方法： 组分 • 免疫电镜：形态结构+组分
免疫电镜延伸了免疫光镜 免疫化学技术与电镜技术结合的产物
在超微结构水平定位某些分子: Ag, 受体
Pancreas
Ultrastructure and chromogranin A immunogold labelling of ECL cell carcinoids. APMIS 113: 506–12, 2005
• 制备免疫电镜超薄切片 免疫标记
免疫电镜超薄切片的制备
• 低温包埋超薄切片法 • 冰冻超薄切片法
1.冷固定
• 取材 • FA+GA固定液中4°C， 2~3h(中间1-2h可取
出修块) • 封闭游离醛基（0.5M NH4Cl in 0.1M PB）
4°C， 2h • 冲洗（0.18M蔗糖in 0.1M PB） 4°C 2h或过
• 羟丙基/甲基丙烯酸酯（基本成分） • 乙二醇丙烯酸酯（交连固化剂） • 苯甲酸烷基乙醚（激活剂,引发剂）
低温（-20~-40 °C),紫外光照射下,自由
基链式反应
R1.+ .R2
R1 R2 + R3
R1. R2 .
R1 R2 R3
注意事项
• 称量要准确，尤其量少的 • 搅拌时避免产生气泡（O2自由基聚合阻聚剂） • 使用无色透明胶囊（无色明胶或聚酯胶囊） • 包埋剂加满加盖 • 用具全部预先冷却
固定剂
结构保存 抗原活性保
存
FA
好
常用
GA
不用或少用
锇酸
好
不用
固定剂(fixative)
①多聚甲醛(paraformaldehyde) 4% in PB
②混合固定液：多聚甲醛
2-4%
戊二醛
0.01- 0.5%
PB/二甲砷酸钠 0.1M(PH7.4)
③PLP固定液： 多聚甲醛：
2%
赖氨酸（lysine）
免疫电镜方法 (Immunoelectron microscopy)
电子显微镜的基本知识
用电子束代替可见光作为照射源的一种显微装置 透射电镜(transmission electron microscope)
电子束照射标本,收集穿透标本的电子,通过电子透 镜成像并放大,可显示物体超微结构的形态. 扫描电镜(scanning electron microscope) 电子束在样本上逐点进行扫描,收集样本产生的二 次电子进行成像,可显示物体表面和立体的形态.
chromogranin A
电镜标记方法：抗原-抗体的特异结合（狭义）
所有高亲和力的特异结合（广义）
被标记物
பைடு நூலகம்
特异结合反应
研究对象
种属特异抗体
ⅡAb-ⅠAb-Ag
抗原
Protein A
蛋白A-ⅠAb-Ag
抗原
Anti-Biotin
抗Biotin-BiotinⅡAb
-ⅠAb-Ag
抗原
配体
配体-受体
受体
？
（以20g为例） 单体：17.3g 交联剂：2.7g 激活剂：0.1g
乙醇+包埋剂 乙醇+包埋剂
1 ：1
1 ：2
60m
60m
纯包埋剂 60m
纯包埋剂 60m
-20~-40 °C -20~-40 °C -20~-40 °C -20~-40 °C
电镜可见的免 疫反应
透射免疫电镜技术
• 包埋前法（先组分，后制样）： 先进行定位反应，再制备超薄切片
• 包埋后法（先制样，后组分）： 先制备超薄切片，再进行定位反应
扫描免疫电镜技术
免疫电镜要解决的两个问题
• 免疫电镜标本的结构保存与抗原活性 保存问题——二者经常矛盾
• 在电镜下显示抗体的合适的标记物
30%
30m 0°C 冰水中 加些盐
50%
60m -20°C 低温冰
箱
70% 90% 60m 60m -20~ -20~ -40 °C -40 °C
100% 100% 60m 60m -20~ -20~ -40 °C -40 °C
*注意事项:
• 脱水剂对抗原的灭活作用随温度降低，但不能 低到脱水剂结冰的温度，所以应选择结冰温度 低的脱水剂
照射源 成像装置
放大倍数 分辨率
透射电镜
电子束 电磁透镜 (磁场\电场) 1,000×~60万 0.2nm
光镜
可见光 光学透镜 玻璃 40×~2,000 200nm
Kidney
Muscle
Carcinoma
Culture cell
SARS virus
rotaviruse
免疫电镜技术: 在超微结构水平研究（确认与 定位）细胞化学组分及变化的方法
夜中间换液2~3次
* 常规电镜标本可在冲洗液中存放1~2周，但免疫电镜
标本不行， 因为GA浓度很低微细结构变化大 * 一般采用2℃～4℃冷固定；这样能降低细胞的自溶作
用和水分的抽提
2 .低温脱水
• [目的]去除样品中的水，为包埋剂（水溶性） 的均匀浸透做准备
• 脱水剂：乙醇，甲醇，异丙醇，乙醚，或丙酮 （梯度脱水）
凝集素
凝集素-凝集素受体
凝集素受体
酶
酶-底物
底物
Anti-Biotin
抗Biotin-Biotin核酸
（原位杂交）
探针-核酸
核酸序列
免疫电镜技术:通过（抗原和抗体）特异亲和 反应实现对细胞化学组分的确认与定位
抗原——抗体 激素——受体 糖基——植物凝集
素
（免疫电镜技术最常用）
免疫电镜样本制备
电镜样本
0.075M
Sodium periodate
0.01M
PB
0.037M
包埋前法（优先）：
适用情况： • 离散细胞表面抗原的标记 • 冰冻断裂样品 • 扫描电镜样品
包埋前法步骤：
例：离散细胞表面抗原的标记 • 离心 • 缓冲液清洗 • 固定（视抗原） • 免疫标记 • 固定，包埋（常规电镜样品制备）