超低温冷冻保存种质共34页文档
植物种质的超低温保存
在培养基中添加生长延缓剂能有效减缓材料的生长。
a.不同抑制剂对不同植物材料的作用效果有所差 异 b.同一种抑制剂应用在不同植物中，要达到抑制 作用而不对植物造成伤害所需要的浓度也有所不 同。 c.在一种植物上有效地抑制剂在另一种植物上则 可能无效。
实验已经证明，利用多效唑可以使玉米、水稻、小麦和马铃 薯等的试管苗生长素率降低，同时移栽成活率提高。利用二 甲基氨基琥珀酰胺酸（B9）、矮壮素（CCC）可以使葡萄试 管苗的转管从3个月一次变为一年一次。如果将低温保存与 一些生长抑制剂配合使用，则效果更佳。
d.材料大小也有影响，太大影响预培养效果，冻 存易受冰晶伤害；太小则切取困难，而且增加切 取时对材料的伤害。 e.如果采用大田生长的植物的芽，最好选择在冬 季取材。因为夏季生长的芽都不耐寒，而经秋冬 季的低温锻炼后，植物体的抗冻能力提高，所以 动机去才有较高的存活率
10.2.2材料的预处理
预处理包括材料的预培养和低温预处理，目的是 减少系孢子油水的含量，使细胞经受低温锻炼， 以有效提高组织活细胞的抗冻能力。 •在冰冻保存前的预培养时常在培养基中加入一些 可以提高材料抗冻能力的物质，如山梨酸醇、脱 落酸、脯氨酸、和二甲基亚砜（DMSO）等，最 常用的方法是增加培培养基中蔗糖的浓度。
• （1）种子保存 目前常用的种质保存方法有以下几类： 特点：传统的种质资源保存的主要方式 种子保存占用空间少，保存期较长 易干燥、包装和运输 因此种子在低温下长期保存是防止良种衰变的一条重 要途径。 但是，随着储藏时间的延长，种子生活力逐渐下降， 而且易受病虫鼠害侵袭。 此外，这种方法对于无性繁殖的种类等不适用。
•
10.2.3.2保护剂预处理
配制保护剂时，应该将其溶解在培养基里， 或是溶解在有糖或无糖的水中。为防止对细 胞的渗透冲击，保护剂应在30~60min内逐 渐加入，如用甘油则加入速度需更慢。由于 DMSO有一定毒性，所以预处理应该在0℃ 左右的低温下进行。处理时间也不能过长， 一般不宜超过1h。
植物种质的超低温保存
（三）基本程序
• 冰冻保护剂0℃预处理 • 如何选择冰冻保护剂：易溶于水；适当浓
度下对细胞无毒害；化冻后容易从组织细 胞中清除。 • 常用的冰冻保护剂：DMSO、甘油、糖、 PEG等。
（三）基本程序
• 3、降温冰冻操作
– 1）直接快速冷冻 – 2）分级冰冻法 – 3）玻璃化法
– 4）干燥冷冻法 – 5）包埋冻存法
（二）关键问题及解决措施
• 关键问题：在超低温条件下，冰冻过程中避免细 胞内水分结冰，解冻过程中防止细胞内水分次生 结冰。
• 解决措施：
– 选取细胞内自由水少、抗冻力强的植物材料； – 采取预处理措施，提高植物的抗冻力； – 在冷冻和解冻过程中尽量减少冰晶的形成；
（三）基本程序
• 1、材料的选择：
致培养物的染色体和基因型的变异；费用较高 • 超低温冷冻保存：在液氮超低温下保存种质的
技术。应用前景广阔。
一、离体保存方法
• 使保存种质处于缓慢生长或无生长状态， 需要时可迅速恢复生长。
• 抑制生长的方式：
– 降低温度 – 降低环境中的氧含量 – 使用生长延缓剂 – 其它方法
离体种质保存的优点
• 占用空间少，节省人力 、物力和土地； • 便于种质资源的交流利用； • 需要时，可以利用离体培养方法很快大量
• 玻璃化：液体转变为非晶体（玻璃态）的固化 过程。
• 原理：将高浓度的保护剂在超低温环境下凝固 ，形成无规则的玻璃化液，将玻璃化液和材料 一起处理一段时间后投入液氮中，此时冰冻保 护液和材料一起进入玻璃化状态（冰冻过程中 水分子没有发生重排，不形成冰晶，也不产生 结构和体积的改变。
玻璃化法
• 优势：设备简单、操作方便、冻存效果好。 • 影响因素： ✓ 玻璃化冰冻保护液的组成及浓度； ✓ 植物材料的脱水温度和脱水时间。
种质资源的保存方法
种质资源的保存方法
种质资源的保存方法有以下几种：
1. 冷冻保存：将种子、胚胎、胚乳、芽等种质资源放入低温环境中进行保存，常见的冷冻保存方法包括液氮冷冻、超低温冷冻等。
2. 冷谷保存：将种质资源放入干燥的低温环境中保存，例如在干燥剂中保存。
3. 真空保存：将种质资源放入真空中进行保存，可以减少氧气的作用，减缓种质资源的老化和分解。
4. 无菌保存：将种质资源置于无菌条件下进行保存，防止微生物的污染和传播。
5. 酶处理保存：通过添加酶来保护种质资源，例如添加抗氧化酶来延缓氧化反应，添加脱水酶来抑制水分的作用等。
6. 组织培养保存：将种质资源进行组织培养，使其在人工培养基上生长和繁殖，以便长期保存。
7. 动物胚胎冻存：将种质资源保存在胚胎的形态中，通过冷冻来延长胚胎的存活时间，从而保存种质资源。
以上是常见的种质资源保存方法，不同的种质资源和保存目的可以选择适合的方法进行保存。
液氮超低温冻结保藏技术规范
液氮超低温冻结保藏技术规范液氮超低温冻结保藏技术规范1. 目的规范液氮超低温冻结方法保存各类微生物菌种的操作，保证菌种长期保藏的质量和安全。
2. 范围本规程适用于各类微生物菌种的液氮超低温冻结保存。
3. 基本原则和要求针对接收的不同类群的微生物菌种资源，保藏中心应根据工作经验和微生物菌种提供人的建议，选择合适的冻结速度和保护剂系统，进行微生物菌种的液氮超低温冻结保存，以保证这些微生物菌种在长期保藏过程中的活性和稳定性。
4. 规程4.1 准备冻存管4.1.1 用蒸馏水浸泡、冲洗干净耐低温（聚丙烯）塑料冻存管，干燥后备用。
4.1.2 保藏中心应为保存菌种的每一支冻存管标注明确的标识，标签内容应至少包括菌种的保藏编号和制备批号（日期），可将保藏编号排在第一行，制备批号用连续的年月日（八位数字）表示，排在第二行，并根据冻存管的容积将标签裁成合适的大小。
保藏中心应根据标签的放置位置选择符合要求的标签材质，以确保在长期的保藏过程中，标签不会发生自然或人为的脱落、污损。
4.1.2 将准备好的标签放置于冻存管规定的位置，加入或不加入合适体积的保护剂，拧上冻存管帽，装入塑料冻存盒中，1 公斤压力蒸汽灭菌30 分钟，备用。
4.2 准备保护剂根据需要保藏的微生物类别选择适宜的保护剂种类，按照配方配制、分装、灭菌备用。
用于保存厌氧微生物的保护剂，应除去保护剂中的溶解氧。
4.3 菌种保藏4.3.1 无菌操作将符合质量要求的、需要保藏的菌种接种在规定的培养基上，并尽量涂满整个斜面，置最适宜的条件下培养，单细胞微生物菌种培养至对数生长期后期（静止期初期），对于放线菌和产孢丝状真菌应培养至形成成熟的孢子。
对于生物量较低的菌种，应多准备几只斜面菌种。
对于不产孢子的丝状真菌，无菌操作将需要保藏的菌种接种在规定的平板培养基上，培养时间根据菌种的生长速度确定。
4.3.2 用无菌滴管将一定体积的灭菌保护剂无菌操作注入培养好的斜面菌种试管中，并将菌苔（或孢子）轻轻刮下，吹打数次，制成细胞或孢子悬浮液。
第10章 超低温植物种质保存
第10章超低温植物种质保存——离体植物器官、组织和细胞的超低温冰冻保存技术.种质保存的常见形式:种子保存;种植保存;离体培养保存;超低温冷冻保存。
第1节抑制外植体生长的离体保存方法1 降温2 降氧3 使用生长延缓剂4 其他第2节超低温冰冻保存技术1 原理在液氮(-196o C)的超低温条件下,细胞的整个代谢和生长活动完全停止.在组织和细胞的超低温储存过程中, 不会发生遗传性状的变异,也不会丧失形态发生的潜能.主要仪器设备用于组织和细胞培养的全套设备；普通电冰箱；低温冰箱；程序降温器；液氮罐；装材料用的玻璃或塑料试管；显微镜；分光光度计；……2 材料的准备和预处理2.1材料的选择生理状态；大小；培养阶段；取材季节；……2.2 预培养和预低温处理预培养：培养基中加入一些能使抗寒力提高的物质,可以提高培养细胞的抗冰冻能力.低温预处理：将选好的细胞等材料放在低温下锻炼数天，可能大大提高液氮保存的存活率.2.3 冰冻保护剂预处理1）冰冻保护剂（冷冻保护剂，抗冻剂）常用：甘油、二甲基亚砜(DMSO)、糖类(山梨糖醇、甘露糖醇、蔗糖、葡萄糖等)、脯氨酸等.冷冻保护剂使用的浓度和种类因植物种类不同而异.对许多植物来说,DMSO最佳.DMSO对于培养细胞的适宜浓度是5~8%.2) 保护剂预处理：保护剂配制：可以溶解在培养基里,也可溶解在有糖或无糖的水中使用：为避免对细胞的渗透冲击，加保护剂应慢。
由于DMSO等有毒，冰冻保护剂预处理时必须在0o C下进行，时间一般不超过1h。
许多情况下,几种保护剂混合使用可以减低药剂的毒性,提高细胞的存活率。
可能原因：A、彼此减小甚至消除单一成分的毒害作用;B、使各种成分的保护作用得到综合协调的发展。
3 降温冰冻基本操作3.1 慢冻法在有冰冻保护剂存在的条件下,慢速降温。
通过细胞外结冰,使细胞脱水,直到细胞质的冷冻点.然后转到液氮中.适于不抗寒的植物，及悬浮培养的细胞等。
3.2 快冻法一般是将材料经低温预处理后直接投入液氮.利用超速冷冻使细胞内的水迅速通过冰晶生长的危险温度区。
超低温冷冻保存20110908
长期保存方法
1．超低温冷冻保存此种方法主要将菌种保存于超低温的冷冻柜中，其程序如下：（1）准备工作
将甘油及蒸馏水以1：4的比例混合，配制成100mL或少于100mL的甘油溶液，于灭菌锅中以120℃，20min灭菌备用。
取小量的甘油溶液，分装于保存菌种用的小瓶子中，勿大量装在一起，否则反复冷冻、解冻及接种的过程，均会增加污染或菌株死亡的机会，每次以小量分装，且准备多重复，可以减少前述的缺点。
（2）培养及分装过程
以准备好的的甘油溶液制备孢子、菌丝或细胞的悬浮液后，分装于容积为2mL的小塑料瓶中，每瓶各加入1mL的悬浮液，若须盛装较大体积的悬浮液时，亦可选择较大的容器；分装后贮存于-50℃的冷冻柜中，如果菌株已先生长于固体培养基上，也可以将其浸泡于20%(v/v)的甘油溶液中，再贮存于冷冻柜。
（3）贮存
将各个小瓶子做好登记及编号，依序置于具有区隔装置的贮存盒中，贮存盒外亦须登记及注明盒内贮存瓶的编号，以便日后能迅速查询；贮存盒的材质可为塑料或腊质包膜等具有防水功能(如：Nalgene)的冷冻盒。
（4）重新活化
自冷冻库中取出菌种贮存瓶，置于室温使其解冻，或是以37℃水浴迅速解冻，解冻完成后立即取出瓶子，以70%酒精擦拭消毒，再以无菌操作方式打开瓶盖，取出菌液接种至新鲜的培养液中重新活化。
超低温冷冻保存种质
植物种质的超低温保存
超低温冷冻保存种质
• 是指利用天然或人工创造的适宜环 境保存种质资源，使个体中所含有 的遗传物质保持其完整性，有高的 活力，能通过繁殖将其遗传特性传 递下去。
按保存类型分类
按保存类型分类可分为两种类型
非原生境保存
原生境保存
超低温冷冻保存种质
超低温冷冻保存种质
• FDA、TTC等染色的方法进行快速检测， 只能作为生活力的预测指标
超低温保存技术的发展
1973年科学家首次成功地超低温保存 了 胡萝卜悬浮细胞。
1993年，英国国家种质库采用超低温保存 离体的苹果种质进行再培养成功。
超低温冷冻保存种质
• 悬浮细胞和愈伤组织的保存 • 生长点冷冻保存 • 胚状体（体细胞胚、花粉胚）冷冻保存 • 原生质体冷冻保存
超低温冷冻保存种质
a、快速解冻法 指将液氮中保存的材料直接投入到37—40℃
温水浴中进行解冻的方法。解冻的升温速度 为500—750℃/min。 b、慢速解冻法 将液氮中保存的材料先置于0℃低温下解冻， 再逐渐升至室温下进行解冻的方法。
超低温冷冻保存种质
• 检验化冻后材料的生活力和存活率的最 根本方法是再培养。
费用高，易受到自然灾害的影响
超低温冷冻保存种质
优点：占用空间少，无病虫害以及自然灾害 的影响，不受季节限制。短时间可实现大量 植物的增殖，无病毒。
缺点：连续不断的继代培养可能会引起染色 体和基因型的变异。
种质资源超低温保存是将植
物的细胞或组织经过Байду номын сангаас冻处 理后, 在液氮超低温- 196℃ 下保存的方法。
所使用的冷冻保护剂 应具有以下特性：
◆分子质量较小 ◆易于与溶剂混合 ◆快速渗入细胞 ◆无毒或毒性小 ◆易洗脱
种质资源保存方法
种质资源保存方法种质资源保存是指通过某种方式将植物、动物或微生物的遗传信息保存下来，以供未来利用。
种质资源的保存对于农业、畜牧业、渔业、草业和微生物资源的研究和利用至关重要。
在世界各地，种质资源保存已经成为保护生物多样性和可持续发展的重要措施之一。
种质资源保存方法有多种，包括冷冻冷藏、冷冻干燥、显微冻干、液态氮冻存、遗传变异保存和活体保存等。
下面将对几种常见的种质资源保存方法进行详细介绍。
1. 冷冻冷藏：冷冻冷藏是一种经济、简单且广泛应用的种质资源保存方法。
它利用超低温条件将种子、胚胎、花粉或细胞等种质资源冷藏保存，减缓其新陈代谢过程，从而延长其保存寿命。
冷冻冷藏通常在零下18至零下196的冷库中进行。
由于在冷冻过程中可能出现冰结晶的问题，因此在保存前需要对种质资源进行预处理，如加入保护剂、脱水或将其包裹在冷冻保护胶中。
2. 冷冻干燥：冷冻干燥是一种将水分从种质资源中去除的方法。
它通过将种子或胚胎置于低温下，然后将其暴露在低压环境中，使水分以固体的形式从种质资源中转变为气态，达到干燥的效果。
冷冻干燥可以有效防止冰结晶损伤，同时减缓种质资源的新陈代谢速度。
冷冻干燥需要高度精确的设备和操作技术，因此在实践中相对较少使用。
3. 显微冻干：显微冻干是一种将种质资源在显微镜下进行冻干的方法。
它使用显微镜将种质资源放置在微小观察盒中，然后将其冷冻并暴露在低压环境下进行干燥。
显微冻干可以保持种质资源的原始形状和结构，避免了冻干过程中可能出现的形变和损伤。
这种方法主要适用于细胞和微生物等微小种质资源的保存。
4. 液态氮冻存：液态氮冻存是一种将种质资源置于极低温度下保存的方法。
液态氮的温度为零下196，是一种非常冷的物质。
液态氮冻存可以有效地保护种质资源，防止其发生任何生物、化学或物理变化。
液态氮冻存被广泛用于保存胚胎、细胞、酵母菌、昆虫等种质资源。
5. 遗传变异保存：遗传变异保存是指通过人为调控和利用种质资源的遗传变异来保存这些资源。
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36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
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