9 第九讲2 超低温保存技术
超低温保存技术的相关机理综述
二甲基亚砜二甲基亚砜（DMSO）是一种含硫有机化合物，分子式为（CH3）2SO，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体。
具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”。
同时，氯化铬，氯化锰等过渡金属卤化物与氯化钾，氯化钠等卤化物在DMSO中有一定溶解度，故可以应用在有机电化学中。
二甲基亚砜广泛用作溶剂和反应试剂，特别是丙烯腈聚合反应中作加工溶剂和抽丝溶剂，作聚氨酯合成及抽丝溶剂，作聚酰胺，聚酰亚胺和聚砜树脂的合成溶剂，以及芳烃，丁二烯抽提溶剂和合成氯氟苯胺的溶剂等。
除此之外，在医药工业中二甲基亚砜还有直接用作某些药物的原料及载体。
二甲基亚砜本身有消炎止痛，利尿，镇静等作用，亦誉为“万灵药”，常作为止痛药物的活性组分添加于药物之中。
DMSO是二甲基亚砜，用途广泛。
用作乙炔、芳烃、二氧化硫及其他气体的溶剂以及腈纶纤维纺丝溶剂。
是一种即溶于水又溶于有机溶剂的极为重要的非质子极性溶剂。
对皮肤有极强的渗透性，有助于药物向人体渗透。
也可作为农药的添加剂。
也是一种十分重要的化学试剂。
DMSO也是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。
但研究表明，DMSO存在一定的毒性作用，与蛋白质疏水集团发生作用，导致蛋白质变性，具有血管毒性和肝肾毒性。
DMSO存在一定的毒性作用，用的时候要避免其挥发，要准备1%-5%的氨水备用，皮肤沾上之后要用大量的水洗以及稀氨水洗涤.在防冻剂中的应用纯DMSO 的冰点是18.45℃，含水40%的DMSO在-60℃不冻，而且DMSO与水、雪混合时放热。
这种性质使DMSO可作为汽车防冻液、刹车油、液压液组分。
乙二醇防冻液在超过-40℃低温时已不适用。
而且比DMSO沸点低，有毒，易生产气阻。
DMSO 防冻液在北部严寒地区用于除冰剂，涂料、各种乳胶的防冻剂，汽油、航煤的防冰剂，骨髓、血液、低温保存的防冻剂等。
超低温保存的原理
超低温保存的原理
超低温保存时，降温冷冻和化冻过程最易引起植物材料的伤害。
在降温冷冻过程中，植物组织或细胞遭受冻害主要有两个方面的原因，即细胞内部结冰和细胞内溶质的浓缩。
由于细胞质最初是高渗透压的，故而一般先使细胞外结冰，使得细胞膜内外的渗透压梯度发生反转，即发生细胞失水并逐渐变为脱水状态，导致细胞的溶质也相应地发生浓缩。
当细胞收缩超过临界值时，会造成细胞的损伤。
一般说来，慢速降温可使细胞内的水不断流到细胞外结冰，而快速降温时，细胞内的水来不及流到细胞外而造成胞内结冰。
因此，在降温冷冻过程中必须创造一个适宜的条件，使植物材料发生保护性脱水。
冬季的植物材料，由于经过抗寒锻炼已经发生了保护性脱水及其他提高抗寒力的变化，所以采用冬季植物材料超低温保存容易获得成功。
采用一些“冷冻保护剂”或称“防冻剂”可明显地增强生物组织的抗冷和耐冷能力，目前实践中往往采用如二四基亚砜、聚乙二醇（PEG）、甘油及多种糖类等多种防冻剂配合使用以提高效果。
在化冻时要防止细胞内次生结冰，因此，多数情况下采用快速化冻方法，即在3440摄氏度温水中化冻。
非渗透型冰冻保护剂
四、解冻与再培养
➢ 超低温保存效果与化冻速度有密切关系， 不同的材料应采用不同的化冻方式
• 液泡小、含水量少的细胞（如茎尖分生组 织），可采用快速化冻的方法
• 液泡大、含水量高的细胞则一般需要采用慢 速化冻法
• 生长季节中的材料，一般在37～40℃温水浴 中快速化冻比在室温下快速化冻要好
• 木本植物的冬芽，在超低温保存后，必须在 0℃低温下进行慢速化冻才能达到良好的效果
三、冰冻保护剂的应用
冰冻保护剂（Cryoprotective agent, CPA）也 称抗冻剂，对生物体低温保存必不可少
冰冻保护剂应具有易溶于水，对细胞无毒， 容易从组织细胞中清除等特点
冰冻保护剂的作用是增加膜透性，加速细 胞内自由水向外流动实现适度脱水；降低 冰点，提高溶液的粘滞性，阻止冰晶生长， 降低低温伤害
• 玻璃化冻存的材料在保存终止后，要求快速 化冻，以防止由于次生结冰对组织细胞造成 的伤害
再培养
经冻存的材料会不可避免地受到不同程度 的伤害
冻存的材料一般在黑暗或弱光下培养一到 两周，再转入正常光下培养
再培养所用的培养基一般是与保存前的相 同，但有时须将大量元素和琼脂含量减半， 有时则在培养基中附加一定量的PVP、水解 酪蛋白等成分以利于生长的恢复
• 不同渗透型冰冻保护剂渗入细胞的能力、对水分子 活性的影响等各不相同，如甘油适宜于慢速冷却， 而DMSO却易于渗入细胞，并在常温下稍有毒性
➢ 非渗透型冰冻保护剂
• 多为一些聚合分子物质，能溶于水，但它不能进 入细胞，它使溶液呈过冷状态，可在特定温度下 降低溶质（电介质）浓度，从而起到保护作用
• 主要有聚乙烯吡咯烷酮（Polyvingyl pyrollidone， PVP）、蔗糖（Sucrose）、葡萄糖（右旋糖酐， Dextrane）、聚乙二醇（PEG）、白蛋白 （Albumin）、羟乙基淀粉（Hydroxyethyl starch， HES）等
植物细胞组织和器官超低温保存
低温保存是种质资源短期和中期保存常用的方法。
主要适用再生植株、分生组织培养物的保存
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2. 干燥保存
将愈伤组织或体细胞胚等培养物，适当干燥失水，移入适 宜的低温下，可成功保存种质。 （1）预处理：将蔗糖浓度增至0.15mol/L或更高，预处理 12-20d。 （2）干燥：包括胶囊化处理（encapasulation treatment） 和脱水处理（desiccation treatment）等方法。 （3）储藏：通常选用0℃以上低温，或室温储藏。
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当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰 晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则 可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻 保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰 点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低 未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损 伤，细胞得以在超低温条件下保存。
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一、限制生长保存
限制生长保存（restricting conservation）是指改 变培养物生长的外界环境条件，限制离体保存材料 的生长速度，使细胞生长降至最小限度，但不死亡， 从而达到延长继代培养时间的目的。
目前使用较多的限制细胞生长的措施有改变培养 环境（如降低培养温度、减少培养瓶内氧气含量、 减少光照等）、提高培养基渗透压、加入生长抑制 剂、饥饿法、失水干燥保存等。
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(2)慢速冰冻法：通常成熟的植物细胞都具有大的 液泡，含有大量水分。对大多数植物材料说来，不 适宜采用快速冰冻法，而需要在冰冻保护剂存在的 条件下，采用慢速冰冻法。以每分钟0. 1-10℃的降 温速度(一般1~2℃／分较好)。降到-70℃左右，随 即浸入液氮，或者以此种速度连续降到-196℃。在 这种降温速度下，可以使细胞内的水分有充足的时 间不断流到细胞外结冰，从而使细胞内的水分减少 到最低限度，达到良好的脱水效应，避免细胞内结 冰。该方法适用于成熟含有大液泡和含水量高的细 胞。
超低温保存名词解释
超低温保存名词解释超低温保存的条件是在摄氏- 40至-70度。
人们利用液氮或液氧来制冷，再把物品放入其中进行保存。
利用液氮的零下196度的低温以液氮或液氧作为超低温冷冻剂来储藏食物，它无臭、无毒、不易燃，因此可以安全地保存食物新鲜品质而不损失营养成分。
这种技术叫做“超低温保存”。
1、对象物体在较低温度下保存，又称低温保存;被保存的物体，需要在一定温度下才能保持原来的物理化学性状和生物特性。
2、常见于低温恒温槽(室)、冰箱和真空冷冻干燥机内使用。
为使物质在较低温度下也能具有某些共同的性质，需要让物质在低温状态下也能保持这些性质，以便于长期保存，就需要降低物质本身的热力学性质，所谓降低，即指物质温度下降。
3、物质从常温到达某一特定温度时，其物理、化学及生物等性质随着温度的升高而显著变化，甚至发生转变，这个过程叫做“物质的热力学性质”，这个由高温向低温的相变过程叫做“热力学转变”，这个状态变化叫做“物质的相变”。
4、简单的物质发生相变所需要的临界点，称为“相变点”，它也是一个温度，常用T表示，它随着温度的增加而下降。
5、当大量相变过程集中在一个温度上时，此温度称为“相变点”。
6、实验证明：任何化合物都可以发生相变，且相变速率与该化合物的熔点无关，仅与该化合物的体积膨胀系数有关，在体积不变时，相变前后的体积差值越大，则相变速率越快。
7、相变的特征之一是相变潜热在不同温度下呈现出极大值，即为了获得更多的有用信息，在实验时，应选择一个体积膨胀系数较小的化合物作为相变的对象。
2、物体在较低温度下保存，会产生不同的效果。
把食物或药材在极低的温度下贮藏，可以减少食物的氧化，还可以防止微生物的繁殖，延长保存时间。
但低温保存不宜在密闭环境下进行。
3、常用的方法是用液氮将食物冷冻，然后再保存，可以长期保存。
为此，在国际上专门为保存食物制订了超低温保存规范，要求将食物保存在摄氏零下20至零下30度之间，并对温度敏感的食物，如香肠、咸肉、鱼干等要严格控制。
超低温技术在冷冻保存中的应用
超低温技术在冷冻保存中的应用随着人类社会的不断发展，食品、生物医学、电子等领域对低温技术的需求也越来越高。
而超低温技术在各个领域的应用也越来越广泛。
特别是在冷冻保存领域，超低温技术不仅可以有效地延长食品、生物医学制品以及电子元器件的保存期限，还可以更好地保护它们的质量和性能。
一、超低温技术的概念和分类超低温技术是指将物质的温度降低到极低的程度，以达到所需的处理效果的技术。
它可以将物质的温度从普通的低温状态降低到接近绝对零度（-273.15℃）的极低温状态。
根据温度的不同，超低温技术可以分为常规低温、超低温、极低温等多个等级。
常规低温指的是0℃以下但未达到-40℃的温度范围。
常规低温技术在食品、医药等领域的冷链运输和储存中得到广泛的应用。
超低温指的是-40℃～-80℃之间的温度范围。
在这一范围内，物质的温度降低到可以抑制其变质和失活的程度。
极低温指物质的温度降低到已经接近绝对零度（-273.15℃）的状态，其中液氮温度甚至可以低于-196℃。
在这个温度范围内，物质几乎可以永久保持其原有的生理、化学和物理性质。
二、超低温技术在食品冷冻中的应用食品是我们生活中必不可少的物质之一，保鲜和储存食品是人们日常生活中必须要解决的实际问题之一，而超低温技术在这个领域的应用也十分广泛。
它可以将食品中的水分以及细胞内的水分逐渐减少到无法支持细菌或微生物生存的程度，从而从根本上抑制了食品的腐败。
超低温技术在冷冻保存食品中的应用十分广泛。
在超低温冷冻的过程中，食品中的细胞水分和细胞外的水分都会被冻结。
当冷冻过程中水分形成晶体时，会对细胞结构和化学组分进行一定的破坏。
为此，超低温技术的关键在于冷冻速度。
在快速冷冻的情况下，水分在形成冰晶的过程中无法形成大型结晶，使细胞更容易恢复到其原有状态。
三、超低温技术在生物医学中的应用生物医学材料是人类医疗保健过程中必不可少的物质。
生物医学中的信号传输和诊断都与微电子技术有着密切的关系，而微型元件的工作和参数取决于其制造和使用的环境温度。
【正式版】超低温冷冻保存种质PPT资料
FDA、TTC等染色的方法进行快速检测，只能作为生活力的预测指标
FDA、TTC等染色的方法进行快速检测，只能作为生活力的预测指标
将液氮中保存的材料先置于0℃低温下解冻，再逐渐升至室温下进行解冻的方法。
常用的是DMSO。 按保存类型分类可分为两种类型
原生境保存
1973年科学家首次成功地超低温保存了 胡萝卜悬浮细胞。
所使用的冷冻保护剂 应具有以下特性：
分子质量较小 指将液氮中保存的材料直接投入到37—40℃温水浴中进行解冻的方法。
按保存类型分类可分为两种◆类型
优点：占用空间少，无病虫害以及自然灾害的影响，不受季节限制。
易于与溶剂混合 将降处温于 至0-1℃96或℃其的他方预法处。理温◆度的材料以1—2℃/min的降温速度从起始温度降到-100℃，稳定1h后，投入到液氮保存或以此降温速度连续 快速渗入细胞 使用生长延缓剂：多效唑、矮壮素
常用的是DMSO。
按保存类型分类可分为两种类型 降低环境中的氧含量：低气压处理、低氧分压处理
抑制外植体生长的离体保存方法
种质资源超低温保存是将植物的细胞或组织经过防冻处理后, 在液氮超低温- 196℃下保存的方法。
生物细胞的低温冻存是防止生物种质灭绝的重要途径
1973年科学家首次成功地超低温保存了 胡萝卜悬浮细胞。
更为有效。
降温冰冻操作
快速冷冻法 慢速冷冻法 预冷冻法 干燥冷冻法 包埋脱水法 玻璃化法
1、快速冷冻法
指将植物材料从0℃或者其他预处理温度直接 投入液氮中保存的方法，降温速度1000℃/min。
2、慢速冷冻法
将处于0℃或其他预处理温度的材料以1— 2℃/min的降温速度从起始温度降到-100℃， 稳定1h后，投入到液氮保存或以此降温速度连 续降温至-196℃的方法。
种子学吕世琦种子的超低温贮藏
种子超低温贮藏的优点
1. 超低温贮藏保存植物种子，选择适当的 冷冻容器后， 除了 30～60天补充一次液氮外， 不需要机械空调设备 及其它管理，节省了大量 的人力和物力 ，是一种省时、省工 、省费用的 种质保存新技术 2.可保持被保存种子的遗传稳定性 ，适合 于长期保存珍贵稀有种质
种子超低温贮藏的技术关键
不同的包装材料对种子的发芽率和生长势有不同的影响，有试验表 明，液氮保存种子使用聚乙烯塑料袋和铝箔包装材料好于牛皮纸包装。
包装材料 聚乙烯塑料袋 牛皮纸 铝箔
发芽率% 94.00a 78.00b 95.33a
生长势 76.69a 78.56a 77.53a
不同包装材料对超低温保存红小豆种子发芽率和生长势的影响
种子超低温贮藏的技术关键
3.适宜的种子含水量
植物种子液氮保存时都有一个适宜的含水量范围液 氮保存并非含水量越低越好 ，含水量降到一定极限则产 生脱水损伤 ，导致种子发芽能力伤失。有实验表明低含 水量 (7％ 一9％)的种子保存 在液氮 中的 发芽率低于自然 风干种子(12％ ～14％)的发芽率 。
2. 可以避免种质保存过程中的自然变异，保证种
质的遗传稳定性，同时有利于种质在国际间的交
换。
参考文献 1、张玉凤，董经纬，，蒋菊生，黄绵佳. 种子贮藏 的研究进展. 安徽农业科学，2007,35（19）： 5855-5856. 2、赵跃平，燕平梅，邢勇，张小冰，王小丽. 作物 种子超低温保存方法的构建. 种子科技， 2012,09:27-30 3、文彬，种子贮藏生理学发展史概略.自然辨证法 通讯，2008,30（177）：69-74 4、T. L. Malkin, A. Goddard, D. E. Heardetal.. Measurements of OH and HO2 yields from the gas phase ozonolysis of isoprene[J]. Atmospheric Chemistry and Physics, 2010, 10(3).
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1973年，Nag和Street将胡萝卜悬浮培养细胞保存 在液氮中一段时间，解冻后再培养观察到细胞的生长。 这是超低温保存植物材料成功的首次报道。
之后人们对超低温保存技术的研究越来越深入，
尤其对降温方法的研究。 按照待保存材料是否需要包埋，降温方法可分为 两大类： 1 材料不需要包埋的降温方法 2 材料需要包埋的降温方法
2.1.3 材料的脱水方式和保存前的含水量 包埋脱水法保存种质的关键之一是寻找材料包 埋后的最佳脱水方式以及材料保存前最佳含水量， 只有这样才能充分体现包埋这一操作步骤的优点。 包埋后的材料在保存前绝大多数采用干燥空气脱水， 但也可将包埋后蔗糖预处理后的材料用两步法或玻 璃化法作进一步的脱水保存。 对于保存前的最佳含水量，茎尖和分生组织的 最佳含水量为20%～40%，梨茎尖为20%，马铃薯茎 尖为30% 。
一般认为种子、花粉、球茎、抗寒植物 的枝条和冬芽等一些高度脱水的植物材料适 用此法，但对液泡大、细胞含水量高的植物 材料一般不适合。
1.3 两步冰冻法 它是把慢冻和快冻结合起来的一种冰冻方法。 即先用较慢的速度使培养物降至某一温度，停留约 10min或不停留，再降到-40～-30℃，在此温度下 保持30min～1h或不停留直接投入液氮。 目前大多采用每分钟降低0.5～4℃的速率降到40℃，然后投入液氮。一般认为，停留是诱导细胞 外溶液结冰，使细胞内外产生蒸气压差，进行保护 性脱水，否则细胞外有可能产生非均匀的冰晶，对 细胞会产生严重伤害。
目前常用的玻璃化保护剂是Sakai于1991年 推出的保护剂 PVS2(30%甘油+15%乙二醇+15%DMSO+0.4 mol.L1蔗糖+MS-NH +无激素培养基)。 4 该玻璃化保护剂已在多种植物材料玻璃化冻 存研究中获得成功，并有较高的再生率。
材料需要包埋的降温方法
2.1 包埋脱水法(encapsulation-dehydration) 2.2 包埋玻璃化法(encapsulation-vitrifica璃化法保存植物材料的原理 玻璃化法是Luyet于1937年提出的，Sakai等于 1990年建立了玻璃化冻存简单高效的技术体系。
其保存原理： 植物材料经高浓度玻璃化保护剂处理后，快 速投入液氮中保存，使保护剂和细胞内水分来不 及形成冰晶或冰晶没有足够的时间生长，从而进 入一种人工的完全玻璃化的状态。在此状态中， 水分子没有发生重排，不产生结构和体积的变化， 因而不会由于细胞内结冰造成机械损伤或溶液效 应，伤害组织和细胞，保证化冻后细胞仍有活力。
超低温保存技术
超低温保存 ： 概念：在液氮（LN）（-196℃）中使保存的生物 材料的物质代谢和生长活动几乎完全停止，而细胞活力 和形态发生的潜能仍保存。 这样有利于保存和抢救物种，尽可能避免组织细胞 培养及自然界中积累性突变等的发生，便于国际间的种 质交换。经过超低温保存后的再生植株，有可能产生高 抗寒性的新材料。 超低温保存正成为长期稳定地保存植物种质资源及 珍贵实验材料的一个重要方法。
1.5 干冻法 利用无菌风、真空、干燥硅胶、饱和盐溶液或 高浓度蔗糖等对材料进行干燥预处理，然后快速将 其投入液氮中保存。在进行干燥预处理时，要适度 脱水和掌握好脱水速度，以增强材料的抗冻性，一 般需要将植物材料的含水量由72%～77%下降到 27%～40%后再浸入液氮中。如果是用无菌风、真空、 干燥硅胶干燥不以任何冷冻保护剂处理的材料，称 为直接干燥处理。
1.6.2 玻璃化冰冻保护剂 在材料冰冻之前，用玻璃化保护剂(Plant Vitrification Solution,PVS)处理，再投入液 氮保存。常用玻璃化保护剂包括渗透性物质和非 渗透性物质两类。 渗透性物质包括甘油、乙二醇、二甲基亚 砜(DMSO)等，非渗透性物质包括蔗糖、聚乙二醇 等物质。此外，脯氨酸也可作为玻璃化保护剂起 到稳定冻存细胞中的蛋白质结构的作用。一般来 说，复合冰冻保护剂能充分发挥各种成分的保护 作用，从而产生累加作用，但其毒性不累加。
1.4 逐步冰冻法 此法是制备不同等级温度的冰浴如-20℃、50℃、-70℃、-100℃或-10℃、-15℃、-23℃、 -35℃、-40℃等使植物材料经保护剂在0℃预处 理后，逐渐适应这些温度，材料在每级温度上停 留一定时间(4～6min)，使细胞达到保护性脱水， 然后投入液氮中. 殷晓辉通过对几种野生稻愈伤组织冰冻保存 研究，得出的降温程序是：（1）0→-10℃速度 是1℃.min-1停留15min；（2）-10→-40℃速度 是1℃.min-1 ，停留60min；（3）-40→-196℃。
2.2 包埋玻璃化法(encapsulationvitrification) 其基本操作程序：预培养和包埋→玻璃化溶 液脱水→液氮保存→化冻→恢复培养。 这种方法实质上是将包埋脱水法的包埋和玻 璃化法结合在一起，它减少了脱水的时间，简化 了冻存程序，且比包埋脱水法有更高的成芽率。 但是对某些植物而言，包埋玻璃化法不一定 是最适合的，这可能与基因型有关。辣根包埋玻 璃化法冻存3天后，成活率为60%，用包埋脱水法 保存成活率大于90%。
早期的快冻法和慢冻法等常规超低温保存都 是部分玻璃化法即胞内玻璃化。对于单细胞来说， 常规超低温保存中的胞外冰晶几乎是不具有伤害 性的，但对于整个器官或组织来说，所谓的胞外 冰晶仍然是在细胞的间隙中，仍会对细胞产生伤 害。 现在玻璃化法冻存采取完全玻璃化法即胞内 胞外同时为玻璃化状态，在器官和组织水平保存。 对保护细胞与细胞之间的联系方面有较好的效果。 由于是完全玻璃化冻存，因此在解冻时不存在不 均匀化冻现象。
材料不需要包埋的降温方法
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 慢冻法 快冻法 两步冰冻法 逐级冰冻法 干冻法 玻璃化法 （vitrification）
1.1 慢冻法 慢冻法是指以0.1～10℃.min-1的速度进行降 温，只要降温速度适宜，在冰冻保护剂作用下，即 可避免在细胞脱水时细胞内产生冰晶，又能防止因 溶质含量增加引起的“溶液效应”。 原生质体、悬浮培养细胞和愈伤组织等细胞类 型一致的培养物，采用这种方法效果较好。一般来 说，降温速度为0.5～2℃.min-1。
1.2 快冻法 快冻法即将经0℃或其他温度预处理过的材料 直接放入液氮或其蒸气相中，此种方法的降温速度 可达到300～1000℃.min-1，也有人认为可达到 1000℃.min-1以上。 其降温原理：利用超速冷冻，可使细胞内的水 分迅速通过冰晶生成的危险温度区（-140 ～ 10℃），使细胞内的水分来不及形成冰晶中心，就 降到-196℃的安全区。此时细胞内的水为玻璃化状 态，该状态对细胞结构不产生破坏作用，从而减轻 或避免细胞内结冰的危害。
目前迅速恶化的环境和不利的气候条件正 在侵蚀植物的遗传多样性，这种侵蚀正在减 少种内和种间的多样性，使许多生物资源濒 危和正在灭绝。因此保护植物的遗传多样性 已刻不容缓。 科研工作者正在加紧收集种质资源并用适 当的方法予以保存，在众多的方法中，超低 温保存这一方法得到了许多人的青睐。这将 为植物种群有用基因的长期利用提供一条有 效途径。
3 问题与展望 植物种质超低温保存技术具有传统的原境 保存和异境保存无法比拟的优点，它不仅使 保存的材料免受病、虫的侵害，而且能长期 保存生物材料。但是植物超低温保存工作的 开展时间毕竟还短，有许多问题尚需进一步 研究：
（1）冰冻保护剂的选择； （2）降温过程中细胞超微结构的变化； （3）保存几十年的材料遗传稳定性； （4）长期连续使用冻藏的组织再生能力； （5）某一植物保存体系的建立及其普遍应用。 这些是今后一个时期研究的重点，尤其是 保存稀有野生种质和面临绝种的植物，更具有 重要价值。
2.1.1 包埋方式 包埋方式有两种： （1）材料先用高浓度蔗糖预培养后再包埋， 这种方法运用较普遍，褐藻酸钠溶液中可含或不 含高浓度蔗糖。 （2）材料包埋后用更高浓度蔗糖培养处理， 在这种方法中，褐藻酸钠溶液中必须含更高浓度 蔗糖，否则材料会重新回到低渗透状态。
2.1.2 褐藻酸钠和蔗糖的浓度及处理时间 常用褐藻酸钠质量分数为3%，氯化钙浓度100m mol.L-1，固化时间30min,蔗糖浓度一般为0.3 ～ 0.75 mol.L-1，其中以0.75 mol.L-1更常用。 在蔗糖溶液中预培养的时间一般为1d，也有3～ 10d的。
2.1 包埋脱水法(encapsulation-dehydration) 包埋脱水法最早出现在法国学者Fabre和 Dereuddre保存马铃薯茎尖的研究中，它参照了 人工种子的制作技术，结合超低温保存的需要， 将包埋和脱水结合起来应用于超低温保存中。
其基本过程： 将包含有材料的褐藻酸钠溶液滴向高钙溶 液，因褐藻酸钙的生成而固化成球状颗粒，同 时辅以高浓度蔗糖预处理材料，使材料获得高 的抗冻力和抗脱水力后，结合适当的脱水和降 温方式液氮下保存。
1.1 慢冻法 为均匀分配降温过程中的温度，同质降温待 超低温保存材料，从而减少异质冰晶的形成，提 高保存成功率，出现了演变于慢冻法的微滴冻存 法。其方法是将含有一个茎尖的低温保护剂溶液 滴于铝箔上，用程序降温仪以适宜的速度（一般 在0.1～0.2℃.min-1之间）将其降温至转移温度 （一般为-40～-70℃），最后浸入液氮保存。