病毒的超低温保存法
病毒的纯化与保存
连续与不连续PAGE
PAGE按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差 异及有无浓缩效应分为连续系统和不连 续系统两大类,
病毒纯化的一般原则熟悉
1、释放病毒到胞外 1.1 容易释放病毒 培养液/尿囊液
1.2 不容易释放病毒 细胞破碎 2、去除细胞碎块
低速离心,以2000～6000r/min离心30～ 40分钟,可除去90％以上的细胞碎片和杂质
3、病毒悬液浓缩
细胞破碎方法熟悉
超声破碎：密集的小气泡迅速炸裂,破坏细胞 高压匀浆：机械切割力 高速珠磨：玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂 酶溶法：溶菌酶、蛋白酶、葡聚糖酶 化学渗透：渗透压改变使细胞破裂 反复冻融：形成冰晶,使细胞膨胀破裂
每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁 移率作图得标准曲线,量出未知蛋白的迁移 率即可测出其分子量,这样的标难曲线只对 同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有 可靠性，
当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时,样品 的迁移率与其分子量的对数呈线性关系,
符合如下方程式：Lg MW =－b m R + K 其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移 率，b为斜率，K为截距，当条件一定时，b与K均 为常数
WesternBlot 步骤
3、磷酸缓冲液漂洗,进行膜的脱色 4、膜的封闭
封闭是用高浓度的无关蛋白质封闭膜上未被占据
的表面,使抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而
不是和膜结合，常用的封闭液有牛血清白蛋白 BSA，脱脂奶粉等，一般用脱脂奶粉， 将膜浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。
动物微生物-病毒的增殖和培养
详细描述
过滤分离法适用于从大量液体中提取病毒，通常使用孔 径大小适宜的滤膜，将病毒颗粒截留在滤膜上，而将其 他杂质通过滤膜过滤掉。该方法操作简便，但需要选择 合适的滤膜孔径以获得较高纯度的病毒。
蔗糖梯度离心法
总结词
利用不同浓度的蔗糖溶液形成的密度梯度，将病毒从混合物中分离出来的方法。
详细描述
蔗糖梯度离心法是一种常用的病毒纯化技术，通过在离心管中形成连续的蔗糖浓度梯度，将不同密度的病毒颗粒 分离。病毒颗粒在离心后会停留在相应的蔗糖密度层，从而达到纯化目的。该方法能够分离出较高纯度的病毒， 但操作较为繁琐，需要精确控制蔗糖浓度和离心参数。
复制周期
复制效率
不同病毒的复制效率有很大差异，有 些病毒可以在短时间内复制出大量的 子代病毒。
病毒的复制周期包括吸附、侵入、复 制、组装和释放等阶段。每个阶段都 需要一定的时间和能量来完成。
病毒的培养条件
01
02
03
培养基
病毒需要在适当的培养基 中才能生长和繁殖，如动 物细胞、昆虫细胞或细菌 等。
侵入
总结词
病毒进入宿主细胞内部的过程。
详细描述
在吸附完成后，病毒通过不同的方式进入细胞内部，如内吞、膜融合等。这一 过程需要病毒利用其自身的酶或诱导细胞内的信号转导途径来完成，以确保病 毒基因组能够进入细胞内部并开始复制。
脱壳
总结词
病毒基因组从其蛋白质外壳中释放出来的过程。
详细描述
在病毒进入细胞后，其蛋白质外壳会被细胞内的酶分解，使得病毒的核酸基因组得以释放。这一过程 对于病毒的复制是必须的，因为只有当基因组被释放出来后，才能利用宿主细胞的合成系统来复制病 毒的基因组和蛋白质。
详细描述
动物接种法是将病毒接种于易感动物，如小 白鼠、家兔、豚鼠等，观察其发病表现和病 理变化，以研究病毒的生物学特性和致病性。 这种方法可以模拟自然感染过程，但实验动 物感染病毒后可能出现死亡或发病，需要严 格控制实验条件和动物福利。
菌(毒)种保存及复苏技术
菌(毒)种保存及复苏技术
· ２４３ · 〔综述〕
马洪波 冯子力 谭 华 （ 珠海出入境检验检疫局， 珠海 ５１９０１０）
摘要 微生物是重要的 生 物 资 源 ， 保 存 微 生 物 的 目 的 ， 不 仅 使 微 生 物 菌 株 保 持 着 原 有 的 生 命 力 、优 良 生 产 性 能 、 形态特征， 并使其遗传性状从分离时或从实验开始就一直保持不变， 为后人能更好地应用先进技术开发和运用微生 物， 为人类造福。为此， 对菌（ 毒） 种保存的原理以及复苏技术， 包括冷冻干燥保存法、超低温冰箱保存法、液氮保存法、 传代培养保存法、载体保存法等技术的操作步骤进行介绍， 为同行作为参考。
病 毒 是 非 细 胞 形 成 的 生 命 体 ， 仅 有 ＲＮＡ 或 ＤＮＡ 一 类 简 单 分 子 ， 有 时 甚 至 仅 有 基 因 片 段 ， 包 含 一种或多种蛋白质。一般来说， ＤＮＡ 病毒比 ＲＮＡ 病 毒更稳定， 但 ２ 种病毒都能较稳定地保存。许多病毒 可在 ４℃保存 １ 个月， 而在较低的温度下可保存 １ 年 以上而无需要特别的冷冻技术， 因病毒结构简单， 体 积小， 不含水分。
中国国境卫生检疫杂志 ２００６ 年 ８ 月第 ２９ 卷第 ４ 期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ａｕｇ．２００６，Ｖｏｌ ２９，Ｎｏ．４
· ２４５ ·
煮沸 ２～３ 次， 每次 １０～３０ｍｉｎ， 备用。 ２．３．３ 微生物保存物的准备 在最适宜的培养条件 下将细胞培养至静止期或成熟期， 进行纯度检查后 （ 参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文 件《微生物菌种纯度检测技术规程》） ， 与保护剂混合 均匀， 分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于 １０８～１０１０ 个／ｍｌ 为宜。
葡萄茎尖超低温保存及超低温疗法脱毒研究
葡萄茎尖超低温保存及超低温疗法脱毒研究葡萄(Vitis)是世界范围内最具经济价值的果树之一,城市化、工业化、土壤盐碱化和沙漠化等原因导致葡萄许多野生种与栽培种濒临灭绝。
建立高效、简易的种质资源长期保存技术能有效地保护种质资源的多样性。
超低温保存是目前植物种质资源长期保存最为理想的方法。
病毒病是制约葡萄与葡萄酒产业发展的主要因素之一。
栽培无毒苗是生产上防治病毒病害最为有效的措施。
生产无毒苗是栽培无毒苗的核心技术。
近年来建立的超低温疗法,为葡萄无毒苗生产提供了一种新技术。
本研究以葡萄(Vitis)试管苗为试材,建立了茎尖小滴-玻璃化法超低温保存体系,为葡萄种植资源超低温库的建立提供了高效、广谱的超低温保存方法。
建立了超低温疗法,有效的脱除了葡萄卷叶相关病毒-3(Grapevineleafroll-associated virus 3,GLRaV-3),为葡萄脱毒苗的生产提供了核心技术。
同时,试管指示植物法、微样直接RT-PCR、免疫组织化学定位病毒检测为脱毒和病毒检疫提供技术支撑。
本研究主要结果如下:1.通过优化影响葡萄茎尖超低温保存的关键因素,建立了简易、高效、光谱的葡萄茎尖小滴-玻璃化法超低温保存体系。
含5-6片叶原基的腋芽(尺寸约1.0 mm)取自8周苗龄欧洲葡萄‘赤霞珠’(Vitis vinifera‘Cabernet Sauvignon’)试管苗,在预培养基(0.3 M蔗糖+0.16μM还原型谷胱甘肽+0.14μM L-抗坏血酸,pH=5.7)上暗培养3 d。
加载液(2 M甘油+0.4 M蔗糖)常温处理20 min,再用1/2浓度植物玻璃化溶液(PVS2)和全浓度PVS2冰上分别处理30 min和25-50 min,然后将茎尖放置于铝箔条上的PVS2小滴(2.5μL)中,直接投入液氮中保存。
保存后的携带茎尖的铝箔条迅速转移到卸载液(1.2 M蔗糖)中常温解冻20 min,培养于含0.6 M蔗糖的恢复培养基中恢复24 h。
病毒学检验
病毒的特点是：1、形体微小，能通过细菌滤器，用电子显微镜才能观察到。
2、无细胞结构，其主要成分是核酸和蛋白质3、每种病毒只含有一种类型的核酸（RNA或DNA）4、因缺乏完整的酶系统和能源，故只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸5、病毒以其基因为模板，在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒6、为了在生物界保存其种属，病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力，并具有对敏感宿主的侵染性和复制性7、在宿主体外，能以大分子状态存在，并可长期保持其侵染能力8、有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中，并能诱发潜伏感染细胞培养技术：是对由组织分散成的单个细胞或某一型细胞群进行的体外培养方法，即模拟体内的生理环境条件，提供细胞适宜的营养条件和温度，在无菌操作的基础上，使离体组织细胞生长增殖并进行传代的技术二、单层细胞培养：用于培养病毒的细胞有原代细胞、传代细胞（二倍体细胞株和传代细胞系）三、鸡胚的接种途径：1、羊膜腔接种2、绒毛尿囊膜接种3、尿囊腔接种4、卵黄囊接种四、间接计数在病毒检验过程中较为常用，是判定病毒感染性的定量方法，常用的有：空斑形成单位法，50%终点法，血凝试验和干扰测定空斑形成单位（PFUs）试验：是将不同稀释倍数的动物病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合，当病毒颗粒在一大片宿主细胞上引发感染时，会造成细胞被溶解而形成空斑，每个空斑系由一个病毒颗粒所造成，计算空斑数目再乘以稀释倍数，即可得知原来的病毒感染单位的浓度凡事能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可用空斑技术来测定其滴度。
50%终点法：是将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至动物、鸡胚或培养成单层的细胞，将每个稀释度造成的动物、鸡胚致死量或细胞病变做曲线，找出造成50%动物、鸡胚死亡或病变的终点稀释度。
LD50：为造成50%动物或鸡胚死亡的病毒含量ID50：即是指可造成50%动物或鸡胚感染的剂量CCID50：造成50%细胞培养产生病变效应的剂量五、病毒纯化的一般原则：1、释放病毒至细胞外2、去除细胞碎块3、病毒悬液浓缩六、病毒的保存：1、用低温（-60~25℃）、超低温（-70以下）冰箱或液氮罐（-196~150）保存2、冷冻干燥保存七、血清学实验的方法很多，最常用的是中和试验、补体结合试验、红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验中和试验：是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，然后测定残存的病毒感染力的一种方法。
实验室菌种保藏的方法
实验室菌种保藏的方法菌种是主要的生物资源，也是食用菌生产首要的生产资料。
一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变，才不至于降低生产性能，能长期在生产中使用。
因此，菌种保藏在食用菌生产上具有重要的意义。
各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。
一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。
下面介绍几种常用的菌种保藏方法：1斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4。
C左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。
此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。
放线菌、霉菌和有芽匏的细菌一般可保存6个月左右，无芽抱的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。
如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4。
C冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。
这一改进可使菌种的保藏期延长。
此法由于采用低温保藏，大大减缓了微生物的代谢繁殖速度，降低突变频率；同时也减少了培养基的水分蒸发，使其不至于干裂。
该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。
其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。
2石蜡油封藏法此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端IC明使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4。
C冰箱内保藏。
使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150~170。
C烘箱内灭菌Ih;或121。
C高压蒸汽灭菌60~80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。
病毒的收集保藏
病毒的收集保藏
病毒保藏在病毒研究中是一个很重要的环节，不论是病毒的基础研究，还是应用研究都与病毒的保藏都有着紧密的联系。
病毒保藏的原则是：
1）低温条件下保藏，温度愈低愈好；2）根据不同的病毒种类，采用不同的病毒保藏方法；3）在特定的保藏条件下（温度、方法），经过一段时间保藏之后，一定要进行活化增殖，同时测定病毒活力大小，再入库保藏；4）在保藏过程中应尽量减少不必要的传代，严格按规范操作，避免毒种相互交叉感染，使病毒不产生变异，保持病毒的遗传稳定性；5）必需开展保藏相关技术的研究，对各类病毒的保藏条件进行摸索，为毒种保藏提供科学依据。
病毒保藏的方法：
1）冰箱保藏法
普通冰箱保藏：4-8℃；低温冰箱保藏：-20℃--40℃；超低温冰箱保藏：-85℃。
特点：方便、价格相对较便宜。
此法保存要注意停电和冰箱的故障。
2）液氮保藏方法
－196℃。
设备：液氮发生器。
3）冷冻真空干燥保藏法（冻干法）
又称低压冻干法和冰冻干燥法，先将液态的样品冻结成固态，在真空条件下使温度下降，通过直接升华抽去水分，从而使物质脱水干燥，简称冻干法。
特点：冻干法保藏是在低温，干燥和隔绝空气的条件下，使病毒处于休眠状态，它的代谢是相对静止的，因而使病毒可以保存较长的时间。
加工技术-实验室菌种的保藏方法
加工技术-实验室菌种的保藏方法一、甘油悬液保藏法此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。
保藏温度若采用-20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用-70℃，保藏期可达10年。
将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘油的终浓度在10％～15％，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。
基因工程菌常采用本法保藏。
二、冷冻真空干燥保藏法冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。
它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。
并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。
常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。
由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。
除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。
但该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。
保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。
三、液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。
它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196℃）下保藏的方法。
其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。
美国ATCC菌种保藏中心采用该法时，把菌悬液或带菌丝的琼脂块经控制致冷速度，以每分钟下降1℃/min的速度从0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。
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Shanghai 200237, P.R.C 病毒的超低温保存法
大多数微生物可用超低温保存，超低温保存法是适用范围最广的微生物保存法。
需要复杂营养的微生物种，如用其他的贮存方法不能保持其活力（如植物的病原性真菌），通常可用超低温的方法保存（ATCC 1983；Halliday，Baker 1985）。
此法是将冻存在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率（1℃／分钟）冷冻，直至—150℃，再将这些小管贮存在—150～－196℃的液氮中。
超低温的冷冻保护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。
ATCC 常用一种由甘油（10％）、二甲基亚砜（5％）和培养液制成的混合剂保存多数的细胞株。
这些化学试剂进入细胞内可避免内
膜的冷冻损伤。
贮存在低温容器内的细胞复苏时必须小心操作。
当小管被加热时，所形成的冰晶会将细
胞杀死，正确操作就可避免这种事故。
只要迅速将样品解冻就能减少活力的丢失，做法是：将封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，将内容物移入培养基。
超低温保藏的微生物必须始终贮存在温度非常低的环境中，因此需要液氮罐。
在长期贮存的过程中必须经常注意补充液氮。
这种贮存方式比冻干法需要更多的经费，包括为了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。
2.2 材料
病毒超低温保存所需材料有：热收缩塑料管（Nunc Cryoflex），液氮罐，防护手套和面罩，永久性记号笔，气体喷灯，装液氮的保温瓶。
2.3 方法
（1）剪一段两端各超出冷冻管长度2cm 的热收缩塑料管。
（2）将含有澄清病毒悬液（组织培养的上清培养基，或组织培养基内的细胞溶解产物均可）冰浴几分钟，用灭菌移液管将0.2ml 冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内，并将盖子拧紧。
（3）将有病毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部，插入正确的标签。
（4）用喷灯小心加热热收缩塑料管，并使之包住冷冻管。
注意不要用太高的温度加热热收缩塑料管。
（5）再小心加热热收缩塑料管的两端，用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。
（6）将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻（操作时要求戴面罩和手套）。
（7）将冷冻过的冷冻管放入液氮罐中的格子内，同时记录样品的详细的存放位置、实验编号和存放日期等。
（8）需要用时，迅速从液氮罐内取出所需样品，并投入37℃水浴箱中解冻后，用解剖刀片在冷冻管的硅化垫圈处切开热收缩塑料管。
拧开冷冻管的盖子时不需要除去热收缩塑料管。