小鼠皮下脂肪细胞使用说明

小鼠皮下脂肪细胞

小鼠皮下脂肪细胞产品说明：

为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。

派瑞金提供的小鼠皮下脂肪细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠皮下脂肪细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。

同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。

小鼠皮下脂肪细胞注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。

3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。

4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。

5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。

小鼠皮下脂肪细胞产品简介：

1、产品名称：小鼠皮下脂肪细胞

2、组织来源：小鼠脂肪组织

3、产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶

小鼠皮下脂肪细胞简介：

小鼠皮下脂肪细胞来源于小鼠脂肪组织，皮下脂肪细胞主要功能：

（1）脂肪细胞能储存能量并参与身体代谢。

（2）脂肪细胞分化是一个发展的过程，它对代谢稳态和营养信号很重要。（3）前脂肪细胞存在于小鼠脂肪组织中，能根据能量的平衡增殖和分化成熟的脂肪细胞。前体细胞的增殖和分化能够增加脂肪组织的体积。

（4）前脂肪细胞与脂肪分化以及许多生理病理过程密切相关，如脂肪代谢、能量平衡、肥胖、糖尿病、高血脂和乳癌，所以小鼠皮下脂肪细胞对这些疾病的研究提供素材。

小鼠皮下脂肪细胞，细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度可达80%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

小鼠皮下脂肪细胞培养基信息：

1）培养基类型：DMEM高糖

2）添加因子：优质胎牛血清10%、细胞生长因子等

小鼠皮下脂肪细胞使用方法：

1. 取出25cm2 培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO

细胞培

养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。

2. 待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养。

3. 细胞传代

1) 吸出25cm2培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；

2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液约1mL至培养瓶中，37℃温浴3min左右；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化；3) 用吸管轻轻吹打混匀，按1:2或1:3等适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5mL，放入37℃，5% CO

细胞培养箱中培养；

4) 待细胞完全贴壁后，培养观察。之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。

小鼠皮下脂肪细胞注意事项：

1. 培养基于4℃条件下可保存3-6个月。

2. 在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作。

3. 传代培养过程中，胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态。

4. 该细胞只可用于科研。

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小胶质细胞培养及鉴定

2．1小胶质细胞的原代细胞培养 2．1．1混合胶质细胞培养自中山大学北校区动物中心购买刚出生1天内的SD乳鼠，用75％酒精消毒后固定四肢，剪开皮肤、颅骨，取出脑组织放入PBS液中洗涤一次，分离脑干取出，脑膜及血管尽量剥离，将组织放入盛有DMEM／F12无血清培养基的培养皿中，移至离心管中剪碎，加入浓度为0．125％的胰蛋白酶，37。C水浴箱中消化15分钟，血清终止消化，待组织沉淀后收集上液，余下组织可通过反复吹打进行再次消化，经过709m细胞滤网过滤，收集滤液，1500r ／min离心5分钟，去上清，加入完全培养基悬浮细胞后进行细胞计数，以1*106接种至预先用多聚．L．赖氨酸铺被的75cm2培养瓶中。24d'时后稍微轻摇下未贴壁及贴壁不稳的细胞碎片，全量更换培养基，随后4天／次换液，约至10天左右可见明显的细胞分层，上层为半贴壁，呈圆形，透光性较好，主要为小胶质细胞及少量的少突胶质细胞，下层细胞主要为星形胶质细胞、神经元。第一章原代小胶质细胞的培养、纯化及鉴定 2．1．2小胶质细胞分离及纯化：机械振摇法：将铺满胶质细胞／神经元的培养瓶置于摇床振摇，180r／min，15rain，将培养基吸出，并用PBS冲洗1遍，收集脱落的细胞，1500r／s 5min离心，去除上清液，加入完全培养基，吹打混匀，计数，(34+39+30+33)／4×104／ml，以3×105／孔的浓度将细胞种入6#L板(已放置盖玻片)，37。C 5％C02温箱培养15．30分钟，更换培养基，即去除延迟贴壁的少突胶质细胞，贴壁细胞即为纯化的小胶质细胞。分离后的底层混

合细胞继续加入15％FBSDMEM／F12培养基，4．5天后可以再次收获小胶质细胞。 2．1．3免疫荧光鉴定步骤 1)小胶质细胞接种第2—3天后，待细胞在盖玻片上伸出伪足时，自培养箱中取出。 2)用预温的PBS洗3次，每次5分钟 3)4％多聚甲醛室温固定20分钟左右 4)PBS洗3次，每次5分钟 5) 5％BSA室温封闭30分钟 6)加抗Iba抗体(用1％BSA稀释)放在湿盒里，4V过夜 7)PBS洗3次，每次5分钟 8)DIIFITC．山羊抗小鼠IgG(用1％BSA稀释)避光孵育1小时 9)PBS洗3次，每次5分钟 10)DIIDAPI(用1％BSA稀释)避光孵育5分钟 11)1xPBS洗3次，每次5分钟 12)95％甘油封片

sd大鼠操作规程

SD大鼠饲养管理操作规程 2007年11月目录一、SD大鼠概述 (2) 二、SD大鼠日常饲养管理 (5) 1、进入屏障及准备工作 (5) 2、饲养环境 (6) 3、饲喂 (6) 4、给水 (7) 5、换窝 (7) 6、离乳 (8) 7、留种交配 (9) 8、动物发放 (10) 9、引种 (11)

10、处死 (13) 11、SD大鼠常见疾病 (13) 12、清洁与消毒 (16) 13、退出屏障 (17) 14、常见突发事件的应急处理 (17) 一、SD大鼠概述大鼠(Rat)，啮齿目、鼠科、大鼠属，属野生褐色大鼠(Rattus norvegicus) 的变种。原产于亚洲中部及原苏联部分的温暖地区。十八世纪后期开始人工饲养，十九世纪中叶首次用于心理学的研究，二十世纪以后，大鼠应用于生命科学研究的各个领域，尤其在肿瘤学、药理学、内分泌学、营养学方面应用最为广泛。 1925年美国Sprague dawley农场用Wistar培育而成。其特点为头部狭长，尾长接近身长，产仔多，生长发育较Wistar快，抗病能力尤以对呼吸系统疾病的抵抗力强；自发肿瘤率低，对性激素感受性高； 10 周龄雄鼠体重可达300-400g，雌鼠可达180-270g。SD大鼠常用作营养学、内分泌学和毒理学研究。行为和习性（1）SD大鼠性情温顺，易于捉取，一般不会主动咬人，但当粗暴操作或营养缺乏时可攻击人或互相撕咬，哺乳母鼠更易产生攻击人的倾向，配种后的成年雄鼠同笼饲养互相撕咬，严重的甚至咬死。

（2）SD大鼠是杂食动物，有随时采饮的习惯。喜食煮熟的动物肉(如兔肉)，甚至是同类的肉。对营养缺乏敏感，特别是维生素和氨基酸缺乏时可出现典型症状。如核黄素缺乏时出现皮炎、脱毛、体质虚弱和生长缓慢，还可引起角膜血管化、白内障、贫血和髓质退化；维生素E缺乏可导致雌大鼠生育能力降低，严重缺乏时雄鼠可终生丧失生殖能力。（3）SD大鼠的活动多集中在黄昏到清晨这一段时间，白天常在笼内闭目休息，交配多在夜间发生。（4）SD大鼠对空气中的粉尘、氨气、硫化氢等极为敏感，易引发呼吸道疾病，一般开放饲养的大鼠主要死因为呼吸道疾病。（5）SD大鼠对各种刺激很敏感，环境条件的微小变化也可引起大鼠的反应，强烈的噪音可导致大鼠恐慌、互相撕咬，带仔母鼠可出现吃仔现象。（6）SD大鼠具有群居优势，同笼多个饲养比单个饲养的大鼠体重增长快、性情温顺、易于捉取，单个饲养的则胆小易惊、不易捕捉。解剖学特点（1）大鼠较小鼠个体较大。一般成年大鼠体长不小于18-20cm。尾上覆有短毛和环状角质鳞片，数量多于200片。上下颌各有两个切齿和六个臼齿，共16颗牙齿。齿式为（1003/1003）×2。（2）大鼠骨骼约105-108块，大鼠的生长发育期长,长骨长期有骨骺存在，不骨化。切齿终生不断生长，大鼠需不断啃咬磨牙以维持其长度恒定，故垫料中应有部分小木块供其啃咬。

敲除小鼠常见问题与回答

敲除小鼠常见问题与回答一、什么是ES细胞显微注射？答：胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。所得嵌合体小鼠的组织，将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递，这样可能获得转基因或打靶基因（来源于胚胎干细胞）稳定的生殖系传递的小鼠。一般情况下，大约能获得50%继承了目的基因的后代。二、嵌合体遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产生排斥反应,相互间处在嵌合状态。在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞，使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞，产生的个体也叫嵌合体，即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞）。三、条件性敲除的原理？答：Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。四、如何鉴定和挑选嵌合体？答：动物只有部分组织细胞整合有外源基因，则称为嵌合体动物。它的鉴定主要根据毛色去鉴定。注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。它们的毛色不同。因此可以根据毛色的嵌合率来鉴定和挑选嵌合体。

小鼠免疫细胞

免疫细胞的观察与小鼠脾脏淋巴细胞的提取一、实验目的 1、明确各免疫器官分布与形态结构，能熟练找到各免疫器官，弄清中枢免疫器官与外周免疫器官的区别与联系。 2、掌握密度梯度离心法分离小鼠脾脏淋巴细胞的方法，熟悉脾脏淋巴细胞的形态与功能。二、实验原理脾脏是外周免疫器官之一，是人体最大的淋巴器官。它生在腹腔左上方，质地比较脆，容易外伤。一般来讲，脾脏有三大功能：首先它是人体的“血库”，当人体休息、安静时，它贮存血液，当处于运动、失血、缺氧等应激状态时，它又将血液排送到血循环中，以增加血容量；其次，脾脏犹如一台“过滤器”，当血液中出现病菌、抗原、异物、原虫时，脾脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉；此外，脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质，发挥免疫作用。脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。因此，脾功能亢进时可能会引起红细胞及血小板的减少。脾脏还有产生淋巴细胞的功能。我们利用小鼠来观察脾脏的淋巴细胞。小鼠淋巴细胞的比重为1.088，利用比重为1.088的淋巴细胞分离液，将脾细胞悬液置于分离液上层，通过梯度离心的方法，在分离液与脾细胞悬液交界液面处分离得到脾脏淋巴细胞。三、实验器材 KM种小鼠，PBS缓冲液，淋巴细胞分离液，200目不锈钢网，解剖器械四、实验步骤 1、杀死老鼠，取出小鼠的脾脏，在pbs缓冲液中冲洗干净。 2、将小鼠脾脏至于200目铜网中，铜网绑定在烧杯上面，剪碎、碾磨，边碾磨边加PBS 冲洗，制得脾细胞悬液。 3、将制得的脾细胞悬液转移到10ml的离心管中，1000r/min 5min离心洗涤，倒掉上清，加入5mlPBS再离心洗涤一次。 4、加入5mlPBS将洗涤的脾脏细胞吹散、悬浮，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，细胞悬液与分离液体体积比为1:1。 5、2000r/min离心30min。 6、小心吸取中间层细胞，1000r/min 5min离心洗涤两次。 7、将制得的淋巴细胞滴于玻片，镜检。

细胞生物学实验三小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数(山东大学)

实验三小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 13生物基地 201300140059 刘洋 2015-04-06 同组者：吕赞洪俊蔡正琦一、实验目的 1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养。 2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用。 3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法。 4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数。二、实验原理 1.细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域(如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等)已被广泛应用。细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。 2.细胞死活鉴定细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。活细胞和死亡细胞在生理机能和性质上主要存以下差异： ①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触

小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案

小鼠星形胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。 1.实验材料与试剂剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、马血清、0.25%，0.05%胰蛋白酶、PBS液、青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培恒温细胞培养箱、倒置相差显微镜、细胞板、荧光标记二抗、0.4% 养瓶、CO 2 Trypan Blue染色液、抗小鼠OX42单克隆抗体和新生SD小鼠等试剂配比： (1)DMEM 10:10:1 DMEM, 10%FBS, 10%Horse Serum, 1% Penicillin/Streptomycin (P/S)? (2)DMEM 5:5:1 DMEM, 5% FBS, 5% of Horse Serum, 1% P/S? (3)SERUM FREE MEDIUM + GROWTH FACTORS （DMEM/F12无血清培养基+生长因子） 25μg/ml转铁蛋白，10nM生物素，30 nM亚硒酸钠，1μg/ml putrescine（腐胺），5μg/ml胰岛素， 20 nM hydrocortisone（氢化可的松），20 nM progesterone（孕激素），1％P / S+生长因子（5ng/ ml的血小板衍生生长

因子PDGF-AA和5ng / ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF）胰蛋白酶/ EDTA溶液0.05％胰蛋白酶+0.02％EDTA在W / O内Ca2+ / Mg2 +的HBSS DMEM/F12 containing 25 μg/ml transferrin, 10 nM biotin, 30 nM sodium selenite, 1 μg/ml putrescine, 5 μg/ml insulin, 20 nM hydrocortisone, 20 nM progesterone, 1% P/S + Growth Factors (5 ng/ml PDGF-AA and 5 ng/ml bFGF)?Trypsin/EDTA solution 0.05% Trypsin + 0,02% EDTA in HBSS w/o Ca2+/Mg2+ Laminar flow hood Dissecting magnifying glass Water bath at 37oC Humidified tissue culture incubator (37oC, 5% CO2) Sterilized microdissecting instruments: large dissecting scissors, mouse-teeth forceps, curved forceps and fine Dumont forceps Orbital Shaker (Boeco OS 20) Tabletop centrifuge 50 ml plastic conical tubes (Sarstedt, 62.547.004) T75 cm2 tissue culture flasks with plug-seal (BD Falcon, 137787) Tissue culture plates (Falcon) Petri dishes (Sterilin) 30 μm sterile nylon mesh (Saatilene, Hitech) 2.实验步骤 2.1星形胶质细胞的混合培养

动物大小鼠、实验猴饲养的操作规程

附件1 实验动物饲养管理的SOP 1、目的为规范SPF级动物房内大小鼠、仔猴的饲养规范，保证试验质量，特制定本制度。 2、范围适用于本公司SPF级动物房内的工作人员。 3、内容 3.1准备工作 3.1.1操作人员按SPF区人员进出标准操作规程要求进入动物饲养区。 3.1.2推门时应感觉到正压存在，如有异常及时通知相关人员。 3.1.3观察看温、湿度计，并记录读数。温度湿度变化范围超过规定范围时，要及时向实验人员和实验室负责人汇报，以便尽快采取措施。 3.1.4观察水瓶有无漏水，有无动物逃逸，动物健康情况，若有异常情况，应及时向实验人员和实验室负责人汇报并记录情况。 3.1.5检查每盒动物的饮水及摄食状况，若饮水及摄食不正常的动物笼，先检查是否饮水瓶阻塞，再观察动物是否有疾病征兆。若有，立即上报。 3.1.6发现动物死亡，要调查死亡原因，判断事故死亡还是异常死亡，并报告，不能确定原因的要将整盒动物送出屏障待查。 3.2 SPF大、小鼠的饲养管理SOP 3.2.1鼠喜阴暗、安静的环境，对环境温度、湿度很敏感，经不起温度的骤变和过高的温度。最大温差小于等于4℃，温度在20～26℃，相对湿度40～70％， 1

一般鼠饲养盒内温度比环境高1～2℃，湿度高5～10％。噪音60分贝以下，氨浓度14/（mg/m3）以下．通风换气大于等于15次/小时。光照循环条件是是12小时明/12小时暗，如果光照条件与上述不符，且没有实验方案支持，必须通知实验动物管理部的管理人员。 3.2.2鼠饲养在聚碳酸酯的实底的笼盒里，笼子底部放高压灭菌的玉米芯做垫料。除非实验方案有特殊的要求，和/或有动物管理委员会的批准，方可以进行改动。鼠是群居性动物，可能时尽量成群饲养，但每笼不得超过5只。 3.2.3饲料和饮水：鼠通过实验室等级颗粒料或等同的其它饲料自由采食，或者由实验动物管理部管理层或专题负责人提出建议。加饲料时，观察动物采食量，若尚有剩余饲料，则与新鲜饲料混合后喂。根据笼内鼠的多少参考如下饲料量饲喂,不宜太多。工作日每天检查一次料盒，周末一次。在更换笼具时，根据需要添加饲料。鼠采食量一般为5g（100g体重24小时），请根据动物的实际体重计算并投喂。鼠通过水瓶自由饮水。工作日每天检查1次水瓶，周末一次，每周至少更换一次水瓶。鼠饮水量一般为8～11ml（100g体重24小时）如果要求进行饲料/饮水的消耗量计算，则要根据实验方案进行记录。某些实验需要对饲料/饮水进行限制，或者给予特殊的饲料/饮水。 3.2.4鼠笼具的更换鼠笼具（包括垫料）每周更换两次，通常为周二和周四。更换时，将鼠笼从笼架上取下放在工作车或工作台上，鼠取出放在干净的笼具中，加上盖子，放好标签，将笼架用75%酒精擦洗干净后放回笼架。换笼具时同时观察动物健康情况。换下的笼具和盖子放在推车上推到饲养室靠污物走廊的门口后开门将鼠盒放在污物走廊地上，然后关闭该门。工作车不准推入污物走廊。换出脏垫料做无害化处理。 3.2.5清洁卫生：饲养室内保持整洁，门窗，墙壁，地面，鼠盒，笼架每天 2

常见问题及解答

常见问题及解答 1.镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？答：因为低倍镜下视野较大，易于发现目标和确定检查的位置，而如果直接用高倍镜观察，因其视野较小，不易找到观察的目标，浪费时间。 2.简述线粒体詹纳斯绿B活体染色原理？答：线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿B是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。 3.简述液泡系活体染色原理？答：动物软骨细胞内含有较多的粗面内质网和发达的高尔基复合体，能合成与分泌软骨粘蛋白及胶原纤维等，因而液泡系发达。中性红是液泡系特殊的活体染色剂，只将液泡系染成红色，在细胞处于生活状态时，细胞质及核不被染色，中性红染色可能与液泡中的蛋白有关。 4.微丝观察实验中，1%TritonX-100处理细胞的作用是什么？此实验能否看到微管和中间纤维？作出理由。答：（1）1%TritonX-100作用是为了抽提细胞骨架以外的蛋白质，从而使骨架图像更加清晰。（2）不能看到微管和中间纤维。因为微管、微丝和中间纤维是由不同的的蛋白质组成的，微管、中间纤维的组装蛋白都被1%的TritonX-100抽提出去，且没有加入促进微管、中间纤维组装的试剂，所以看不到它们。 6.简述Feulgen反应的原理及作好本实验的关键？答：（1）DNA经酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与Schiff 试剂（无色品红亚硫酸溶液）反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具有颜色。该反应对DNA具有专一性。（2）Feulgen反应成功的关键在于Schiff试剂的质量。Schiff试剂只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。 7.简述细胞凝集反应的原理？答：凝集素是一类含糖的（少数例外）并能与糖专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞

复旦大学免疫实验小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数

小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：____________ 实验地点：_____________ 实验人：__________________ 1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。 2实验材料： 1）健康小鼠 2）手术器械（剪刀、镊子）、解剖板 3）70汇醇 4）PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK 5）0.2%台盼蓝 6）细胞计数板、计数器 7）离心机 8）显微镜 3实验方法： 3.1取小鼠脾脏将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。 3.2制备单个核细胞悬液

将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min, 弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min,以破坏红细胞。然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。3.3 计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324X 104X 10=3.24 X 107/ml 3.4 计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16 个，计算细胞活力为： 324- 16/324 X 100%=95.1% 在理论范围之内 4 实验结果 4.1 研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。这些结缔组织在离心后会和细胞绞缠在一起，去除十分麻烦，而且会损失细胞。应该在离心之前尽早用吸管吹打后小心弃去（这样损失的细胞比较少，造成较小的误差）。研磨脾脏时的力度、时间、温度都会影响细胞的活性。所以应置于冰上快速、轻柔地研磨，置于液体中避免干磨。我们在实验室室温下碾磨，造成细胞破碎较多，影响最终实验结果。 4.2 白细胞计数

小鼠脾细胞培养实验

山东大学实验报告2011年3月30日姓名张行润系年级 2009级生科4班学号同组者张少华科目细胞生物学实验题目小鼠脾细胞培养实验仪器编号105 一、实验目的了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。学习细胞计数、营养液的配制等，初步掌握无菌操作方法。二、实验原理 (一)细胞原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 (二)细胞死活鉴定死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。除此之外，还有一些细胞器的专有染料。如液泡系的专有染料中性红。中性红是一种低毒性染料，可以使活细胞液泡着红色，而细胞质和细胞核不被着色；死细胞的液泡不被着色或浅染，染料弥散于整个细胞中，细胞核和细胞质被染成红色。有时侯为了增加染色效果可以将两种染料结合使用，如甲基蓝-中性红混合染色法。三、实验器材

大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代

大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代、试剂 Poly-L-lysine (Sigma,P2636) DMEM (Invitrogen,11995-065) 二、器械手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2 （金钟，WA3050）、显微剪 x1 3ml 移液管( Biologix, 30-0138A1) 南京军区总院神经内科实验室许丽丽 2012-12-01 1) 2) 3) FBS (Invitroge,10099-141) 4) HBSS, no Calcium, no Magnesium (Invitrogen, 14170-112) 5) 0.25% Trypsin-EDTA ( Invitrogen, 25200-056) 6) DPBS (HyClone ，SH30028.01B ) 7) dd H 2O 8) 75％酒精 1) 2) 100 ml 小烧杯 3) 200 目不锈钢筛 4) 细胞计数器（求精） 5) 50ml 离心管( Corning ， 430828)、 15ml 离心管( Corning ， 430790) 6) 25ml 培养瓶( Corning ， 430639)或 75ml 培养瓶( Corning ， 430641) 7) 100ml 玻璃瓶（蜀牛） 8) 直径为 60mm 的培养皿 LabServ,310109010) 9)

10) 过滤器( Millex-GP, SLGP033R)B 11) 注射器：50ml、5ml 各1 12) Pipette and pipette tips 13) 冰袋、手套、口罩

小鼠饲养室清洁规程

文件编码起草人日期颁发部门审核人日期生效日期批准人日期分发部门变更记载：变更原因及目的：文件编码：批准日期：原执行日期：小鼠饲养室设施器具清洁、消毒规程目的：建立小鼠饲养室设施、器具的清洗、消毒规程，保证小鼠饲养室的环境卫生要求。范围：适应于小鼠饲养室的清洁、消毒。责任人：饲养员，实验动物管理员。内容： 1、总原则 1.1人员和物品须按规定的程序进出。 1.2室内正在进行实验时不得进行清洁工作。 1.3消毒剂的使用应按月轮换交替使用。 2、清洗剂及其配制方法清洗剂名称配制方法清洁剂（洗衣粉溶液）取合成洗衣粉1g，加水200ml,混合均匀 3、清洁步骤与方法 3.1清洁程序 3.1.1 IVC笼架的清洁与消毒 ①向未使用的小鼠饲养盒中加入垫料、饲料和饮水。 ②取出装有小鼠的饲养盒，将小鼠转移至①中新鼠盒中，然后将换下的鼠盒送至储物间，通过传递窗送至清洗室。 ③在清洗室中，将换下的鼠盒中的垫料倒出，取出饮水罐和盒盖中的滤膜，其余部件置于刷洗池中，用清洁剂浸泡15min，用刷子刷洗内外壁污物，后用饮用水冲洗至无清洁剂残留。饮水罐和滤膜用饮用水清洗干净。 ④将清洗干净的鼠盒和饮水罐用布袋装好，置于脉动蒸汽灭菌器中121℃灭菌

20min。 ⑤在储物间侧将灭菌后的鼠盒和饮水罐取出，重新装入IVC笼架。 ⑥ IVC笼架支架部分定期用擦布蘸取清洁剂擦洗后，用擦布蘸取清水擦洗干净。 3.1.2 饲养室工作台及墙面、地面的清洁与消毒 ①用擦布蘸取75%酒精擦洗工作台面和超净工作台面。 ②墙面、地面用擦布擦洗。 3.1.3 环境的密闭消毒用甲醛（40%）按空间每立方米9ml的用量蒸熏12小时，再通风除去甲醛。 3.2 清洁、消毒周期 ①饲养员每日按规定程序进入饲养室，检查饲料及饮水瓶，把残余饲料清理掉。 ②鼠盒每三天清洁、消毒一次，每次实验后需更换鼠盒。 ③每次使用后应对工作台面进行清洁。 ④IVC笼架支架，饲养室地面、墙面每三天清洁一次。 ⑤实验动物患有传染病时应对环境进行密闭消毒。

小鼠脊髓原代星形胶质细胞培养方法的建立

万方数据

１８４物中心提供；ＤＭＥＭ干粉购自Ｇｉｂｃｏ公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所；胰蛋白酶（Ｔｒｙｐ－ｓｉｎ）、青霉素一链霉素均为Ｓｉｇｍａ公司产品；Ｄ—Ｈａｎｋｇ液为实验室自配；ＭｏｕｓｅＡｎｔｉ－ＧＦＡＰ单克隆抗体及ＣＹ５Ａｎｔｉ．Ｍｏｕｓｅ荧光二抗购自Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司；Ｈｏｅｃｈｓｔ为Ｓｉｇｍａ公司产品。２．原代培养①取１—３ｄ的新生ＩＣＲ小鼠，将其断头处死，在无菌条件下由腹侧取出脊髓，置盛有Ｄ—Ｈａｎｋｇ液的小皿中，在解剖显微镜下剔除脊膜，随后换到另一干净的小皿中。②在小皿内剪碎脊髓，大小为１×１×１，再将其移人尖底离心管中，加２～３倍体积的０．２５％胰蛋白酶，在３７℃下消化１５ｍｉｎ，加入等体积的含血清培养基（不含抗生素）终止消化；轻吹２０次左右，静置片刻，将上清吸人另一离心管中，原离心管中加入１ｍｌＤ—Ｈａｎｋｇ轻吹洗脊髓后将上清移入另一离心管中，在原离心管中加入ｌ～２ｍｌ的０．２５％胰蛋白酶再次消化１５ｍｉｎ，终止后连同上次消化的上清液一起１５００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，弃上清液，再加入含１０％血清的ＤＭＥＭ培养基，机械吹打使细胞分散，制成单细胞悬液。③血细胞计数板计数后调整密度到ｌ×１０５接种于无底物黏附的２５ｃｍ２玻璃培养瓶，在３７℃，５％ＣＯ：培养箱中培养。④每天倒置显微镜下对细胞进行观察，接种２４～４８ｈ后细胞第一次换液，以后每周换液两次。３．星形胶质细胞的纯化细胞培养７～１０ｄ待细胞分层生长后，置于３７。Ｃ摇床中２００ｒ／ｍｉｎ振荡６ｈ，弃含脱落细胞的细胞悬液，Ｄ－Ｈａｎｋｇ液洗３次，加入含１０％血清的ＤＭＥＭ培养基，放入３７℃，５％ＣＯ：培养箱中继续培养。为提高星形胶质细胞的纯度，可在传代后约５—７ｄ细胞融合时，再次放人摇床中振荡，重复上述操作。４．传代培养①取已培养１５ｄ左右的原代培养物，吸去旧培养基，用Ｄ—Ｈａｎｋ童液洗２次，然后滴加４００１ｚｌ０．１２５％胰酶一ＥＤＴＡ，倒置显微镜下观察，待细胞回缩，细胞间隙增加时用不含抗生素的培养基终止消化，并轻轻左右摇动培养瓶，随后用弯吸管轻轻吹打制成细胞悬液，分别接种于另两个２５ｃｍ２的培养瓶，在３７℃，５％Ｃ０２条件下培养。②每天进行倒置显微镜下观察，根据细胞的生长情况及液体颜色改变加补液体或换液。５．星形胶质细胞的鉴定取第三代培养物接种于六孔板内，２４ｈ后待细胞恢复后取出，吸去培养液，用ＰＢ快速洗两次，每孔分别加入少许４％多聚甲醛，室温下固定３０ｍｉｎ，去除固定液，用０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ洗三遍，以含１０％马血清的０．Ｏｌｍｏｌ／ＬＰＢＳ液在３７℃条件下封闭２０ｍｉｎ。加鼠抗ＧＦＡＰ的一抗（１：５００），放入４。Ｃ冰箱过夜，次日用０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ清洗三遍后同时加入ＣＹ５标记的抗小鼠二抗（１：１００）和Ｈｏｅｃｈｓｔ（１：４００），避光放人３７。Ｃ水浴孵箱ｌｈ，再用０．０１ｍｏＬ／ＬＰＢＳ洗三遍后晾干，用抗荧光衰减的封片剂封片，Ｏ．１ｙｍｐｕｓＦＶｌ０００激光共聚焦显微镜下观察。结果倒置相差显微镜下活体观察见星形胶质细胞的分离纯化过程中细胞生长情况良好。分离的小鼠脊髓细胞在培养（种植）４ｈ后，部分细胞即可长出细小的胞突；３６ｈ后，所有细胞均已贴壁，光晕明显，并长出突起，培养４—５ｄ后，细胞数量增多，约ｌＯｄ左右细胞达到８０—９０％会合，可进行摇床纯化。随着培养时间的延长，培养物中的星形胶质细胞的比例越来越大，而神经元、少突胶质细胞的比例越来越少。传代后细胞生长更活跃，培养５～７ｄ便可长满瓶壁，星形胶质细胞的比例增多，形态结构更加突出。相差显微镜下形态学特征：胞体较大而扁，形状不规则，胞质较丰富，细胞核圆形或卵圆形，常偏于胞体的一侧，内有１—２个核仁，星形胶质细胞的胞突尤其是初级胞突较多较长，呈放射状（图１，２），经ＧＦＡＰ特异性抗体的免疫荧光染色证实９８％为星形胶质细胞（图３）。圈１．２倒置显微镜下传代培养８ｄ的胶质细胞（×１００，ｘ２００）图３ｇ玳ｄｇ，养星形胶质细胞ｘ１０（激光共聚焦显微镜图象ｂａｒ＝４０ｔｔｍ）ｇＧＦＡＰ免疫荧光染色ｂＨｏ∞ｈｓｌ染色ｃＣ，ＦＡＰ和Ｈｏｅｅｈｓｔ共定位图象　万方数据

小鼠饲养常见问题问答

小鼠饲养常见问题问答 1. 小鼠的特点小鼠性情温顺，胆小易惊，易于捕捉，夜间比较活跃，尤其是傍晚时更为活跃，其进食、交配、分娩多发生在夜间。喜欢群居于光线较暗的环境，多只一笼饲养时生长发育较单只饲养时快。对外来刺激敏感，如强光、噪音，不同气味等刺激，可引发“吃仔”现象。雄性好斗，性成熟的雄鼠放在一起时，易发生互斗并咬伤，但同窝雄性鼠离乳时放在同笼内，可避免互斗。雄鼠分泌醋酸铵臭气，是引起室内恃异臭气的主要原因。小鼠是啮齿动物，门齿终生生长，因此小鼠有啃咬习惯，以此来磨损门齿并保持其长短的恒定。小鼠不耐饥饿，不耐热，对环境适应性差，对疾病抵抗力低。实验小鼠自发肿瘤多。白化小鼠怕强光。 2.小鼠的生殖生理小鼠发育速度较快，一般在14-20g之间可供进行动物实验。但做种子的小鼠必须根据动物的生物学特性及育种要求进行选种。小鼠性成熟早（雄鼠36日龄时，可在附睾精液中找到运动活泼的精子，雌鼠37日龄即可发情排卵），性成熟一般在36-42日龄，小鼠具有明显的性周期，性周期为 4-5天，雄性小鼠的体成熟为70-80日龄，雌性小鼠为65-75日龄。因此，小鼠开始繁殖的适宜日龄在 65-90日之间。小鼠一年四季均有性活动，分娩后24小时内又可受孕。雌鼠的性活动一般可分为发情前期、发情期、发情后期和发情休息期，性周期各阶段的特征，可用阴道分泌物涂片和组织学检查加以区分。雌鼠的这些变化，受卵巢机能所控制。卵巢能分泌两类激素，一类是由卵巢上皮细胞分泌的雌激素；一类是由黄体细胞分泌的孕激素。雌激素能促进子宫、输卵管的发育，促进副性征的出现和乳腺导管的发育，诱导动情，孕激素是黄体激素，在整个妊娠期中，都需要黄体的存在，其主要功能是保护受精卵的附植及维护妊娠，并促进乳腺的发育，它是子宫维持正常机能的主激素。 3.如何操作小鼠绝大多数品系的小鼠经过长期的驯养和人为的挑选，性格都是很温驯的，除了被受到攻击以外都不会咬人。小鼠实验的操作过程中，要平稳快速，如果在操作中发现小鼠变的焦躁不安，此时应停止对小鼠的动作而等其平静下来后再重新开始操作小鼠。 4.检查阴栓小鼠交配后，精液在阴道内凝固，如一白色栓塞堵在阴道中，叫做阴栓。小鼠的阴栓比较牢固，可在阴道内留存较长时间。安排精确见栓的做法是：在每天光周期结束前，将雌性小鼠同确认有生育能力的雄鼠成对合笼（一般做法是下午5-6点钟合笼），第二天上午7-8点左右检查阴栓。可直接观察或用镊子等器械来辅助观察。假设配种行为是在黑暗期的中间（12小时光照、12小时黑暗）发生的，则第二天中午便可假设为怀孕期的第0.5天。在检查阴栓时，将小鼠移动至不锈钢网罩上，以拇指及食指抓紧小鼠的尾端并将其它没用到的手指放在小鼠的荐骨及腰部附近，向后上提，使前爪抓住网罩，身体绷直，易于观察小鼠阴栓，如使用辅助器械时，切忌将器械深入小鼠阴道，触碰小鼠子宫颈；触碰后会引起小鼠机械性假孕。 5.小鼠的抓取固定

小鼠免疫

小鼠免疫免疫是单抗制备过程中的重要环节之一。即用目的抗原免疫小鼠，抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B 淋巴细胞。一、血清效价的影响因素小鼠免疫效价的高低直接影响单抗的制备。单抗免疫程序不同，包括免疫用的动物，抗原的性质、抗原量、免疫途径、免疫间隔时间、是否应用佐剂均会影响免疫效果。二、免疫材料 1．免疫用的动物抗原与免疫动物种属差异越远越好，小鼠、大鼠、亚美尼亚仓鼠和兔中分离的淋巴细胞的杂交瘤技术已经很成熟。小鼠是极好的免疫接种对象，原因是：1）小鼠易操作；2）多个纯系株易得到且价格合理；3）有很多试剂可用以检测鼠源免疫球蛋白；4）小鼠对外来蛋白质能产生良好的免疫应答；5）小鼠淋巴细胞能够和多种鼠源骨髓瘤细胞系发生有效融合。 2．免疫原（抗原）颗粒性抗原：颗粒性抗原免疫原性强，如肿瘤细胞、淋巴细胞、?细菌等可作为抗原，不加佐剂直接进行免疫，就可获得较好的免疫效果。可溶性抗原：因其免疫原性较弱，一般要加佐剂，如系半抗原，?应先制备成人工免疫原，再加佐剂。免疫原的形式会影响宿主体液免疫产生的抗体谱，因此选择免疫原制备抗体时应该考虑到所制备抗体的最终用途，并应该根据其用途决定何种方法筛选抗体

更合适。一般认为，影响免疫血清中lg亚类谱的因素主要包括免疫原、接种途径、佐剂和动物遗传背景等。且主要由初次基础免疫所决定，加强免疫的作用主要是提高特异性抗体的滴度。 3．佐剂目的：1）增强抗原对机体的免疫原性；2）增强抗体的产生能力；3）为制备出高效价的免疫血清；4）增强可溶性抗原的免疫原性；5）在某种情况下，改变Ag免疫应答类型；6）延长抗原在免疫动物的时间；7）改变抗原的分布；8）增强共刺激信号和激活免疫系统而刺激淋巴细胞增殖。种类：氢氧化铝佐剂、明矾佐剂（常用于肌肉、皮下注射）、弗氏佐剂。弗氏佐剂是最主要的免疫佐剂，热处理杀死的分歧杆菌可以引起炎症反应，募集淋巴细胞到抗原沉积部位，但若重复刺激可导致肉芽肿的形成，故不能重复使用。三、免疫策略 1．免疫途径途径的选择取决于抗原的生物学特性和理化特性。有静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮内注射、脾内注射、皮下注射、淋巴结注射等。脾内免疫会产生IgM 类抗体，分泌该类抗体的杂交瘤细胞株相对IgG 类较不稳定，且IgM 类抗体的一些性质测定会有困难，一般不建议使用。脾内免疫操作困难，实验动物极易死亡，所以也不常用此种方法。一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。 2．免疫方案典型的免疫策略依赖于抗原的反复刺激，以增强特异性免疫应答并使其成熟。

小鼠脾细胞的体外培养及形态观察

小鼠脾细胞的体外培养及形态观察黄殿玲,李核,何文琴,李霞,杨佩,王纯摘要：用组织块法和冷消化法对小鼠脾细胞在含血清培养液中进行原代培养,并对正常细胞形态进行观察。结果表明组织块法和消化法培养可获得比较均一、稳定的细胞群,细胞呈典型的成纤维形态。关键字：脾细胞原代培养形态多细胞生物的细胞可以分离出来，在适宜的培养液以及培养箱中存活，并在一定的时间内，保持其形态、生理、生化特性，经过一定时间还可以观察到一定量的细胞。直接从身故体内分离的细胞，如小鼠的脾细胞，在体外培养的过程中尚未发生细胞分裂、增殖的细胞即为原代培养细胞；原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖，在数量上大量扩增，此时的细胞为继代培养细胞。在生物体内或体外，正常的细胞只能分裂一定的次数，然后停止分裂，最终死亡。这一过程称为衰老，此为正常的现象。只有细胞被转化后，细胞可以无限增殖，就称为细胞系/株。细胞培养基要满足细胞的生长需要，包括pH、渗透压、营养和生长因子等，已保证细胞的增殖。细胞培养皿是特殊制造的使细胞可以贴壁。这就要为细胞的培养创造适宜的环境，使细胞更容易存活或生长。细胞培养箱常指二氧化碳培养箱。它可以提供合适的温度和二氧化碳浓度。二氧化碳和培养基中的缓冲系统共同作用，保持细胞培养液的酸碱度。超净台通过将空气进行过滤，为细胞培养的各种操作提供了一个干净的环境，使细胞培养免于细菌和真菌的污染。在细胞原代培养的操作过程中，这个设备是必要的，细胞本来就比较易感染，不易存活，在空气中，以及人体表面存在许多易感染细菌，所以为了提高细胞的存活率，一定要保持操作过程干净，无污染。细胞培养是细胞生物学研究的中心技术。通过细胞培养可以观察研究细胞的某些生理特性，同时在体外进行细胞培养，也打破了以往的细胞只能在生物体内增殖、分裂。其特点包括：大量实验材料；单一、纯粹细胞类型培养基的成分可控，即生长条件可控/全合成、无血清培养基；易于观察；易于操作。 1 材料与方法 1.1 实验材料取出生一周的小鼠，采用颈椎脱臼的方法牺牲小鼠。取一只小鼠置于解剖盘中，抓住小鼠的尾巴，确保小鼠的前爪在解剖盘中，慢慢的安抚使小鼠安静下来；用剪刀或手术钳紧紧的按住小鼠的颈的后部，用力向后拉小鼠的尾巴；切记不要

星形胶质细胞,少突胶质细胞分离培养新方法研究

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