小胶质细胞培养及鉴定

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BV2小胶质细胞经典激活及替代激活的诱导及鉴定

BV2小胶质细胞经典激活及替代激活的诱导及鉴定发表时间：2016-06-01T16:50:22.310Z 来源：《河南中医》2015年8月作者：吴非1,2 罗涛2 郭远瑾2 黎红华1 梅元武2[导读] 小胶质细胞是中枢神经系统内重要的固有免疫细胞，也是介导免疫反应的主要效应细胞。

吴非1,2 罗涛2 郭远瑾2 黎红华1 梅元武2（1.广州军区武汉总医院神经内科湖北武汉 430070）（2.华中科技大学协和医院神经内科湖北武汉 430022）【摘要】目的：观察BV2小胶质细胞经典激活及替代激活后代谢分子的变化，判断鉴别M1及M2极化型小胶质细胞的方法。

方法：小胶质细胞以100ng/ml的LPS及20ng/mL的IL-4分别经典激活及替代激活24小时，以ELISA方法检测IL-12、IL-10、TNF-α的分泌量，以实时荧光定量聚合酶链反应检测iNOS、Arg-1、IL-10、IL-12的mRNA表达，以流式细胞术检测细胞膜MMr蛋白表达。

结果：小胶质细胞被LPS 经典激活后呈M1型极化，IL-12、TNF-α分泌量、iNOSmRNA、IL-12mRNA表达量明显升高，与生理对照组比较有统计学差异（p<0.05)。

小胶质细胞被IL-4替代激活后呈M2极化， IL-10分泌量、Arg-1mRNA及IL-10mRNA表达量显著升高，流式细胞术检测MMr蛋白荧光强度较生理对照组显著上升（p<0.05)。

结论：小胶质细胞的能够被LPS经典激活呈M1型极化，IL-4替代激活呈M2型极化，M1/M2极化状态的小胶质细胞能够通过检测炎性相关因子、精氨酸代谢分子及细胞膜特异性蛋白三个方面得到鉴别。

【关键词】小胶质细胞；经典激活；替代激活；M1/M2型极化；脂多糖；白介素-4【中图分类号】R741 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）8-0651-02The Identification of Classical or Alternative Activation on BV2 MicrogliaWu Fei1,2,Luo Tao2,GuoYuan-jing2,Li Hong-Hua1, Mei Yuan-wu2（1 Department of neurology, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military 430070）（2.Department of neurology, Wuhan Union Hospital, HuaZhong University of Science and Technology 430022)【Abstract】Objective：To observe the changes in metabolic molecule of BV2 microglia after it is classical or alternative activated, and judge the methods to identify the M1 or M2 -type polarized microglia cells. Methods：BV2 microglia cells were classical activated by LPS in the concentration of 100ng/ml and alternative activated by IL-4 in the concentration of 20ng/mL for 24 hours, then ELISA was used to measure the levels of IL-12, IL-10, TNF-α , and Real-time PCR was used to detect the mRNA expression of iNOS,Arg-1, IL-10 and IL-12. Flow cytometry(FCM) was used to measure the levels of MMr membrane protein . Results：Microglia presented M1-type polarization state after it were classical activated, the secretion of IL-12 and TNF-α, the expression of iNOS mRNA and IL-12mRNA were significantly increased , and the difference were significant compare with that of in normal control group（P<0.05）. Microglia presented M2-type polarization state after it were alternative activated, and the secretion of IL-10, the expression of Arg-1mRNA and IL-10mRNA were significantly increased, and the difference were significant compared with that of in normal control group（P<0.05）. The levels of MMr were also increased significantly measured by Flow cytometry(FCM). Conclusion： BV2 microglia could present M1-type polarization state after it were classical activated, M2-type polarization state after alternative activated. The two type polarization could be identified detected from three aspects including inflammatory factors , arginine metabolic molecular and specific cell membrane proteins. 【Keywords】microglia，classical activation，alternative activation，M1/M2 type polarization， lipopolysaccharide，interleukin-4 小胶质细胞是中枢神经系统内重要的固有免疫细胞，也是介导免疫反应的主要效应细胞[1]。

BV-2 小鼠小胶质瘤细胞

（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，仅留下10ml培养液在瓶内继续培养。

(二)如果细胞已长满，即可进行传代培养。

具体步骤如下：
1. 弃去培养液，用PBS（不含钙，镁离子）洗1-2次。

2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒转放于37度培养箱1-3分钟预热，然后又将培养瓶倒转大约30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆分散，轻敲几下培养培养瓶，细胞随即脱落下来。

3. 加入6-8ml完全培养基，吸出，分到新的培养瓶中。

一传二。

注意：传代后一半用我们的培养基，一半用你们的，以免细胞不适应而造
成生长不好。

冻存方法：冻存液：95%完全培养液，5%DMSO
储存：液氮储存。

小胶质细胞的研究方法

小胶质细胞的研究方法小胶质细胞是一类位于中枢神经系统的非神经元细胞，它们在神经发育、维持神经环境稳定以及参与神经传导等方面发挥着重要的作用。

因此，研究小胶质细胞的方法对于深入了解神经系统的功能和疾病机制具有重要意义。

本文将介绍几种常用的小胶质细胞研究方法。

一、细胞培养小胶质细胞的细胞培养是研究小胶质细胞的基础方法之一。

细胞培养可以提供一个受控的实验环境，使得研究者可以对小胶质细胞进行多种实验操作。

通常，从小鼠或人脑中分离小胶质细胞，然后将其培养在含有合适培养基和生长因子的培养皿中。

通过细胞培养，可以研究小胶质细胞的形态、生理功能以及对外界刺激的响应等方面的特性。

二、免疫组织化学免疫组织化学是一种常用的研究小胶质细胞的方法。

通过标记特定的抗体，可以检测和定位小胶质细胞中的蛋白质或其他分子。

例如，通过使用特异性抗体标记小胶质细胞的特定表面标志物，可以帮助研究者确定细胞的类型和分布情况。

此外，免疫组织化学还可以用于检测小胶质细胞在神经系统中的反应和功能改变。

三、转录组学分析转录组学分析是研究小胶质细胞基因表达的重要方法。

通过RNA 测序技术，可以全面地了解小胶质细胞中基因的表达水平和变化。

这种方法可以帮助研究者发现小胶质细胞在不同发育阶段、疾病状态或受到不同刺激时的基因表达差异，进而揭示小胶质细胞在神经系统功能和疾病中的作用。

四、原位杂交原位杂交是研究小胶质细胞基因表达和分布的重要方法之一。

通过标记适当的探针，可以检测和定位小胶质细胞中具体基因的mRNA。

这种方法可以帮助研究者确定小胶质细胞中不同基因的表达模式和分布情况，进一步了解小胶质细胞的功能和相互作用。

五、功能性研究为了研究小胶质细胞的功能和影响，研究者还可以使用多种功能性实验方法。

例如，通过细胞钙成像技术可以监测小胶质细胞中的钙离子浓度变化，从而研究其对于神经信号传导的调控作用。

此外，还可以利用细胞电生理技术记录小胶质细胞的膜电位变化，以及使用基因敲除或过表达等方法研究小胶质细胞中特定基因的功能。

小胶质细胞原代培养

小胶质细胞原代培养时间：15天试剂：出生后1-2天的新生C57BL/6小鼠（斯莱克）9只DF12培养基（GIBCO，C11330）90ml胎牛血清（FBS）(10%) （GIBCO，10099）5ml解剖液50ml1 x胰蛋白酶(0.25%)（Gibco，25200-072）10ml10mg/ml DNA酶70ul75%酒精200ml器材：酒精棉球1杯（20个）装有75%酒精的敞口容器1个原代解剖器械盒（2把中号镊子，1把中号剪刀，1把眼科弯镊，1把眼科直镊，1把眼科剪，2把显微镊，1把显微剪）洗净消毒后小瓶3个（带盖子）小平皿4个（带盖子）解剖镜+冷光源消毒后卫生纸12张1ml移液器1把+枪头1盒10ml玻璃离心管3个T75大培养瓶3个消毒后吸管3根紫外消毒白大褂1件试剂配制：中和胰蛋白酶用的完全培养基：DF12 45ml和FBS 5ml混合而成。

步骤：1、取出生后1-2天的新生C57BL/6小鼠9只，泡在酒精中消毒后取出大脑，置于放有解剖液的小平皿中，在解剖镜下剥离血管膜关键：注意无菌操作；剥离血管膜要完全2、将剥离完血管膜的大脑放入预置有1ml解剖液的青霉素小瓶中，用显微剪剪碎（<1mm3）关键：剪碎效果较用枪头吹吸好，要剪得尽量碎3、加入两滴DNA酶和1ml胰酶（胰酶终浓度为0.125%），于37℃孵箱中孵育15分钟关键：每5分钟可略微晃动一下以助于消化4、取出小瓶，将液体倒入离心管中，加5ml完全培养基，离心（1000rpm*5分钟），取出离心管，吸出上清，再加入5ml无血清培养基，吹打后静置沉降20分钟，将上清用吸管吸出，加入T 75大培养瓶中，放入孵箱中培养，3小时后换液。

关键：静置沉降后吸取上清液时吸取中层（最上层和最下层均不要），避免杂质吸入培养瓶中5、每7天换一次液，培养14天后取出，在摇床中培养6小时（200rpm ，37o C），取上清加入离心管中离心（400g*8分钟），弃上清，加入4ml无血清培养基轻轻吹打重悬，均匀滴加于24孔培养板的中央4个孔中，于孵箱中培养半小时使小胶质细胞贴壁，取出，吸出上清，再每个孔加1ml培养基，即得较纯净的小胶质细胞。

小胶质细胞人补体攻膜复合物亚溶破模型制作及功能鉴定

小胶质细胞人补体攻膜复合物亚溶破模型制作及功能鉴定【摘要】目的：体外建立小鼠小胶质细胞补体攻膜复合物亚溶破模型，并进行功能鉴定, 探讨补体攻膜复合物( sublytic membrane attack complex, sMAC ) 对中枢神经系统小胶质细胞的亚溶破刺激效应.方法: 分离培养新生小鼠大脑皮层小胶质细胞, 用酵母多糖激活急性期患者血清制备补体优球蛋白 C56，以新鲜正常人血清( NHS ) 作为 C7～C9 来源，体外组装小鼠小胶质细胞 sMAC 亚溶破模型，CCK8 比色实验确定 sMAC 亚溶破剂量，激光共聚焦显微镜 ( LSCM )鉴定 sMAC 沉积.脱落细胞计数及台盼蓝拒染法分别判定细胞黏附力变化及脱落细胞活力. ELISA 法测定 sMAC 对小胶质细胞 NO 和 TNFα分泌量的影响. 结果：确定C56 1∶480，NHS 1∶20 为小胶质细胞亚溶破补体量；LSCM显示sMAC 沉积于小胶质细胞表面； sMAC 刺激小胶质细胞后与对照组相比细胞脱落增加 ( )，而活力正常. 刺激后 12 h NO 及 TNFα分泌量比对照组显着增加 (P )，不同时相观察sMAC 刺激后小胶质细胞 TNFα分泌量均显着高于失活 sMAC (). 结论：sMAC刺激小胶质细胞后分泌 NO 及 TNFα增多，并且可降低小胶质细胞黏附力而不影响细胞活力，推测 sMAC 对小胶质细胞具有炎性刺激效应.【关键词】 C56；补体攻膜复合物；小神经胶质细胞；显微镜检查，共焦；细胞活力; 一氧化氮；肿瘤坏死因子0引言补体系统是机体防御外侵的天然免疫屏障,由30余种血清蛋白组成，具有级联酶促和自我调节反应，可通过经典或旁路途径激活，形成膜攻击复合物产生杀伤效应. 对MAC 的早期研究仅局限于对红细胞的溶破，后期研究显示，非致死量的 MAC结合到有核细胞可刺激细胞发生多种病理、生理变化，如产生氧自由基、细胞因子，诱导膜蛋白表达等，在多种疾病的发生和发展中发挥作用，该效应被称为补体攻膜复合物的亚溶破刺激效应［1］. 迄今，sMAC 对内皮细胞、淋巴细胞、肾小球细胞等多种有核细胞的刺激效应已有报道［2］，而对中枢神经系统中小胶质细胞的亚刺激效应至今报道甚少. 我们以原代小鼠小胶质细胞为靶细胞, 提取人血清补体优球蛋白,体外组装小胶质细胞sMAC 亚溶破模型，并检测其炎性反应, 初步探讨 sMAC 对小胶质细胞的亚刺激效应.1材料和方法材料SPF级近交系 Balb/c 小鼠 ( 1~2 d ) 购自第三军医大学实验动物中心. 激光共聚焦显微镜 TCS NT 购于德国Leica仪器公司. 小鼠抗人MAC新抗原单克隆抗体AE11，小鼠抗人 CD3 单克隆抗体UCHT1，CCK8试剂盒 (Dojindo日本)，NO 检测试剂盒，TNFα检测试剂盒 (BD美国 )，急性期患者血清取自西南医院检验科；正常人血清取自10人以上义务献血员.方法小鼠小胶质细胞培养体外培养小鼠小胶质细胞,免疫组化鉴定小胶质细胞纯度，95%方满足实验要求.补体优球蛋白C56 的提取及活性鉴定急性期患者血清与 4 g/L 酵母多糖，mmol/L Mg2+37℃作用1 h后离心，取血清用微量补体反应性溶血法鉴定补体C56活性，收集活性样品用mol/L PB (pH ) 透析，所得优球蛋白沉淀溶于含 100 g/L甘油的mol/L PBS (pH ) 中，即为功能纯C56制品.比色实验确定sMAC亚溶破剂量将小胶质细胞以2×108 /(L・孔)接种于96孔培养板，漂洗后，每孔中加入含1 mmol/L EDTA 无血清IMDM 养基100 μL,不同释度功能纯C56 10 μL，37℃ 孵育 15 min，再加入1∶20 NHS，37℃ 孵育1 h组装 sMAC. 每孔中加入10 μL CCK8试剂，37 ℃ 30 min，于 450 nm 波长处测定A值.鉴定sMAC小胶质细胞上的沉积将2×104 小胶质细胞接种于自制盖玻片小室，生长至80%融合，漂洗，加入亚溶破剂量C56，37℃ 15 min；再加入EDTANHS，冰上孵育60 min于细胞表面组装sMAC. 固定并封闭，加入小鼠抗人1∶10 sMAC单克隆抗体，同时设立小鼠抗人CD3 IgG 同型对照和不加一抗阴性对照，4 ℃过夜；FITC 标记的羊抗小鼠二抗，4 ℃ 1 h，漂洗后磷酸甘油封片，4 ℃避光保存，48 h 内用LSCM观察.刺激小胶质细胞后脱落细胞计数及细胞存活率细胞分为未刺激，sMAC，同浓度C56，1∶20 EDTANHS，失活sMAC共5组. 将C56与NHS于37℃提前混合孵育30 min，使sMAC 失活. 各组细胞37℃孵育 24 h，收集温育液，离心，加少量培养液重悬，以计数板计算脱落细胞数，同时以台盼蓝拒染法，计算细胞存活率.对小胶质细胞NO和TNFα合成的影响细胞分组同前，37℃孵育12 h，收集上清，离心后检测各组NO与TNFα分泌量.统计学处理：应用SPSS 软件处理，所有数据用x±s表示，组间采用t检验和方差分析，为统计学上有显着差异.2结果亚溶破模型的建立以人血清补体C56与。

星形胶质细胞和小胶质细胞培养

星形胶质细胞和小胶质细胞培养文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）胶质细胞原代培养及纯化2.1原代胶质细胞培养培养箱中6h以上，使用1）于细胞培养前1d，用0.05%PLL(orPLO)包被培养瓶，置5%CO2前用HBSS液冲洗3次，备用；2）1d内的新生C57小鼠4只，置入75%乙醇中消毒后断头处死，75%乙醇中漂洗一次，迅速转移至预冷的HBSS（可加入双抗）中，弯镊从鼻部固定住头部，迅速剪开皮肤，换剪刀，从正中线剪开颅骨，弯镊向两边剥去颅骨，去小脑，将脑组织置于含预冷的HBSS的60mm培养皿中；3）解剖显微镜下仔细剥离皮层表面脑膜和血管后置于含预冷的HBSS的60mm小皿中，用HBSS洗3次，留少量刚好盖过组织，用眼科弯剪剪碎组织（越碎越好），加入0.25%胰酶2mL，于37℃水浴中消化7min，消化过程中摇晃离心管数次，使消化均匀；4）加入含有血清DMEM/F12完全培养基10mL(1:1)终止消化；5）使用玻璃滴管或1mL枪头吹打（可将其头部略剪一部分，以扩大口径），若一次取的动物只数多，由于液体过多，可使用5mL枪头进行吹打，但因其吹打力度较大，操作时要尽量轻且吹打次数不宜过多；6）吹打过程采用分步吹打法，每吹打15~20下，静置1~2min，吸取上清，以避免已消化出的单细胞被过多吹打，该过程重复3次；7）200目筛网过滤至50mL离心管中，去除残余的组织块；8）1000r/min×5min，弃上清；9）调整细胞数为1～2×106/mL,接种到25cm2培养瓶中,每瓶5mL；10）接种24h后换以新鲜完全培养基，以除去悬浮死亡的细胞及碎片；11）细胞每3d更换培养液，培养10～12d左右细胞基本铺满瓶壁，进行纯化分离。

分离根据胶质细胞间贴附性不同进行，将培养瓶放入恒温振荡器中，37℃180rpm振荡5h，上层疏松贴壁的为小胶质细胞；底层即是纯度较高的星形胶质细胞，收集小胶质细胞，离心重悬，接种于35mm圆皿中；星形胶质细胞用0.25%胰酶消化按1：2传代，待长满后用于实验。

小鼠原代星形胶质、神经元和小胶质细胞培养方法

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原代神经小胶质细胞培养方法的初探

原代神经小胶质细胞培养方法的初探廖婷;袁雪;荣曦;刘红【摘要】目的:建立一种简单有效的小胶质细胞原代培养和纯化方法.方法:取出生24h的SD大鼠的脑皮层组织,胰酶消化成单个细胞、培养,待细胞长满培养瓶后,用力拍打培养瓶3min,离心并收集沉淀,加入新培养基再培养,采用免疫荧光法鉴定其纯度.结果:共聚焦显微镜鉴定小胶质细胞纯度达到96.85％.结论:拍击法提纯小胶质细胞的培养方法产量多,纯度高,为小胶质细胞在神经退行性疾病相关研究提供了基础.%Objective:To establish a simple and efficient method for the separation and purification of primary microglia.Methods:The cerebral cortex tissues were collected from one-day-old neonatal SD rats,and cells were obtained through trypsin digestion.The single cell suspension was then cultured.After the cells were confluent on the bottom of the culture flask,the culture flask was vigorously tapped for 3min,then centrifuged and the precipitate was collected and cultured again.The purity was identified by immunofluorescence. Results:The purity of microglia was96.85％.Conclusion:Vigorously tapping the culture flask could achieve high yield and high purity of microglia,and it provided the foundation for the study of microglia in neurodegenerative diseases.【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2019(036)004【总页数】4页(P650-653)【关键词】小胶质细胞;原代培养;纯化方法;神经退行性疾病【作者】廖婷;袁雪;荣曦;刘红【作者单位】广西医科大学第一附属医院老年内分泌科,南宁 530021;广西医科大学第一附属医院老年内分泌科,南宁 530021;广西医科大学第一附属医院老年内分泌科,南宁 530021;广西医科大学第一附属医院老年内分泌科,南宁 530021【正文语种】中文【中图分类】R741小胶质细胞在中枢神经系统的损伤及疾病转归过程中起着重要作用[1]。

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2．1小胶质细胞的原代细胞培养
2．1．1混合胶质细胞培养自中山大学北校区动物中心购买刚出生1天内的SD乳鼠，用75％酒精消毒后固定四肢，剪开皮肤、颅骨，取出脑组织放入PBS液中洗涤一次，分离脑干取出，脑膜及血管尽量剥离，将组织放入盛有DMEM／F12无血清培养基的培养皿中，移至离心管中剪碎，加入浓度为0．125％的胰蛋白酶，37。

C水浴箱中消化15分钟，血清终止消化，待组织沉淀后收集上液，余下组织可通过反复吹打进行再次消化，经过709m细胞滤网过滤，收集滤液，1500r ／min离心5分钟，去上清，加入完全培养基悬浮细胞后进行细胞计数，以1*106接种至预先用多聚．L．赖氨酸铺被的75cm2培养瓶中。

24d'时后稍微轻摇下未贴壁及贴壁不稳的细胞碎片，全量更换培养基，随后4天／次换液，约至10天左右可见明显的细胞分层，上层为半贴壁，呈圆形，透光性较好，主要为小胶质细胞及少量的少突胶质细胞，下层细胞主要为星形胶质细胞、神经元。

第一章原代小胶质细胞的培养、纯化及鉴定
2．1．2小胶质细胞分离及纯化：机械振摇法：将铺满胶质细胞／神经元的培养瓶置于摇床振摇，180r／min，15rain，将培养基吸出，并用PBS冲洗1遍，收集脱落的细胞，1500r／s 5min离心，去除上清液，加入完全培养基，吹打混匀，计数，(34+39+30+33)／4×104／ml，以3×105／孔的浓度将细胞种入6#L板(已放置盖玻片)，37。

C 5％C02温箱培养15．30分钟，更换培养基，即去除延迟贴壁的少突胶质细胞，贴壁细胞即为纯化的小胶质细胞。

分离后的底层混
合细胞继续加入15％FBSDMEM／F12培养基，4．5天后可以再次收获小胶质细胞。

2．1．3免疫荧光鉴定步骤
1)小胶质细胞接种第2—3天后，待细胞在盖玻片上伸出伪足时，自培养箱中取出。

2)用预温的PBS洗3次，每次5分钟
3)4％多聚甲醛室温固定20分钟左右
4)PBS洗3次，每次5分钟
5) 5％BSA室温封闭30分钟
6)加抗Iba抗体(用1％BSA稀释)放在湿盒里，4V过夜
7)PBS洗3次，每次5分钟
8)DIIFITC．山羊抗小鼠IgG(用1％BSA稀释)避光孵育1小时
9)PBS洗3次，每次5分钟
10)DIIDAPI(用1％BSA稀释)避光孵育5分钟
11)1xPBS洗3次，每次5分钟
12)95％甘油封片。