微粒体制备
大鼠肝微粒体的制备
2.1.3 大鼠肝微粒体的制备大鼠肝微粒体制备全过程：1．购买实验动物SD 大鼠，20 只，雌雄各半，体重（180-220）g，广州中医药大学实验动物中心提供。
合格证号：00557062．大鼠肝脏灌流购买的大鼠当天腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg·kg-1 ），使其麻醉，利用酒精进行常规消毒后，打开腹腔暴露肝脏，肝门静脉处进行插管并固定。
结扎上腔静脉，剪破下腔静脉用磷酸盐缓冲液进行灌流，直至肝脏颜色呈土黄色。
3．灌流好的肝脏取出后按1：4 比例放入装有磷酸盐缓冲液（含1mMEDTA ,0.25M 蔗糖）的匀浆管内，剪碎，匀浆。
4．将匀浆液倒入50mL 高速离心管中在4℃条件下9000g 离心20 min。
5．保留上清并转移到超速离心管中，在4℃条件下100000g 离心60min。
6．保留沉淀并重新混悬于磷酸盐缓冲液（含0.9%的NaCL）中, 4℃条件下100000g 再离心60 min，得到的沉淀即为肝微粒体。
7．将肝微粒体重悬于0.1M 磷酸缓冲液（PH7.4，20%甘油，1mM EDTA，0.25M 蔗糖）中于-70℃冰箱保存，其中留取一小管用于蛋白浓度测定。
8．微粒体蛋白浓度测定依据的是Lowry et. al.方法(Lowry et al.,1951)，首先用牛血清白蛋白标准溶液配置成不同浓度的蛋白标准溶液，与斐林试剂混匀发生反应后测定蛋白浓度，根据吸光度A 和蛋白浓度C 进行线性回归并绘制标准曲线。
同样的方法测定肝微粒体的吸光度，根据标准曲线线性回归方程计算肝微粒体蛋白浓度。
9．肝微粒体中P450 酶含量测定根据Omura and Sato 的方法(Omura and Sato,1964)，用Tris-HCl 缓冲液把肝微粒体样品稀释至0.3−0.5 mg/mL，取两份肝微粒体分别放于参比池和样品池，400 nm～500 nm 扫描基线；参比池和样品池都加入少量Na2S2O4，轻微搅拌，并给样品池通CO 气体30 s，再次扫描，记录450 nm 和490 nm 处的吸光度，按Beer 定律（公式2.1）计算CYP450 的含量。
纳米微粒的制备-液相法-2010
4.2.4水热法
水热反应是高温高压下在水(水溶液)或水蒸气等流体中 进行有关化学反应的总称．
➢使液滴在游离于气相中的状态下进行热处理，这种方法是喷雾焙烧 法(spray baking method)，
除此之外，还有其他方法。
喷雾干燥法
• 以镍、锌、铁的硫酸盐一 起作为初始原料之混合溶 液并进行喷雾就可制得粒 径为10~20m，由混合硫 酸盐组成的球状颗粒。若 将这种球状颗粒在 800~l000C进行焙烧就能 获得镍、锌铁氧体。
金属醇盐的制备
（3）金属氢氧化物、氧化物、二烷基酰胺盐与醇反 应，醇交换
M(OH)2 + 2ROH → M(OR)2 +2H2O ↑
除掉水分子，使平衡向右移动。
4.2.3 喷雾法
溶液通过各种物理手段进行雾化获得超微粒子的一种 化学与物理相结合的方法．
它的基本过程是溶液的制备、喷雾、干燥、收集和热 处理．其特点是颗粒分布比较均匀，但颗粒尺寸为亚 微米到l0μm．
如以Ti(OH)4胶体为前驱物，采用30mm430mm的管式高压 器，内加贵重金属内衬，高压器作分段加热，以建立适宜的 温度梯度(temperature gradient)。在300C纯水中加热反 应8h，用乙酸调至中性，用去离子水充分洗涤，再用乙醇洗 涤，在l00C下烘干可得到25nm的TiO2粉体。
中加NH4OH后便有Zr(OH)4和Y(OH)3的沉淀粒子缓慢形
成．反应式如下：
肝微粒体的制备
肝微粒体的制备肝微粒体是细胞内的一种重要细胞器，其具有多种生物合成和代谢功能。
为了研究肝微粒体的结构和功能，科学家们开展了一系列的制备方法。
肝微粒体的制备方法主要包括离心法、差速离心法和梯度离心法。
离心法是最常用的制备方法之一。
首先需要从动物或人体中提取肝脏组织，然后将组织切碎并加入缓冲液。
接下来，用离心机对混合物进行离心，使得细胞器按照密度分层。
通过不同离心速度和离心时间的调节，可以分离出肝微粒体。
差速离心法是离心法的一种改进方法。
该方法利用不同细胞器的密度差异，通过多次离心来进一步分离纯净的肝微粒体。
首先，将组织切碎并加入缓冲液进行离心，得到一个粗制的肝微粒体上清液。
然后，将上清液进行再离心，获得更纯净的肝微粒体。
通过多次离心，可以得到更高纯度的微粒体。
梯度离心法是一种更为精细的制备方法。
该方法利用不同密度的梯度溶液，通过离心使得细胞器分层。
首先，制备不同浓度的梯度溶液，然后将组织切碎并加入梯度溶液。
接下来，用离心机对混合物进行离心，使得细胞器按照密度分层。
通过调节离心速度和时间，可以分离出纯净的肝微粒体。
肝微粒体的制备方法选择取决于研究的目的和需要。
离心法简单易行，适用于初步的制备。
差速离心法和梯度离心法需要更多的技术和设备支持，但可以得到更高纯度的肝微粒体。
在肝微粒体的制备过程中，需要注意以下几点。
首先，组织的采集和处理需要在低温和无氧条件下进行，以保持微粒体的完整性和活性。
其次，离心速度和时间的选择应根据具体实验要求进行调整，以获得最佳的分离效果。
此外，在制备过程中，需要注意避免污染和交叉感染，以确保实验结果的准确性和可靠性。
肝微粒体的制备是研究肝细胞生物学和代谢过程的重要工具。
离心法、差速离心法和梯度离心法是常用的制备方法，选择适合的方法可以得到纯净的肝微粒体。
在实验过程中，需要注意操作技巧和实验条件的控制，以确保制备的微粒体质量和纯度。
通过这些制备方法，科学家们可以更深入地研究肝微粒体的结构和功能，为相关疾病的治疗和药物研发提供理论基础。
实验六.肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定
院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定1 实验目的本实验通过超速离心法制备肝微粒体，利用Bradford法，学习并掌握了细胞色素P-450含量的测定。
2 实验原理研究体外药物代谢常用的方法是制备肝微粒体或线粒体后部分，将肝组织制备成20％匀浆，按1g肝组织加0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液3mL ，磨成匀浆，用低温高速离心制备线粒体后上清液和超速离心法制备微粒体（内质网部分）-差速离心法。
细胞色素P-450是微粒体混合功能氧化酶中最主要的功能成分，其含量的高低基本可以反映混合功能氧化酶的活力大小。
细胞色素P-450是一种血红蛋白，当铁蛋白的铁离子被还原并与一氧化碳形成复合物时出现一种特异吸收峰，在波长450nm处呈现最大吸收峰，在490nm处为最低吸收。
根据两者的差值和吸收系数，可定量细胞色素P-450含量。
3 实验材料3.1实验动物大鼠：健康，体重200～250g，禁食过夜（24h）3.2实验器材与试剂器材：低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等试剂：1.17% KCl 溶液Tris-HCl缓冲液： Tris 6.05 g ；蔗糖 68.4 g；水 500 ml；浓盐酸调 pH 7.4；补水至 1000 ml4.实验方法4.1动物处理与匀浆制备断头处死，放尽血液，迅速剖开胸、腹腔，取出肝脏，用冰冷1.17% KCl 溶液洗净血污，并用滤纸吸干表面水分。
肝脏称重，置烧杯中剪碎，按每克肝脏3ml的比例加入0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液，匀浆，将匀浆倒入离心管中，用缓冲液洗涤匀浆管，使最后的缓冲液体积加至约20％（W/V）的匀浆。
4.2制备线粒体后上清液将肝匀浆置低温高速离心，以沉淀未破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体，上清液即为线粒体后上清液。
(仅供参考)实验4-肝微粒体制备
6.肝微粒体（hepatic microsome）富含多 种物质代谢酶类，在外来化学物的生物转 化中起着极其重要的作用。某些外来化合 物可通过诱导或抑制肝微粒体代谢酶的活 性，影响其他外来化学物在体内的代谢结 局。
8.离心25000g/min, 15min；
9.按1g肝组织加1ml磷酸缓冲盐溶液,充分混 匀后冻存管分装,置-80℃冰箱内保存待用.
注意事项：
上述过程应使用预冷的匀浆介质、缓冲液 和离心转头。匀浆器、容器等均应保持在冰 浴中，以维持组织及其制备物在0－4℃的!
4. 将匀浆液离心（4℃，1000g，10min）
5.取上清离心（12000g,10min）；
6.取上清计算体积，按10：1比例加入预冷氯 化钙，冰浴5min，摇匀，以25000g/min离 心15min,弃上清得粉红色微粒体沉淀 。
7.将微粒体沉淀混悬于氯化钾-Tris-盐酸缓 冲液中(2ml)，用漩涡混合器充分混匀；
三、实验步骤
1. 处死小鼠；
2. 快速摘除肝脏，自门静脉注入预冷的冰生理盐水 20-50ml，冲洗肝脏至土黄色，再用生理盐水将 肝脏外周血水冲洗干净，用滤纸擦干净后称重、 记录。
3. 将称重后的肝组织置于烧杯中（置冰板上）剪碎 ，转入匀浆管中，并按每克肝组织加1～2ml预冷 的蔗糖-Tris-盐缓冲液，用电动匀浆机制备匀浆 （转速1000rpm）（冰浴中）,研杵上下移动8－ 10次，定容至5ml。
2.肝脏或其他组织磨碎 (均质化)之后，微 粒体能够在不同的离心速度之下，从其他 的细胞胞器区隔出来、浓缩并分离。
3.组织匀浆中未破碎的细胞、细胞核与线 粒体在9000g的离心速度下可以被沉淀并 分离，而细胞色素P450、内质网碎片及 其他可溶性酶素则保留在上清中。
肝微粒体制备
肝微粒体制备1. 简介肝微粒体（mitochondria）是细胞中的一种细胞器，主要负责细胞内能量的产生和调节。
肝微粒体制备是一种常用的实验技术，用于研究肝脏中微粒体的结构和功能。
本文将介绍肝微粒体制备的步骤和相关实验方法。
2. 肝微粒体制备步骤2.1 器材准备•洗涤缓冲液：含有0.25 M 蔗糖、10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、1 mM EDTA 和0.1% BSA的缓冲液。
•离心管：用于离心过程。
•显微镜滑片：用于观察制备得到的肝微粒体。
2.2 肝脏取材•将新鲜动物（如小鼠）的肝脏取出，并放入冰冻盒中保持低温。
•快速切碎肝脏组织，以避免氧化酶的活性降低。
2.3 组织匀浆•将切碎后的肝脏组织加入洗涤缓冲液中。
•使用均质机将组织匀浆，以破碎细胞膜和释放肝微粒体。
2.4 离心分离•将匀浆后的混合液离心10分钟，以去除未破碎的细胞碎片和细胞核。
•将上清液转移到新的离心管中，并进行第二次离心，以沉淀肝微粒体。
2.5 肝微粒体收集•将离心得到的沉淀用洗涤缓冲液悬浮。
•用洗涤缓冲液洗涤肝微粒体，以去除杂质。
•最后一次离心后，将上清液倒掉，保留沉淀中的肝微粒体。
3. 肝微粒体制备相关实验方法3.1 蛋白含量测定•使用Bradford方法或BCA方法测定制备得到的肝微粒体中蛋白质的含量。
•根据实验需要调整蛋白质的浓度。
3.2 肝微粒体功能检测•使用荧光探针（如JC-1）检测肝微粒体的膜电位。
•使用呼吸链底物（如琥珀酸、NADH）测定肝微粒体的呼吸功能。
3.3 肝微粒体结构观察•使用透射电子显微镜观察制备得到的肝微粒体的形态和结构。
•准备样品时要注意避免溶剂残留和样品的干燥。
4. 结论肝微粒体制备是一种重要的实验技术，用于研究肝脏中微粒体的结构和功能。
通过合理的步骤和实验方法，可以成功制备得到高质量的肝微粒体，并进一步开展相关实验研究。
了解肝微粒体的制备过程对于深入理解细胞内能量代谢和调节机制具有重要意义。
肝微粒体的制备
肝微粒体的制备2篇肝微粒体的制备（一）肝微粒体（hepatocyte mitochondria）是存在于肝细胞内的细胞器，其主要功能是参与能量代谢和细胞呼吸。
肝微粒体的制备主要通过离心分离的方法实现。
首先，需要准备一定数量的新鲜肝组织，可以选择小鼠或大鼠的肝脏作为材料。
肝脏应在动物安乐死后立即取出，并放入生理盐水中进行冲洗，以去除任何附着在表面的血液。
然后将肝脏切割成小块，并用冰冷的缓冲液洗涤，以进一步清除血液。
接下来，使用钝性杆或刀片将肝组织切成更小的块。
这样做的目的是增加细胞器的表面积，以便更好地制备微粒体。
然后，将这些组织块置于含有细胞质破碎缓冲液（常用的缓冲液为MES缓冲液）的离心管中，经过适当的研磨和振荡，使细胞质破碎，释放出细胞器。
接下来，将细胞质悬液用离心机进行离心分离。
首先进行低速离心，以去除细胞核和细胞碎片，得到一个大部分富含肝微粒体的上清液。
然后，将上清液继续进行高速离心，将肝微粒体沉淀。
离心结束后，将上清液倒掉，得到肝微粒体的沉淀。
最后，可以用适当的缓冲液洗涤肝微粒体沉淀，以去除杂质。
洗涤后，将肝微粒体沉淀进行储存或进一步使用。
制备好的肝微粒体可以用于细胞呼吸和能量代谢的研究。
肝微粒体的制备（二）肝微粒体（hepatocyte mitochondria）的制备是一项重要的技术，常用于研究肝细胞能量代谢和细胞呼吸等领域。
下面介绍一种常用的肝微粒体制备方法。
首先，准备新鲜的肝组织，可以选择小鼠或大鼠的肝脏作为材料。
肝脏取出后立即放入冰冷的生理盐水中冲洗，以去除附着在表面的血液。
然后将肝脏切割成小块，并加入冰冷的细胞质破碎缓冲液（如MES 缓冲液）中。
接下来，使用均质器或超声处理器对肝组织进行细胞质破碎。
通过适当的处理时间和功率，使细胞质完全破碎释放出肝微粒体。
破碎后的细胞质悬液可以通过低速离心去除细胞核和细胞碎片。
然后，将去除细胞核和细胞碎片的细胞质上清液继续进行高速离心，以沉淀肝微粒体。
双峰驼肝微粒体的制备及 CYP1A 酶活性检测
双峰驼肝微粒体的制备及 CYP1A 酶活性检测何兴瀚;张文彬;哈斯苏荣【摘要】为研究双峰驼细胞色素氧化酶1A（CYP1A）的体外活性，首先采用差速离心法制备双峰驼肝微粒体，并用 BCA 法测定其蛋白浓度；然后采用 CO 还原差示光谱法分别测定 CYP 总酶含量和细胞色素 b5含量；最后通过 CYP1A 酶对7-乙氧基香豆素的脱羟基作用评价其体外活性。
结果表明，所制备的双峰驼肝微粒体悬液蛋白浓度为1．652 mg／g±0．341 mg／g，CYP 总酶含量为0．08 nmol／mg±0．014 nmol／mg，细胞色素 b5（Cybts）含量为0．113 nmol／mg±0．036 nmol／mg，且 CYP1A 酶具有降解其特异性底物-7-乙氧基香豆素的活性。
说明所制备的双峰驼肝微粒体悬液蛋白浓度、CYP 总酶和 Cytb5含量以及 CYP1A 酶活性等基本参数均能满足后续的双峰驼 CYP1A 酶体外活性研究基本要求。
%To establish a reliable hepatic microsomal platform for studying the activities of Bactrian camel CYP1A enzyme in vitro ,the Bactrian camel hepatic microsomes were prepared by using differential centrif-ugation,and the protein concentration was determined by BCA method;and then the content of total CYP enzyme and cytochrome b5 were detected by differential spectroscopy;finally the activity of CYP1A en-zyme was evaluated by 7-ethoxycoumarin dehydrogenases.The results showed that the prepared suspension of Bactrian camel hepatic microsomal protein concentration was 1.652 mg/g±0.341 mg/g,total CYP en-zyme content was 0.08 nmol/m±0.014 nmol/mg,cytochrome b5 (Cybts)content was 0.113 nmol/mg±0. 036 nmol/mg,and the CYP1A enzyme can degrade the substrate specificity which is 7-ethoxycoumarin.Therefore,the basic parameters of hepatic microsomal protein,total CYP enzyme and Cytb5 content and CYP1A enzyme activity can meet all of requirements for follow-up study on Bactrian camel CYP1A enzyme activities in vitro .【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2015(000)012【总页数】4页(P41-44)【关键词】双峰驼;肝微粒体的制备;评价;CYP1A【作者】何兴瀚;张文彬;哈斯苏荣【作者单位】内蒙古农业大学兽医学院，农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018;内蒙古阿拉善骆驼科学研究所，内蒙古巴彦浩特 750300;内蒙古农业大学兽医学院，农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018; 内蒙古骆驼研究院，内蒙古巴丹吉林镇 750300【正文语种】中文【中图分类】S852.21双峰驼由于长期生活在干旱的半荒漠草原地区，因此具有极强耐受性，能够耐高温、耐饥渴、耐盐碱，对恶劣环境的适应性和抗病力很强。
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微粒体制备
一、工作原理
微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构,这些小囊泡的直径大约100nm左右, 是异质性的集合体。
它包含内质网膜和核糖体两种基本成分，在体外实验中具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。
肝脏或其他组织磨碎 (均质化)之后，微粒体能够在不同的离心速度之下，从其他的细胞胞器区隔出来、浓缩并分离。
组织匀浆中未破碎的细胞、细胞核与线粒体在9000g的离心速度下可以被沉淀并分离，而P450、内质网碎片及其他可溶性酵素则保留在上清中。
取上清在更快速的100,000g离心旋转之下，P450、内质网会沉淀成粒状或块状，而可溶性酵素则保留在上清中，将沉淀重悬即可得到微粒体。
因此，微粒体在细胞生物学中定义为从内质网的碎片所得到的小型囊泡。
微粒体含有细胞色素P450 (CYP)，由于P450中的辅助因子、血基质含有铁元素，微粒体常呈现红褐色。
肝（或其他组织）微粒体体外温孵实验是采用从肝脏（或其他组织）中提取的微粒体，加入还原型辅酶II(NADPH)再生系统，在体外模拟生理环境下进行代谢反应，采用高效液相色谱(HPLC)、高效液相色谱质谱联用法(HPLC-MS)等测定方法对原型药及代谢产物进行测定的一种体外代谢的实验方法.
二、实验准备
以制备肝微粒体为例：
1、器材：匀浆机、大剪刀（断头）、手术剪、眼科剪3个、眼科镊3个、头皮针、注射器20ml、烧杯（500ml）4个、冰盒、冰板、匀浆管（5/10ml）、离心管（生科院借）、冻存管N个、培养皿N个。
2、试剂：冰生理盐水
PBS 缓冲液：1000ml缓冲液中含磷酸钾缓冲盐0.1mol·L-1、KCl 0.15 mol·L-1和1mmol·L-1EDTA,即1000ml超纯水中含K2HPO4 (228.23)18.304g、KH2PO4 (136.09)2.695g、KCl(74.55) 11.2g和EDTA0.372g，分装，4℃保存。
含20%甘油的PBS缓冲液200ml：40ml甘油+160ml上述PBS（存争议）三、实验步骤
以制备肝微粒体为例：
1、获取肝脏
大鼠禁食不禁水24h 后，将大鼠断头处死并置冰板上，打开腹腔，自门静脉注入预冷的冰生理盐水20-50ml，冲洗肝脏至土黄色，快速摘除肝脏，再用生理盐水将肝脏外周血水冲洗干净，称重、记录。
2、组织匀浆
在冰板上将肝组织剪为2-3g左右的小块，称重并记录，将每小块肝组织在培养皿中（置冰板上）剪碎，转入匀浆管中并加入一定体积的（1mL/g肝组织）PBS 缓冲液，于冰水浴中制成肝匀浆。
3、差速离心
将每组肝匀浆合并，装于9000g离心管中（生科院借），配平后4℃9000g离心20min取出，可见匀浆液基本分为三层：最上层白色漂浮物可能为脂肪组织、最下层沉淀为组织匀浆中未破碎的细胞、细胞核与线粒体、中间上清层为后续离心所需。
撇开表层脂肪，取上清液于100000g离心管中（生科院借）中，精确配平后4℃100000g离心60min，弃上清，并用PBS再次冲洗下层沉淀（动作轻微），弃PBS，得下层粉红色沉淀即为所需的肝微粒体（microsome）。
4、重悬沉淀
将沉淀物悬浮于含20%甘油的磷酸钾缓冲液中（1g组织加入1mL含20%甘油的磷酸钾缓冲液），反复在冰水浴中吹打均匀，冻存管分装后置-80℃冰箱内保存待用。
5、蛋白定量
采用BCA法测定肝微粒体蛋白浓度。