番鸭细小病毒和鹅细小病毒的抗原相关性研究_程晓霞

程晓霞，陈仕龙，陈少莺，等．番鸭细小病毒和鹅细小病毒的抗原相关性研究［Ｊ］．福建农业学报，２０１３，２８（９）：８６９－８７１．ＣＨＥＮＧ　Ｘ－Ｘ，ＣＨＥＮ　Ｓ－Ｌ，ＣＨＥＮ　Ｓ－Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　Ｒｅｌａｔｉｖｉｔｙ　ｏｎ　Ｍｕｓｃｏｖｙ　Ｄｕｃｋ　Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　Ｇｏｏｓｅ　Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｆｕｊｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１３，２８（９）：８６９－８７１．番鸭细小病毒和鹅细小病毒的抗原相关性研究程晓霞１，２，陈仕龙１，２，陈少莺１，２，林锋强１，２，王　劭１，２，朱小丽１，２（１．福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建　福州　３５００１３；２．福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建　福州　３５００１３）收稿日期：２０１３－０６－２８初稿；２０１３－０７－２５修改稿作者简介：程晓霞（１９７２－），女，副研究员，主要从事动物传染病免疫学研究通讯作者：陈少莺（１９６２－），女，研究员，主要从事动物传染病病原与防治研究（Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｓｙ５８＠１６３．ｃｏｍ）基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（２０１００３０１２）；现代农业产业技术体系项目（ＣＡＲＳ－４３）；福建省财政专项———福建省农业科学院创新团队建设项目（ＳＴＩＦ－Ｙ０２）；福建省自然科学基金项目（２０１２Ｊ０１１１０）摘　要：应用微量交叉中和试验（ＮＴ）和胶乳凝集抑制试验（ＬＰＡＩ）比较番鸭细小病毒、鹅细小病毒和番鸭源鹅细小病毒之间的抗原相关性。

结果显示：３种病毒与同源抗血清的中和效价和ＬＰＡＩ效价均明显高于异源血清；番鸭细小病毒与番鸭源鹅细小病毒、鹅细小病毒之间的Ｒ值均小于０．１；番鸭源鹅细小病毒与鹅细小病毒的Ｒ值大于０．２５。

结果表明番鸭细小病毒与鹅细小病毒（番鸭源或鹅源）的抗原相关性较低，提示番鸭源鹅细小病毒与鹅细小病毒属于同一血清型的不同亚型。

关键词：番鸭细小病毒；番鸭源鹅细小病毒；鹅细小病毒；抗原相关性中图分类号：Ｓ　８５８文献标识码：ＡＡ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　Ｒｅｌａｔｉｖｉｔｙ　ｏｎ　Ｍｕｓｃｏｖｙ　Ｄｕｃｋ　Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　Ｇｏｏｓｅ　ＰａｒｖｏｖｉｒｕｓＣＨＥＮＧ　Ｘｉａｏ－ｘｉａ１，２，ＣＨＥＮ　Ｓｈｉ－ｌｏｎｇ１，２，ＣＨＥＮ　Ｓｈａｏ－ｙｉｎｇ１，２，ＬＩＮ　Ｆｅｎｇ－ｑｉａｎｇ１，２，ＷＡＮＧ　Ｓｈａｏ１，２，ＺＨＵ　Ｘｉａｏ－ｌｉ　１，２（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ　ａｎｄ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｆｉｊｉａｎ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ　３５００１３，Ｃｈｉｎａ；２．Ｆｕｊｉａｎ　Ａｎｉｍａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＣｅｎｔｅｒ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ　３５００１３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｏｆ　Ｍｕｓｃｏｖｙ　ｄｕｃｋ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ（ＭＰＶ　Ｆ　ｓｔｒａｉｎ），Ｍｕｓｃｏｖｙ　ｄｕｃｋ　ｏｒｉｇｉｎ　ｇｏｏｓｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ（ＭＤＧＰＶ　ＰＴ　ｓｔｒａｉｎ）ａｎｄ　Ｇｏｏｓｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ（ＧＰＶ　ＧＤ　ｓｔｒａｉｎ）ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｖｉｒｕｓ　ｃｒｏｓｓ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔｓ（ＮＴ）ａｎｄ　ｌａｔｅｘ　ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ（ＬＰＡＩ）．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｔｉｔｅｒａｎｄ　ＬＰＡＩ　ｔｉｔｅｒｓ　ｏｆ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ａｎｔｉｓｅｒｕｍ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｓｅｒｕｍ；Ｒ　ｖａｌｕｅｓ　ｏｆ　ＭＰＶｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ＭＤＧＰＶ　ａｎｄ　ＧＰＶ　ｗｅｒｅ　ｌｅｓｓ　ｔｈａｎ　０．１．Ｒ　ｖａｌｕｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＭＤＧＰＶ　ａｎｄ　ＧＰＶ　ｗａｓ　ｇｒｅａｔｅｒ　ｔｈａｎ０．２５．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＭＰＶ　ｈａｓ　ｌｏｗ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＧＰＶ　ａｎｄ　ＭＤＧＰＶ，ｗｈｉｃｈ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ　ａｒｅ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ｅｘｉｓｔｅｄ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＭＰＶ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｔｈｅｒ　ｔｗｏ，ａｎｄ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＧＰＶ　ａｎｄ　ＭＤＧＰＶｂｅｌｏｎｇ　ｔｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｕｂｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｓｅｒｏｔｙｐｅ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｍｕｓｃｏｖｙ　ｄｕｃｋ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ；ｍｕｓｃｏｖｙ　ｄｕｃｋ　ｏｒｉｇｉｎ　ｇｏｏｓｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ；ｇｏｏｓｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ；ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ 番鸭细小病毒病是１９８５年以来在我国番鸭群新出现的疫病，临床上主要发生于１～３周龄雏番鸭，以腹泻、软脚、喘气为特征，发病率为２７％～６２％，病死率为２２％～４３％，且病愈鸭大部分成为僵鸭［１－２］。

鹅细小病毒病是由鹅细小病毒引起，主要侵害３０日龄以内的雏鹅和雏番鸭，该病最早是由方定一［３］报道于１９５６年在我国江苏等养鹅地区发生，并很快蔓延到全国各养鹅地区，极少见番鸭发病，但自１９９７年以来在福建省莆田、福清等番鸭饲养区暴发番鸭小鹅瘟病，病鸭以腹泻、肠黏膜脱落形成栓塞为主要特征，发病率５０％～７０％、病死率４０％～６５％［４］，给番鸭养殖业造成重大经济损失。

番鸭细小病毒Ｍｕｓｃｏｖｙ　Ｄｕｃｋ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ＭＰＶ和鹅细小病毒Ｇｏｏｓｅ　ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ＧＰＶ均为细小病毒科细小病毒属的成员，病毒直径２０～２４ｎｍ，无囊膜、呈二十面体对称，基因组大小约５ｋｂ［５］。

虽然二者在大小、理化特性等方面很相似，但疫苗交叉保护差，致病性明显不同，ＭＰＶ仅见番鸭发病，而ＧＰＶ既可感福建农业学报２８（９）：８６９～８７１，２０１３Ｆｕｊｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ文章编号：１００８－０３８４（２０１３）０９－８６９－０３染鹅也可感染番鸭，近年来番鸭小鹅瘟的流行也逐渐增强。

因此，了解不同细小病毒之间的抗原性差异，对有效防控不同番鸭源细小病毒感染具有重要的理论和实际意义。

据此，本课题组应用微量交叉中和试验（ＮＴ）和胶乳凝集抑制试验（ＬＰＡＩ）比较番鸭细小病毒、鹅细小病毒和番鸭源鹅细小病毒之间的抗原相关性，现将结果报道如下。

１　材料与方法１．１　病毒株番鸭细小病毒Ｆ株（ＭＰＶ－Ｆ）和番鸭源鹅细小病毒ＰＴ株（ＭＤＧＰＶ－ＰＴ）均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所动物病毒研究室（本研究室）分离、鉴定并保存；鹅细小病毒ＧＤ株（ＧＰＶ－ＧＤ）购自中国兽药监察所，并由本研究室增殖后保存。

１．２　番鸭胚胎番鸭胚购自非疫区；病毒在番鸭胚上增殖。

１．３　阳性血清及乳胶试剂番鸭抗Ｆ、ＰＴ和ＧＤ高免血清（Ｆａｂ、ＰＴａｂ和ＧＤａｂ），单抗致敏胶乳（ＭＰＶ－ＭｃＡｂ和ＧＰＶ－ＭｃＡｂ）均由本研究室制备。

１．４　病毒培养分别将ＭＰＶ－Ｆ、ＭＤＧＰＶ－ＰＴ及ＧＰＶ－ＧＤ毒株经尿囊腔接种１２日龄番鸭胚，０．１ｍＬ·枚－１，３７℃孵育，每日观察２次至第１０ｄ，弃去２４ｈ内的死胚，胚胎濒死时置４℃冰箱４ｈ以上，收获尿囊液，－７０℃冻存。

１．５　病毒ＥＬＤ５０测定将病毒用Ｈａｎｋ′ｓ液作连续１０倍系列稀释，每个稀释度接种４枚１２日龄番鸭胚，０．１ｍＬ·枚－１，３７℃孵化，弃去２４ｈ内的死胚，每天照蛋２次，连续观察１０ｄ，按Ｋａｒｂｅｒ氏法计算ＥＬＤ５０。

１．６　胶乳凝集抑制试验（ＬＰＡＩ）按文献［６］进行，滴定病毒抗原效价后，在９６孔细胞培养板第１孔加入５０μＬ含４单位抗原，从第２孔开始每孔加入５０μＬ含２单位抗原，然后第１孔加入等量的被检血清，做倍比连续稀释后，培养板置３７℃水浴温箱中６０ｍｉｎ，每孔取出１０μＬ病毒－血清混合液与等量相应病毒所制备的单克隆抗体致敏聚苯乙烯胶乳充分混合后，３７℃水浴温箱静置ｌ０～１５ｍｉｎ即可观察结果。

试验设阳性血清、阴性血清对照、致敏胶乳对照、抗原对照和抗原加稀释液对照。

判定结果：１～３ｍｉｎ内出现粗大凝集块，液体澄清为“＋＋＋＋”；形成较大的凝集块，且液体澄清为“＋＋＋”；５０％胶乳凝集，颗粒明显，液体较澄清为“＋＋”；少量乳胶凝集，液体较混浊为“＋”；无凝集颗粒，液体呈均匀乳状为“－”。

以出现“－”为阳性，“＋”以上为阴性，出现“－”的最高血清稀释倍数的倒数为血清ＬＰＡＩ效价。

１．７　交叉中和抗体效价在番鸭胚中进行，采用固定病毒－稀释血清法。

将血清用Ｈａｎｋ′ｓ液做５倍系列稀释，取５－６～５－１稀释度的血清与等体积２００ＥＬＤ５０病毒液混合，置３７℃作用１ｈ后，把病毒－血清混合物接种于１２日龄番鸭胚，每枚０．１ｍＬ，每个稀释度接种４枚，置３７℃孵育，每日观察２次至第１０ｄ，弃去２４ｈ内的死胚，同时设病毒和正常鸭胚对照，按Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ氏法计算中和效价（ＰＤ５０）。

１．８　各病毒株之间抗原相关性判定按照文献［７］进行。

根据公式Ｒ＝ｒ１·ｒ槡２，计算各病毒株之间的相关性，其中，Ｒ＝两毒株间抗原性差异，ｒ１＝乙血清对甲病毒的抗体效价／甲血清对甲病毒的抗体效价，ｒ２＝甲血清对乙病毒的抗体效价／乙血清对乙病毒的抗体效价（抗体效价为中和、血凝抑制抗体效价）。

如果相关系数Ｒ大于０．８为同一血清型，０．２５到０．８之间为同一血清型不同亚型，小于０．２５为不同血清型。

Ｒ值越小，抗原性差异越大。

２　结果与分析２．１　病毒增殖和ＥＬＤ５０测定病毒分别接种番鸭胚后，死亡番鸭胚胎的病变相似，均于３～６ｄ内死亡，尿囊液透明清亮，绒毛尿囊膜增厚，胚体呈弥漫性充血，出血。

ＥＬＤ５０效价分别为ＭＰＶ－Ｆ株１０－５．５·（０．１ｍＬ）－１、ＭＤＧＰＶ－ＰＴ株１０－５．５·（０．１ｍＬ）－１及ＧＰＶ－ＧＤ株１０－５．０·（０．１ｍＬ）－１。

２．２　３株病毒抗原性分析２．２．１　ＬＰＡＩ效价测定结果　从表１可知，３株病毒与同源血清和异源血清在不同程度上均能被中和，且与同源血清的ＬＰＡＩ效价高于异源血清。

即抗ＭＰＶ高免血清（Ｆａｂ）对Ｆ株、ＰＴ株和ＧＤ株的ＬＰＡＩ分别为２９、２７和２６；抗ＭＤＧＰＶ高免血清（ＰＴａｂ）对ＰＴ株、Ｆ株和ＧＤ株的ＬＰＡＩ分别为２１０、２５和２９；抗ＧＰＶ高免血清（ＧＤａｂ）对ＧＤ株、Ｆ株和ＰＴ株的ＬＰＡＩ分别为２７、２３和２４。