分子实验15 蛋白质的抽提及裂解
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它在细胞内发挥着重要的功能。
由于蛋白质的复杂性和多样性，研究人员通常需要从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质。
蛋白质的分离纯化是生物化学和生物技术领域中非常重要的一项工作，它为我们深入研究蛋白质的结构和功能提供了必要的条件。
蛋白质的分离纯化可以通过多种不同的方法实现，这些方法包括离心法、凝胶过滤法、电泳法、层析法等。
在选择合适的方法时，研究人员需要考虑到蛋白质的特性以及实验的要求。
离心法是最常用的分离方法之一，在离心过程中，通过调整离心力和离心时间，可以实现不同密度的蛋白质的分层。
这种方法适用于分离大分子量的蛋白质。
凝胶过滤法是利用孔径不同的凝胶将蛋白质分离开来。
通常使用的凝胶有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，这些凝胶具有不同的孔径，可以根据蛋白质的分子量选择合适的凝胶进行分离。
电泳法是基于蛋白质的电荷和分子量差异而进行分离的方法。
最常用的电泳方法是SDS-PAGE电泳，通过使用SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行解性和蛋白质间的形成复合物，使得蛋白质在电泳过程中仅仅受到电场力的影响，从而实现蛋白质的分离。
层析法是一种利用物质在载体上的分配和吸附性质进行分离的方法。
常见的层析方法有凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等。
凝胶层析是通过利用载体颗粒的孔径进行分离，亲和层析是将特定配体固定在载体上，与目标蛋白质结合，从而实现分离，而离子交换层析是利用载体表面电荷与目标蛋白质的电荷相互作用进行分离。
在进行蛋白质的分离纯化时，需要注意以下几个关键步骤。
首先是样品制备，通常样品要经过细胞破碎、蛋白质提取等步骤，使得目标蛋白质从复杂的混合物中提取出来。
其次是样品的处理，包括去除杂质、调整蛋白质的溶液环境等。
然后是选择合适的分离方法，根据蛋白质的特性和实验要求来确定最适合的方法。
最后是纯化过程中的监测和分析，通过使用各种蛋白质分析方法，如SDS-PAGE、Western blot等，来确定目标蛋白质的纯化程度和鉴定其存在。
《分子生物学》实验指导(2015-2016)
《分子生物学》实验指导实验1 总DNA提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。
由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。
同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。
本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。
[实验目的]学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。
学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。
[实验原理]植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。
本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。
CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。
植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。
CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。
由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。
核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。
纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。
[实验器材]1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料[实验试剂]1、3×CTAB buffer（pH8.0）100mM Tris25mM EDTA1.5M NaCl3% CTAB2% β-巯基乙醇2、TE缓冲液（pH8.0）10mmol/L Tris·HCl1mmol/L EDTA3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）4、95％乙醇5、液氮[实验步骤]1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。
分子实验重点带答案
1. 质粒DNA的构型与电泳速率的关系？质粒DNA分子具有三种构型：共价闭合环状DNA（超螺旋）、开环DNA（OC 构型）和线性分子（L构型）。
在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。
在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。
其中跑在最前沿的是共价闭合DNA，其后依次是线性DNA和开环DNA,其原因是共价闭合的DNA其空间位阻最小，所以跑得最快。
而开环DNA空间位阻最大，所以跑得最慢。
2. 碱裂解法提取质粒DNA的原理以及三种溶液的作用？碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA 是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
（简明原理：碱裂解法是基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离目的的。
碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。
）溶液Ⅰ：溶解菌体，悬浮菌体细胞溶液Ⅱ：创造碱性环境，，裂解菌体细胞使质粒缓慢释放出来，同时使质粒DNA 和染色体DNA变性溶液Ⅲ：恢复中性环境，使变性质粒DNA复性，3. 感受态细胞制备过程应注意的问题；1 细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。
DH5?菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；2 所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3 经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4 化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；5 所使用的器皿必须干净。
软骨蛋白提取步骤
软骨蛋白提取步骤软骨蛋白提取是一种常用的实验方法，用于从软骨中提取蛋白质。
软骨是一种坚韧的结缔组织，主要由软骨细胞和软骨基质组成。
软骨蛋白是软骨基质中的主要成分，具有重要的生物学功能。
本文将详细介绍软骨蛋白提取的步骤及相关实验注意事项。
实验材料准备在进行软骨蛋白提取实验之前，需要准备以下实验材料：1.软骨样本：可以使用动物软骨（如小鼠、大鼠等）或人类软骨（如关节软骨、鼻软骨等）作为实验样本。
软骨样本应新鲜，保存在-80摄氏度的冰箱中。
2.细胞裂解缓冲液：根据实验需要选择合适的细胞裂解缓冲液，常用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液（PBS）、甘氨酸盐缓冲液（Tris-HCl）等。
3.细胞裂解酶：根据实验需要选择适合的细胞裂解酶，常用的酶有蛋白酶、核酸酶等。
4.蛋白质抽提试剂盒：根据实验需要选择适合的蛋白质抽提试剂盒，常用的试剂盒有RIPA缓冲液、细胞裂解液等。
5.离心管、离心机：用于离心样本以分离蛋白质。
6.电泳试剂：进行蛋白质分析时需要准备电泳试剂，包括凝胶、缓冲液、染色剂等。
实验步骤软骨蛋白提取的步骤主要包括软骨样本的处理、细胞裂解、蛋白质抽提和蛋白质分析等。
下面将详细介绍每个步骤的操作方法。
1.软骨样本的处理–将冰冻的软骨样本取出，放置在冰盒中解冻。
–使用去离子水或PBS缓冲液清洗软骨样本，去除表面的杂质。
–将软骨样本切割成小块，使其容易裂解和抽提蛋白质。
2.细胞裂解–将切割好的软骨样本置于细胞裂解缓冲液中，加入适量的细胞裂解酶。
–使用超声波仪器或研钵和研针进行细胞裂解，直至软骨样本完全裂解。
–将裂解后的混合液放置在冰上，以保持低温。
3.蛋白质抽提–使用离心机将裂解后的混合液进行离心，以去除细胞碎片和细胞核等固体颗粒。
–取出上清液，加入蛋白质抽提试剂盒中提供的试剂，按照试剂盒说明书进行蛋白质抽提。
–使用离心机将抽提后的蛋白质样品进行离心，以去除残留的固体颗粒。
4.蛋白质分析–取出蛋白质样品，使用比色法或Western blot等方法进行蛋白质浓度的测定。
现代分离技术实验报告
现代分离技术实验报告1. 引言现代生物分离技术是生物学研究和工业生产中至关重要的一部分。
它允许我们从复杂的混合物中提取和纯化目标物质，并为我们提供了研究和利用生物组分的有力工具。
本实验旨在介绍几种常见的现代分离技术的基本原理和应用，并通过实验操作加深我们对这些技术的理解。
2. 材料与方法2.1 材料- 细胞破碎液- 聚丙烯酰胺凝胶- 某种蛋白质混合物- DNA片段- 色谱柱- 电泳仪- 丙酮、甲醇等有机溶剂2.2 方法2.2.1 超速离心将细胞破碎液通过超速离心（10000 g，20分钟）进行初步分离。
2.2.2 凝胶电泳将蛋白质混合物用SDS-PAGE进行凝胶电泳分离，根据蛋白质大小和电荷的不同，使其在凝胶上形成明显的分离带。
2.2.3 透析将目标物质透析至所需缓冲溶液中，以去除其它杂质。
2.2.4 色谱层析使用色谱柱将目标物质与杂质进一步分离，根据目标物质的不同特性选择适当的层析介质。
2.2.5 挤压过滤使用滤器挤压过滤固体颗粒或大分子物质。
2.2.6 溶剂萃取应用不同的溶剂体系将需要分离的物质从混合物中分离出来。
3. 实验结果与讨论3.1 胶体分离结果通过超速离心后，样品分为两层，上层为液体，下层为沉淀。
沉淀层可能包含细胞碎片、酶、DNA等。
3.2 凝胶电泳结果经过凝胶电泳分离，观察到了不同大小和电荷的蛋白质在凝胶上的明显分离带。
该结果表明凝胶电泳可以有效分离目标蛋白质。
3.3 透析结果通过透析，将目标物质从混合物中进一步纯化，并去除其它杂质。
透析后观察到目标物质的纯度显著提高。
3.4 色谱层析结果在色谱柱中，目标物质在不同的物理和化学条件下与层析介质发生相互作用，实现与杂质的进一步分离。
观察到目标物质从柱上流出时的吸光度峰，表示分离效果较好。
3.5 挤压过滤结果通过挤压过滤，固体颗粒或大分子物质可以从溶液中有效地分离出来。
观察到过滤液变清澈，颗粒物质留在滤器上面。
3.6 溶剂萃取结果利用溶剂的特性和溶剂体系的选择，成功将目标物质从混合物中提取出来，并与其它溶质分离。
细胞组织裂解(提蛋白)方法
第一种方法蛋白匀浆缓冲液：50 mM Tris-HCl (pH7.5) 150 mM NaCl5 mM EDTA1 % NP-40 1 mM PMSF操作步骤直接用这个进行组织匀浆然后于10000 rpm 离心20分钟收集上清作SDS－PAGE电泳从染色的情况来看所得到的总蛋白纯度都不错条带比较清晰。
我是作的小鼠八种常规组织也包括肾脏在内。
将抽提好的蛋白分装后直接放在负八十保存。
上样大概3~8ul每孔都可以的具体看个人需要。
70v浓缩，150v分离第二种方法裂解液配方：尿素：8M CHAPS:4% DTT:65mM(现加）PMSF:1mM(现加）MiliQ 水操作步骤：取300mg样品在液氮环境下研磨，加入1ml裂解液混匀，室温静置1小时（实验证明改为匀浆更好，蛋白降解轻），15000g离心1小时，取上清测定蛋白质浓度。
在裂解液中加IPG buffer有两个作用:1,增强蛋白质的溶解性2,可以结合核酸,在沉淀的时候予以除去。
建议最好加，浓度从0.5-2%不等（这取决于您样品蛋白质的难溶程度）。
IPG buffer 是载体两性电解质，IPG buffer另外一个作用是促进蛋白质溶解的,所以IEF前一定要加，裂解液中没有IPG buffer可以么？（可以的，最后上胶条的时候可以再加）不过，我觉得液氮研磨以后，最好是粗离心一下，把一些结缔组织给离心掉（150g既可）然后再加裂解液。
裂解液加1ML应该没什么问题，主要取决你以后蛋白的浓度。
用这个方法最好经丙酮沉淀一次比较好）第三种方法建议最好加完裂解液后再用超声波破碎，我做肝脏蛋白提取时一般采取400W工作10秒，间歇10秒，次数15次，一次结束后大约30分钟再重复上述步骤一次（因为不同的样品用一根超声柱子，可能会导致污染，所以一定要用双蒸水冲洗干净，再用70%乙醇洗一下，再用水洗一次），另外样品超声时要置于冰浴中，以免产热做过的是用10ml蛋白裂解液来匀浆3克的组织，最终用考马斯亮兰染色法测得的蛋白浓度大概为30~50 ug/ul测595 OD值时，设定一个只用水的空白，把所有测得的值都减去这个空白。
蛋白质组学样品制备注意事项
蛋白组学样品制备常规流程及注意事项一、细胞, 组织裂解●Lysis buffer (SDT, RIPA…)： ThermoFisher提供了针对于各种样品的解缓冲液●Detergent: SDS, CHAPS, NP40… (破坏细胞膜，蛋白质变性）●Reducing agent: DTT… (打开二硫键，使得蛋白质结构更为开放，更易酶解)●Urea: 增加蛋白质的可溶性，适用于提取全蛋白二、蛋白质抽提三、样品蛋白质含量测定、还原烷基化还原烷基化原理: 蛋白质不能从PAGE胶里被抽提出，而肽段则可以被抽提出，打断蛋白质的二硫键，破坏蛋白质二级结构，是蛋白质结构松散，增加蛋白质酶切效率。
四、蛋白水平的预分级或蛋白质免疫沉淀五、蛋白质酶解i.胶内酶解 (In-gel digestion)●将考染后的SDS-PAGE切成小块●用100mM NH4HCO3/30%ACN 脱色●在胶内进行 DTT, IAA●在NH4HCO3溶液体系中加入酶，在胶内进行酶解●用60% ACN/0.1% TFA 从胶中抽提生成的肽段ii.FASP: Filter aided sample preparation●采用滤膜装置进行溶液置换（10K, 20K, 30K）●使用尿素可以更有效的除去溶液体系中的去垢剂（如SDS）●最后置换至NH4HCO3 or TEAB 溶液体系进行蛋白质酶切（pH 在8.0左右）●酶解完成后收集滤膜的流穿组分得到肽段原理: 蛋白质不能通过滤膜，而酶解生成的肽段则可以通过。
丙酮沉淀是另一种去除去垢剂的方法，从而可进行溶液内酶解。
iii.蛋白酶的选择：最为常用的蛋白酶: Trypsin（保持胰酶处于低温，并且保存在酸性环境中，以防止胰酶自身酶解）●特异的切断C端为Arg, Lys的肽键（若Arg, Lys后紧跟Proline, 酶切效率降低）●生成的肽段平均长度为9个氨基酸●胰酶酶解生成的肽段至少为2+价，易于离子化其他一些蛋白酶，酶切位点的特异性可在搜库软件中查找。
免疫共沉淀操作步骤
免疫共沉淀操作步骤免疫共沉淀（immunoprecipitation）是一种常用的实验技术，用于检测特定蛋白与其他分子的相互作用。
本文将介绍免疫共沉淀的操作步骤，包括前期准备、取样、免疫共沉淀、洗涤、洗脱和分析结果等。
一、前期准备1. 准备所需试剂：PBS缓冲液（含0.1%的Tween-20）、蛋白质抽提缓冲液（含有适当的蛋白酶抑制剂）、抗体（单克隆或多克隆抗体）、控制组织或细胞苗、蛋白质A/G磁珠等。
2.对样品进行处理：收集样品，如细胞或组织，并用蛋白质抽提缓冲液裂解细胞膜或组织。
3. 确定抗原-抗体反应的条件：进行Western blot或其他实验，确定抗体和目标蛋白的最佳工作浓度和最佳条件。
二、取样1.将裂解的细胞或组织样品通过离心等手段去除细胞碎片和残留的细胞核。
2.将上清液收集到新的离心管中，并测定样品的总蛋白浓度，以便后续计算抗体的用量。
3.根据总蛋白浓度将样品分成相等的小样本，并放入不同的离心管中。
三、免疫共沉淀1.将试验管中的抗体与适量的蛋白质A/G磁珠混合，孵育一段时间，使抗体与磁珠形成固定复合物。
2.将磁珠与固定复合物加入到每个含有样品的离心管中，混匀并在冰上孵育一段时间。
3.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液小心地转移至新的离心管中，以减少非特异性结合的背景。
4.用PBS缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除非特异性结合的蛋白质。
5.转移沉淀到新的离心管中，并用PBS缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除残留的非特异性结合蛋白质。
四、洗涤1.将磁珠与背景低的洗涤缓冲液混合，孵育一段时间，混匀后在冰上孵育。
2.将磁珠与洗涤缓冲液加入到每个含有沉淀的离心管中，混匀并在冰上孵育一段时间。
3.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液小心地转移至新的离心管中。
4.用洗涤缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除非特异性结合的蛋白质。
五、洗脱1.将洗涤缓冲液去除，加入适量的脱附缓冲液，孵育一段时间，混匀并在冰上孵育。
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蛋白质的抽提及裂解
细胞核蛋白的抽提
Activemotif 公司的试剂盒
5×蛋白质变性缓冲液10ml
1M Tris-HCl(pH6.8) 0.6ml
50%甘油5ml
10%SDS 2ml
2-巯基乙醇0.5ml
1%溴酚蓝1ml
去离子水0.9ml
可在4℃保存数周,或在-20℃保存数月。
二、操作步骤：
1．细胞用预冷的5ml PBS/Phosphatase Inhibitors缓冲液洗1次，再加3ml预冷的PBS/Phosphatase Inhibitors缓冲液，用细胞刮器将细胞刮下来，转入15ml离心管。
2．1500rpm，4℃离心5分钟，去上清。
3．加500ul预冷的1xHypotonic 缓冲液与细胞混匀，转入1.5ml 离心管，置冰上15分钟。
4．加25ul Detergent 缓冲液震荡10秒。
5．14000g, 4℃离心30秒，去上清。
6．加50ul 预冷的Complete Lysis缓冲液，混匀10秒，置冰上摇床乳化30分钟，150rpm.
7．震匀30 秒后，14000g, 4℃离心10分钟。
8．取上清转至PCR管，80ul/管，-80℃冻存或者每管加20ul 5X蛋白质变性缓冲液，混匀。
9．在PCR仪上99.9℃，变性10分钟，-80℃冻存。
组织核蛋白的抽提
二、操作步骤：
1.组织称重，准备干净的匀浆器置冰上预冷。
2.在1g的组织中，加3ml冰上预冷的1xHypotonic 缓冲液，加3ul 1M DTT，加3ul Detergent 缓冲液，混匀，把组织匀浆后转入15ml的离心管，置冰上15min.
3. 850g, 4℃离心10分钟,去上清。
4．1g的组织相当于150mm Plate(2X107细胞),加50 ul Detergent 缓冲液震荡10秒。
5.14000g, 4℃离心30秒，去上清（上清为胞浆蛋白）。
6.加100ul 预冷的Complete Lysis缓冲液，混匀10秒，置冰上摇床30分钟，
150rpm.
7.震匀30 秒后，14000g, 4℃离心10分钟。
8.取上清转至PCR管，80ul/管，-80℃冻存或者每管加20ul 5X蛋白质变性缓冲
液，混匀。
9.在PCR仪上99.9℃，变性10分钟，-80℃冻存。
新鲜皮肤组织、肌肉组织、胎盘组织中蛋白质的提取
材料准备：剪刀、镊子、皿、1XPBS、1.5ml离心管、PCR管、匀浆器
1、取新鲜的组织用PBS洗一次，在加有蛋白酶抑制剂的PBS中剪碎后，全部转
入匀浆器中匀浆。
2、取上清分装在1.5ml离心管中，14000g，4℃离心10分钟。
3、取上清转至PCR管，80ul/管，每管加20ul 5X蛋白质变性缓冲液，混匀。
4、在PCR仪上99.9℃，变性10分钟，-80℃冻存。
患者外周血、骨髓的蛋白质抽提和裂解
1、在新鲜的外周血、骨髓中加淋巴细胞分离液用离心的方法分离有核细胞。
2、在有核细胞中加5X蛋白质变性缓冲液，混匀。
3、在PCR仪上99.9℃，变性10分钟，-80℃冻存。