基于叶绿体DNA PCR-RFLP标记的东亚七筋菇分子系统发育地理学研究

在所有 35 种 PCR-RFLP 标记/酶组合中，共有 21 种酶组合(占 60％)能检测到多态性： 共检测到 96 条扩增片段，其中 36 条(占 37.5％)具有多态性。-3- Nhomakorabea
3.2 cpDNA PCR-RFLP 分子标记揭示的单倍型及其分布
七筋菇单倍型的统计结果显示(见表 4)，19 个居群共定义出 26 种 cpDNA 单倍型，除长 白山(CBS)、大亮子河(DLZH)、金猴岭(JHL)、丽江(LJ)、雾灵山(WLS)和寨科桥(ZKQ)外， 其余的居群仅具有一种单倍型，未检测到同一居群内不同个体间的 cpDNA 变异，说明单倍 型之间已出现了明显的地理分化。 大多数单倍型只存在于某一特定群体中， 少数单倍型存在 共享现象(如单倍型 H21 被居群 DLZH、HLH 和 MLZ、ZD 共享)。
表2 Table 2 引物名称 Name of 用于本研究的叶绿体 DNA 通用引物 cpDNA universal primers used in this research 引物序列 Primer sequence -2退火温度 Annealing 延伸时间 Elongation
primer 5’ -CGAAATCGGTAGACGCTACG-3’ 5’ -ATTTGAACTGGTGACACGAG-3’ 5’ -ACGGGAATTGAACCCGCGCA-3’ 5’ - CCGACTAGTTCCGGGTTCGA-3’ 5’ -GGTCGTGACCAAGAAACCAC-3’ 5’ - GGTTCGAATCCCTCTCTCTC-3’ 5’ -GATCTTGCTCGCGAGGGTAACGA-3’ 5’ -TTTGAACAGCATCGGTTAAACCTGT-3’ 5’ - TTTGTTCTACGTCTCCGAGC-3’ 5’ -GTCGAGGAACATGTACTAGG -3’ temperature time
表 3 5 个叶绿体基因组 PCR 标记的 PCR-RFLP 检测结果 Table 3 The PCR-RFLP results of five cpDNA PCR markers 名称 Hae Ⅲ HhaⅠ Hinf I Msp I Pst I Rsa I Taq I trnS-psbC 条带总 数 3 4 4 2 5 3 3 多态条 带数 0 1 2 1 5 2 2 trnL-trnF 条带总 数 2 1 4 4 2 3 5 多态条 带数 0 0 2 3 1 2 2 trnH-trnK 条带总 数 4 4 5 3 3 2 3 多态条 带数 1 3 1 1 0 1 1 rpl20-rps12 条带总 数 3 2 1 2 1 1 5 多态条 带数 1 0 0 0 0 0 2 rbcL-accD 条带总 数 1 1 2 2 1 3 2 多态条 带数 0 0 0 0 0 1 1
trnL-F trnH-K trnS-psbC rbcL-accD rpl20-rps12
55℃ 62℃ 62℃ 62℃ 55℃
3.0 min 2.0 min 2.0 min 2.0 min 2.0 min
2.2.3 限制性内切酶的筛选 本研究中选用 Hae Ⅲ、Hha 、Hinf、Msp 、Pst 、Rsa 、Taq 共 7 种限制性内切酶 对 PCR 扩增的 DNA 片段进行酶切。每 5 μ l PCR 产物用 5 U 酶酶切 3-4 h。酶解产物用含有 0.5% EB 的 2.0%的低熔点琼脂糖凝胶电泳检测，并在 Gel Doc 2000TM (Bio-Red) 凝胶成像 仪上观察、成像、记录。 2.2.4 谱带记录及数据处理 根据实验获得的图谱，将酶切产物每个条带视为 1 个位点，按条带有或无分别赋值，有 带记为 1，无带记为 0。根据 PCR 扩增产物的限制性内切酶酶谱，统计各引物/ 酶组合在东 亚七筋菇居群中检测到的位点总数、多态位点数及 cpDNA 单倍型数 (Haplotype) 。利用 NETWORK 4.5.0.0 软件(Fluxus Technology Ltd., 2007)构建东亚七筋菇 cpDNA 单倍型的网络 进化图。
2 材料与方法
1 本课题得到国家教育部博士点基金（20040697010）以及国家自然科学基金（30670129）资助 -1-

2.1 材料
本研究所用的材料均采集于 5-8 月，基本上覆盖七筋菇在中国的分布区，此外还包括日 本北海道的一个居群(详见表 1 和图 1)。本研究从每个居群中随机选取 4 个个体对东亚七筋 菇 cpDNA 的变异进行研究。

基于叶绿体 DNA PCR-RFLP 标记的东亚七筋菇分子 系统发育地理学研究
李欣，赵桂仿*
西北大学生命科学学院，陕西西安 （710069）
E-mail: frances_2004@
摘 要：东亚七筋菇(Clintonia udensis Trautv. et Mey.)隶属于百合科七筋菇属，为多年生森 林草本植物。七筋菇属包括五个种，其中四个种分布在北美，一个种分布在东亚，是典型的 东亚－北美间断分布。 东亚七筋菇被认为是该属中的原始类群， 其分布区内不同的细胞型共 存(2n=14 和 2n=28)，因此，研究其居群的分子系统发育地理学对于探讨七筋菇属的多倍体 起源及系统演化有重要意义。本研究采集了 19 个居群(其中 5 个四倍体居群)进行分子系统 发育地理学研究。我们采用叶绿体 DNA 分子标记探究东亚七筋菇种内的系统发育类型，研 究结果显示在所有 35 种 PCR-RFLP 标记/酶组合中， 共检测到 96 条扩增片段， 其中 36 条(占 37.5％)具有多态性。另外，我们在所有东亚七筋菇居群中共检测到 26 种单倍型，它们分属 3 个不同的分支。 研究结果表明，东亚七筋菇可能至少存在三个起源分化中心，在第四纪 气候环境的影响下， 东亚七筋菇随后向东北和西南两个方向迁移扩散， 最终形成了现今的分 布格局。 本研究拓展了可用于该种植物分子系统学研究的遗传信息， 为进一步探讨七筋菇属 植物的起源、演化提供科学依据。 关键词：东亚七筋菇，分子系统发育地理学，叶绿体 DNA，PCR-RFLP 中图分类号：Q943
1 引言
七筋菇属植物为多年生草本。全属共 5 种，其中 2 种(Clintonia uniflora (Schult.) Kunth 和 C. andrewsiana Torr.)分布于北美西部， 2 种(C. borealis (Ait.) Raf.和 C. umbellulata (Michx.) Morong)分布于北美东部，东亚只有 1 种(Clintonia udensis Trautv. et Mey.)，呈典型的东亚北美西部-北美东部间断分布。七筋菇属的染色体基数为 x = 7。其中二倍体植物仅存在于东 亚，是属中比较原始的类群，四倍体植物在东亚和北美两大陆均有分布[1, 2]。从细胞学角度 看，东亚七筋菇 C. udensis 具有两种倍性— — 二倍体(2n＝14)和四倍体(2n＝28)[3]，无论是二 倍体还是四倍体， 其染色体数目均非常稳定， 在同一居群内没有发现不同倍性个体的混生现 象，也没有发现非整倍体变异。Hayashil 等学者对七筋菇属植物叶绿体 DNA rbcL 和 matK 两个基因的序列进行测序分析，来探讨七筋菇属不同种间的亲缘系统关系，结果表明，五个 种形成了两个单源群，东亚的七筋菇单独组成一个单源群，北美四个种组成一个单源群。在 北美单源群中又可以分为东西两支[4]。根据细胞学、形态学、分子生物学数据资料，东亚七 筋菇应为七筋菇属中原始的植物类型，北美其它四种七筋菇为其衍生类型。因此，东亚七筋 菇的分子系统发育地理学研究对于探讨七筋菇属的多倍体起源、分化及系统演化有重要意 义。 本文采用 PCR-RFLP 技术，对 19 个七筋菇居群进行了系统发育地理学研究，根据七筋 菇植物单倍型的地理分布格局推测他们可能的起源演化及迁移路线， 同时， 探讨东亚七筋菇 多倍体的起源及扩散。
3 结果与分析
3.1 cpDNA PCR-RFLP 标记多态性
PCR-RFLP 标记已成功用于对很多种及种上分类单位 cpDNA 变异的研究[6, 7]。 东亚七筋 菇经上述五种引物扩增的片段长度在 700bp-2000bp 之间，未经酶解的 PCR 产物经琼脂糖凝 胶电泳分离后均未见长度变异。产物经限制性内切酶酶切的统计结果见表 3。
2.2 实验方法
2.2.1 植物基因组 DNA 提取 本实验采用了改良配方的 CTAB 法 [5] ，在温育之前先加入预处理液 ( 其中含 0.2 M Tris-HCl，0.05 M EDTA，0.25 M NaCl 以及 1％巯基乙醇)处理。 2.2.2 PCR 反应体系及扩增程序 PCR 扩增反应的总体积为 50 μ l， 经过优化后， 最终确定的 PCR 反应体系如下： 10× PCR buffer, 3 U Taq DNA 聚合酶, 0.2 μ M 引物，300 μ M dNTPs 以及 10-50 ng 模板 DNA，扩增 时加入 30 μ l 石蜡油，防止蒸发损失。扩增反应程序如下：94° C 预变性 6 min 30 sec，每循 环中 94° C 变性 1 min 10 sec， 按引物的退火温度退火 1 min， 72° C 延伸 2 min， 共 35 个循环， 完成最后一个循环后，再 72° C 延伸 10 min。cpDNA 通用引物的名称、序列、退火温度及延 伸时间见表 2。PCR 反应结束后，其扩增产物用含有 0.5% EB 的 1.2% 低熔点琼脂糖凝胶电 泳检测。如果检测出明亮的扩增条带，即可用于下一步的酶切及测序反应。
表 1 材料来源和采样数 Table 1 Localities and number of samples of C. udensis Trautv.et Mey. 种群 Populations 北海道(JAP(4x)) 大亮子河(DLZH(2x)) 长白山 (CBS(2x)) 老秃顶子 (LTDZ(2x)) 雾灵山 (WLS(2x)) 黑里河 (HLH(2x)) 太白山 (TBS(2x)) 佛坪 (FP(2x)) 化龙山 (HLS(2x)) 化龙山 (HLS(4x)) 寨科桥 (ZKQ(2x)) 木林子 (MLZ(4x)) 金猴岭 (JHL(2x)) 神农架 (SNJ(2x)) 玉龙雪山 (LJ(4x)) 中甸 (ZD(2x)) 峨眉山 (EMS(2x)) 九寨沟 (JZG(2x)) 西藏 (XZ(4x)) 产地 Locality 日本 黑龙江佳木斯 (小兴安岭南麓) 吉林抚松 辽宁桓仁 河北兴隆 内蒙古赤峰 陕西眉县 陕西佛坪 陕西化龙山北坡 陕西化龙山南坡 甘肃文县 湖北木林子 湖北神农架 湖北天生桥(老君山) 云南丽江 云南迪庆(属都岗湖) 四川乐山 四川九寨沟 西藏 采样数 Samples 16 19 10 20 18 20 14 5 15 20 16 16 20 6 15 20 5 6 5 经度 Longitude 141° 08' 129° 45' 128° 11' 124° 52' 117° 27' 118° 16' 107° 42' 107° 49' 109° 21' 108° 20' 104° 23' 110° 12' 110° 16' 110° 23' 100° 6' 99° 41' 103° 19' 103° 51' 95° 42' 纬度 Latitude 43° 04' 46° 47' 42° 07' 42° 20' 40° 35' 41° 27' 34° 02' 33° 41' 32° 00' 33° 21' 32° 51' 30° 02' 31° 26' 31° 47' 27° 00' 27° 48' 29° 31' 33° 04' 29° 49' 海拔 Altitude(m) 870 600 1298 866 1436 1553 2840 1250 2418 2300 2200 2085 2846 1166 3108 3705 2810 2970 3250