细胞工程实验-动物细胞传代培养
细胞工程名词解释
细胞工程名词解释名词解释动物细胞培养（animal cell culture）：是将来自动物体的某些器官或组织的细胞，在模拟体内生理条件下在体外进行培养，使之存活并生长。
原代培养(primary culture)：以直接取自生物体细胞、组织、或器官的培养。
传代培养（passage culture）：将原代培养的细胞继续转接培养的过程。
细胞的体外大量增殖是通过传代培养实现的。
细胞系(cell line)由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细胞为主，能在体外生存的不均一细胞群体,。
第一次传代培养后的细胞即为细胞系。
细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群叫细胞株(cell strain).接触抑制：动物细胞体外培养的方式之一，指由于细胞相互接触而抑制细胞运动性现象。
密度抑制：细胞接触汇合成片后，只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，但当细胞密度达到一定程度后，营养相对缺乏，代谢产物增多，发生抑制现象。
动物细胞大规模培养：指人工条件下高密度大量培养有用动物细胞生产珍贵药品的技术,是生物工业中大量增殖基因工程、融合或转化细胞所所不可缺少的培养技术。
传代细胞：二倍体细胞，具二倍染色体，具有贴壁和接触依赖性，有限增殖能力，无致瘤性转化细胞：是通过正常细胞转化而来到的分化不成熟、具有无限增殖能力的细胞株。
微载体：依赖贴壁生长的细胞可以附着在微珠的表面繁殖，载体携带细胞在容器中呈悬浮状进行大量培养。
半连续式培养（Semi-continuous culture）：在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间从中取出部分培养液或者细胞剩余的细胞作为种子，再用新的培养液补足到原有体积。
灌流式培养（Perfusion culture）：是把细胞和培养基一起加入生物反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分培养液取出，同时又连续不断地补充新的培养液。
干细胞：具有自我更新，高度增值，多向分化潜能的细胞群体胚胎干细胞：一种全能干细胞，是从着床前胚胎内细胞团经过体外分化抑制培养的一种全能干细胞系，可以分化为任何一种组织类型的细胞成体干细胞：成体组织内能够自我更新分化为一种或几种组织细胞的未成熟细胞可塑性：一种组织的成体干细胞向另一种组织的特化细胞分化的能力组织工程：利用生命科学，医学，工程学原理与技术，单独会是组合的利用生物材料，细胞因子实现组织修复再生的一门技术种子细胞：用于组织修复或是再生的细胞材料支架材料：替代细胞外基质使用的生物医学材料生长因子：细胞对外界环境产生的应答通过感知某种化学信号或刺激，并将之传递到细胞核中，调控基因的表达过程单抗：由一个只识别一种抗原决定簇的B细胞克隆产生的同源抗体胚胎工程：是指所有对胚胎进行认为的干预，使其环境因素，发育模式或局部组织功能，发生变化的综合技术胚胎移植：将一头良种母畜配种后形成的早期胚胎取出，移植到另一头同种的，生理状态相同的母畜生殖器官的相应部位，使之发育成为新的个体体外受精：将哺乳动物卵母细胞取出，在体外与精子结合受精的过程胚胎分割：将一个胚胎分割成1/2或1/4胚，移植后获得同卵双生或多生的后代胚胎融合：将两个或几个胚胎的部分或整体融合在一起，使之发育成一个胚胎，然后移植到受体母畜体内让其继续发育成一种嵌合体的技术试管婴儿：从母体中取出卵母细胞在体外进行体外受精，培养形成在其胚胎以后移植到子宫内，使之在子宫内着床，妊娠克隆动物：指不经过生殖细胞而直接采用体细胞的细胞核移植到去核的卵细胞中的方法，获得遗传性状与供核动物完全相同的后代胚胎核移植：将动物早期的胚胎细胞核或卵裂球通过人工操作，移植到去核卵细胞中，重组成新的胚胎并发育成与供体胚胎基因相同的后代的过程体细胞核移植：将动物体细胞经过抑制培养使其处于休眠状态，利用细胞融合技术将体细胞与去核的卵细胞融合重组成新胚胎。
细胞工程实验内容
细胞工程实验（生物技术大实验二）安排
一、实验内容：
实验一、杂交瘤抗体制备录像观看和培养基的配制
实验二、小鼠饲养层细胞和小鼠免疫脾细胞的制备
实验三、细胞原代培养：组织块法
实验四、免疫脾细胞与骨髓瘤细胞的融合技术
实验五、融合细胞的培养及的观察
实验六、动物细胞的传代
实验七、细胞的冻存和复苏
实验八、细胞活性的MTT法检测
实验九、原生质体的分离技术
实验十、原生质体的收集与纯化
实验十一、原生质体的培养与观察
实验十二、AO/EB双染荧光显微镜观察细胞凋亡
二、实验分组（见后）
三、各组做实验的时间安排
*注意：本实验是连续性的大实验，由于学生操作能力不同，每一小小组（2～3人）所用的时间不一样，因此所做实验在次序和时间上会有些变化，实验也会穿插进行。
要求学生在实验时间段里听从安排。
四、地点：10-404～406;10-407～409
第三、第四和第五大组分组及超净工作台安排
09生技(行)
6.28～
7.1（上午8点开始）
注意事项
1．每个大组再分5个小组，每小组的小组长负责实验工具的领取及用后干净归还。
2．超净工作台用完后收拾干净。
3．实验结果的观察时间另行通知。
4．实验结果观察结束后，把自己小组的培养瓶等洗干净归还。
动物细胞传代培养分析
动物细胞传代培养分析动物细胞的传代培养是用来研究和繁育动物细胞的技术，对于生物科学和医学研究具有重要意义。
传代培养可以使动物细胞在无限期内继续增殖，为各种研究提供了充足的细胞资源。
本文将介绍动物细胞传代培养的原理、方法和应用。
一、传代培养的原理动物细胞的传代培养是通过将初始细胞（初代细胞）在一定培养条件下生长和分裂，定期收获一部分细胞进行继代，从而使细胞持续增殖。
动物细胞的传代培养基于以下原理：1.细胞增殖：传代培养的基本原理是细胞自身的生长和分裂能力。
在适当的生长条件下，细胞会进入细胞周期，经过细胞分裂产生新的细胞。
2.分离和分散：细胞传代过程中需要经常将细胞进行分离和分散，避免细胞过度密集或形成细胞聚集。
细胞分散是为了保证细胞的生长和增殖。
3.培养基的调配：细胞传代需要提供适宜的培养基满足细胞增殖的需求。
培养基的配方要包含必需的营养物质、生长因子和维生素等。
二、传代培养的方法传代培养主要有以下几个步骤：1.准备培养基：根据需要的传代次数，准备足够的培养基。
培养基的配方可以根据具体的细胞类型和研究需要进行调整。
2.细胞解离：将细胞从培养皿或瓶子中收集，用细胞解离液将细胞分散为单细胞悬浮状态。
细胞解离的方法主要有酶消化法和机械分散法。
3.计数和接种：用细胞计数仪进行细胞数目计数，然后计算出相应的接种细胞数目。
将细胞接种到新的培养皿或瓶子中，使其适当分散。
4.培养和观察：将接种好的细胞置于恒温培养箱中，提供适宜的培养条件（温度、湿度、CO2浓度等）。
定期观察细胞的生长状态和形态特征。
5.细胞收获：根据细胞传代的周期和细胞增殖速率，定期收获适量的细胞用于下一次传代或其他实验。
三、传代培养的应用1.基因表达研究：传代培养可以用来研究细胞的基因表达和细胞信号通路。
通过诱导细胞分化、抗体染色和PCR等方法，可以分析细胞的转录水平和蛋白质表达。
2.细胞毒性和药物筛选：传代培养可以用于药物毒性评价和新药筛选。
动物细胞培养方法
动物细胞培养方法
动物细胞培养是一种常用的实验手段，广泛应用于细胞生物学、药物研发、生物医学研究等领域。
以下是一般性的动物细胞培养方法：
1.细胞系的选择：选择合适的动物细胞系是动物细胞培养的第一步。
细胞系的选择要考虑细胞类型、来源、生长特性和用途等因素。
2.细胞培养基的准备：准备适用于所选细胞系的培养基。
培养基包括基本培养基和补充物，如生长因子、抗生素等。
不同的细胞系需要不同的培养基。
3.细胞的解冻：从冷冻保存的细胞库中取出细胞，进行解冻。
解冻过程要尽可能快速，以减少细胞对冷冻损伤的敏感性。
4.细胞传代：当细胞达到一定的密度时，需要将其传代，以维持细胞的生长状态。
传代过程包括细胞的分离、计数和重新接种。
5.细胞培养条件的控制：控制培养条件，包括温度、湿度、CO2浓度等。
通常细胞培养箱会提供稳定的培养环境。
6.细胞的观察和检测：定期观察细胞的形态、生长状态，并进行必要的细胞检测，如细胞计数、细胞周期分析等。
7.防止细胞污染：严格遵循无菌操作规程，防止培养物受到细菌、真菌、支原体等的污染。
使用无菌操作室和经过无菌处理的实验器材。
8.制备细胞冻存物：定期制备细胞冻存物，以备将来使用。
冻存物的制备需要使用适当的冻存液和合适的冷冻保存温度。
9.特殊操作：针对具体实验需求，可能需要进行细胞转染、感染、药物处理等特殊操作。
在进行动物细胞培养时，实验者需具备丰富的培养经验和相关技能，同时需按照实验室的标准操作规程进行操作，以确保实验的准确
性和可重复性。
细胞传代培养实验步骤
细胞传代培养是生物学研究中常用的实验技术，用于保持细胞系的稳定性和活力。
以下是细胞传代培养的一般步骤：
培养基准备：准备适当的培养基，包括生长因子、营养物质和抗生素（如果需要）。
确保培养基的配制符合细胞系的特殊需求。
细胞检查：使用显微镜检查细胞的形态、数量和健康状态。
确保细胞处于适当的生长状态，没有受到感染或其他异常。
细胞收获：从之前的培养瓶中将细胞收获下来。
这通常涉及用胰酶等酶类来解离细胞，使其从培养瓶表面脱离。
细胞计数：使用血球计数板或自动细胞计数仪等工具，计算细胞的数量。
这有助于确定传代时应该用多少细胞。
传代操作：将收获的细胞按照既定的比例重新分配到新的培养瓶中。
传代的目的是dilution 细胞，以确保它们能够继续健康地生长。
培养新的细胞群：将传代后的细胞放入培养箱中，提供适当的环境条件（温度、湿度、CO2浓度等），促使细胞继续生长。
观察细胞生长：在培养过程中，通过定期使用显微镜观察细胞的形态和生长状态。
确保它们没有发生异常变化。
培养基更替：根据需要，定期更换培养基，以提供新的营养物质和保持适当的环境条件。
细胞冻存（可选）：如果需要，可以将一部分细胞冻存起来，以备将来的实验使用。
冻存细胞是为了防止细胞系的丧失或污染。
以上步骤是一般细胞传代培养的基本流程，具体操作可能会根据不同的细胞系、实验目的和实验室条件而有所调整。
在进行实验前，请确保你了解所使用细胞系的特性和培养条件。
细胞传代实验报告
细胞传代培养一.实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的应用打下基础。
二、原理从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。
细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。
细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。
所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、ph值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规X和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。
三、材料和试剂1、细胞：293细胞株2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基〔含10％小牛血清〕3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、电动枪，培养板，吸液枪，5ml玻璃吸管、酒精灯等四、操作步骤1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。
2、加入1~2ml 0.25％胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。
3、马上吸走胰酶液，再次加入2ml左右的胰酶，同样马上吸去，再加入几滴胰酶放入培养箱中消化几分钟4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，再按照观察的生长情况确定的传代比例传代5.根据确定的比例来取需要的量〔剩余的细胞拿来做细胞计数〕，加入4ml左右的培养液6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱7.收拾整理超净台附：消化液配制方法：称取2.5克胰酶蛋白酶，加入100ml10xpbs+纯水溶解到1l，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。
细胞传代培养的步骤
1.准备试剂和培养基：确保DMEM或其他基础培养基、胰酶、完全培养液（含
血清和必要的添加剂）以及PBS等试剂准备就绪。
2.观察细胞状态：在显微镜下检查细胞密度、生长状态和健康状况。
如果细胞
长满至80%~90%，且看起来健康、有活力，则可以进行传代。
3.消化细胞：向培养瓶中加入适量的胰酶溶液，使细胞被充分覆盖。
消化时间
根据细胞类型和培养条件有所不同，通常为1至3分钟。
4.终止消化：加入完全培养液终止消化过程。
这有助于将细胞从消化液中悬浮
起来。
5.离心处理细胞：将细胞悬液在1500至1000 rpm下离心，以收集细胞。
6.调整细胞悬液：弃去上清液，用新鲜培养液重悬细胞。
7.计数和接种细胞：使用细胞计数板对细胞进行计数，并根据所需密度调整细
胞悬液体积。
8.接种细胞：将细胞悬液加入新的培养瓶中，每个瓶中的细胞数量应适当，以
避免过密或过稀。
9.培养和观察：将培养瓶放入培养箱中，定期观察细胞生长和状态，确保它们
健康且生长良好。
细胞工程第二章：动物细胞培养实验前准备yhy
1．无菌操作区 （1）无菌操作室应划为三部分：更衣室、缓冲间、无菌
操作间。无菌操作间专用于无菌操作、细胞培养。其大小 要适当，且其顶部不宜过高（不超过2.5m）以保证紫外线 的有效灭菌效果；无菌操作间的空气消毒：紫外线灯产生 臭氧，并且室内温度及湿度均较高，不利工作人员健康； 要装备空气过滤功能恒温恒湿装置。 （2）净化工作台：操作简单，安装方便，占用空间小且 净化效果很好。一般细胞培养室使用的净化工作台主要有 两种：a)侧流式或称垂直式 b)外流式或称水平层流式。 2．孵育区 本区对无菌的要求虽不比无菌区严格，但仍需清洁无尘， 因此也应设置在干扰少而非来往穿行的区域。
动物细胞室实验制度与规范1：
6．实验室中的昂贵设备，未经许可，不得擅自开关。精 密仪器必须经过专门培训方能上机操作，并严格遵守操作 规程。
7．实验人员必须按规定的主要仪器参数进行操作，未经 许可，不得随意更改有关仪器设备的技术参数，仪器设备 出现故障或发生事故，应立即报告。
8．操作完成后，用1：1000的新洁尔敏溶液或75％酒精 擦台面。出门前注意关闭酒精灯、照明灯，超净台。
3．制备区 在该区主要进行培养液及有关培养用的液体等的制备。
4．储藏区 主要存放各类冰箱、干燥箱、液氮罐、无菌培养液、培养
瓶等，此环境也需要清洁无尘。
5．清洗和消毒灭菌区 清洁和消毒灭菌区应与其他区域分开，主要进行所有细胞
细胞工程 Cell Engineering
第二章 动物细胞培养
动物细胞培 养就是从动物有 机体中取出相关 的组织,将它分散 成单个细胞,然后, 放在适宜的培养 基中,让这些细胞 生长和增殖.
动物细胞培养技术的应用
蛋白质生物制品的生产 如病毒疫苗、干ห้องสมุดไป่ตู้素、单克隆抗体
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实验四动物细胞传代培养
一、实验目的
1.掌握消化法细胞传代培养的原理。
2.了解细胞传代培养所需专用设备、试剂。
3.学习细胞传代培养操作。
二、实验原理
动物细胞原代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，会进一步扩展汇合，覆盖整个培养瓶底，细胞会因生存空间不足或密度过大，发生接触抑制，并引起营养物质枯竭和代谢产物积累，发生细胞中毒，影响正常生长。
这时需要进行分离培养，细胞由原培养瓶按1：2或1：3稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代。
80%汇合或刚汇合细胞是理想的传代阶段。
消化法细胞传代培养，是用一定含量的胰蛋白酶来进行消化，使贴壁的单层细胞脱离下来，形成分散的细胞悬液，然后用新鲜的培养液进行稀释、分装和培养。
三、主要仪器与试剂
1.实验仪器：改良吸管、加样器、培养瓶（玻璃、塑料）、抽滤装置、超纯水器、倒置显微镜、二氧化碳培养箱
2.实验试剂及材料：PE液、0.25%胰蛋白酶液、MEM+10%小牛血清液、原代培养的小鼠腹腔巨噬细胞
四、实验步骤
1.用75%酒精消毒双手、工作台面、培养瓶、瓶盖、试管，并过火焰。
2. 从布袋中取出已消毒的吸管，插入加样器，过火焰后吸取2mlPE，于侧壁加入，轻摇后倒掉。
3.再加入5ml PE于侧壁，轻摇4-5min，于镜下观察，倒掉。
4.加入0.3ml 胰酶，扭紧瓶盖，观察，并轻拍。
5.大部分细胞脱壁后加入5mlMEM(含10%血清)，吹打形成细胞悬液。
6.将2ml细胞悬液移至玻璃培养瓶中，并取3ml MEM，加1ml MEM于玻璃培养瓶中，另外2mlMEM加入到塑料培养瓶中，过火焰，扭紧瓶塞。
7.在瓶壁上做标记。
8. 将传代好的培养瓶放置于37度二氧化碳培养箱中培养。
五、实验结果
细胞由刚传代好时的圆球型（游离期）→贴附（贴壁期）→伸展（铺展）→细胞扁平或呈梭型→繁殖
六、思考题
1.请结合实验体会简述细胞传代培养成功的标志和显微镜下观察到的现象。
（消化前后、游离期、贴壁期、指数生长期等不同时期细胞状态、培养液的清澈度、颜色、细胞界限等），并比较成功与不成功培养及其他培养状态的差别。
①传代培养成功的标志：
透明度大、细胞内颗粒少、没有空泡，胞膜清晰，胞液清晰透明，悬浮细胞碎片少，培养基澄清且颜色偏黄色，说明细胞生长状态良好且数量较多。
②显微镜下观察到的现象：
消化前：细胞长满培养瓶底，呈梭形，细胞紧密无间隙。
消化后：细胞质回缩，细胞间隙增大，细胞变圆，细胞从瓶壁脱落下来并悬浮和流动起来。
游离期：细胞间隙增大，细胞圆球形，细胞悬浮，培养液浑浊呈乳白色。
贴壁期：细胞扁平或梭型，透明度较好。
指数生长期：培养细胞数量明显增多，并逐渐汇合，细胞密度增大。
③成功与不成功培养及其他培养状态的差别：
成功培养状态：透明度大、细胞内颗粒少、没有空泡，胞膜清晰，胞液清晰透明，悬浮细胞碎片少，培养基澄清且颜色偏黄色。
不成功培养状态：胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒，细胞之间出现空隙，细胞形态不规则。
若被污染，当细胞刚污染时，会发现细胞形态不饱满，细胞反差变大，细胞质颗粒变多，细胞延展性差。
随着污染的加重，贴壁细胞脱落，培养基中杂质多，培养液很快变黄，且浑浊。