普通质粒载体与Semliki森林病毒复制子载体表达GHRH的比较
载体——精选推荐
载体基因⼯程的载体载体的特征：在寄主细胞中能够⾃主复制；有⼀种或多种限制酶的单⼀切割位点，并在此位点插⼊外源基因⽚段；在基因组中有遗传标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征；载体分⼦较⼩，以便体外基因操作；对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动⼦、增强⼦、加尾信号等基因表达元件；载体的类型质粒噬菌体其他载体(如:酵母⼈⼯染⾊体、细菌⼈⼯染⾊体、植物Ti质粒、动物病毒)质粒(plasmid): 多数情况下,质粒是存在于细菌染⾊体外的⼩的双链闭合环状DNA分⼦，能⾃主复制，并在细胞分裂时遗传给⼦代细胞并不是所有的质粒都是环状分⼦, 在多种细菌中都发现有线性质粒质粒⼴泛存在于原核⽣物中, 其⼤⼩从相对分⼦量⼩于1X106 到⼤于200X106质粒的形态1) cccDNA—双链闭合环状DNA2) ocDNA—开环DNA3) cDNA—线形DNA（L型）在DNA促旋酶（gyrase）作⽤下成负超螺旋构型, 在拓扑异构酶I的作⽤下解旋。
溴化⼄锭（ethidium bromide，EtBr）也有解旋作⽤溴化⼄锭插⼊DNA超螺旋的作⽤随着插⼊的溴化⼄锭数⽬增加,双螺旋解旋,导致超螺旋减少直⾄产⽣环状分⼦的开放形式. 进⼀步的插⼊在双螺旋中引⼊了过多的螺旋,导致反义的超螺旋(注意B和D处的螺旋⽅向). 为了清楚起见,只表⽰了双螺旋的⼀条单链质粒DNA的复制类型严紧型质粒这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。
所以，往往在⼀个细胞中只有⼀份或⼏份拷贝松弛型质粒这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果⽤⼀定的药物处理抑制寄主蛋⽩质的合成才会使质粒拷贝数增⾄⼏千份。
如较早的质粒pBR322即属于严紧型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更⾼拷贝数穿梭载体（shuttle vector) 可以在两种⽣物体内复制的载体分⼦质粒的命名规则⼩写字母p表⽰质粒（plasmid)p后⾯的两个⼤写字母表⽰发现或者构建该质粒的作者或者实验室名称数字表⽰编号例：pBR322、pET21、pGEM-T质粒的宿主范围质粒只编码少数⼏个其⾃⾝复制所需要的蛋⽩质,甚⾄在许多情况下只编码其中⼀个蛋⽩质所有其他复制所需的蛋⽩,包括DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶等都是由宿主细胞提供的质粒所编码的复制蛋⽩质定位在ori 附近，因此只有ori 周围的⼀⼩部分区域是复制所必需的因此，把质粒的其他部分删除掉，把外源序列加到质粒上，复制仍然可以继续进⾏质粒的宿主范围是由它的ori 决定的质粒的不相容性在没有选择压⼒的情况下，两种质粒不能共存于同⼀个宿主细胞内如果质粒拥有相同的复制调控机制，它们就不相容显性质粒和隐蔽质粒显性质粒(表达型质粒)----除了携带与本⾝复制和转移有关的基因外, 还携带⼀些其他的基因, 宿主细胞由于含有这样的质粒⽽呈现出新的性状, 这样的质粒称为显性质粒隐蔽质粒----⽆异常性状表现出来克隆载体例：pBR322、pUC18、pUC19、pGEM-T表达载体例：pET-21、pGEX质粒DNA的制备碱裂解法、煮沸法、层析柱过滤法碱裂解法原理：在⾼pH的碱性条件下，染⾊体DNA和蛋⽩质变性，质粒DNA由于其超螺旋共价闭合环状结构，尽管其DNA的⼤部分氢键也断裂，但是双链DNA仍然不会分离，当恢复到中性时，染⾊体DNA复性，并聚集形成不可溶的⽹架。
基因工程载体的基本结构
基因工程载体是基因工程技术的核心组成部分，其基本结构对于成功进行基因转移和表达至关重要。
这些载体通常是DNA分子，具有特定的结构和功能，以便在宿主细胞中稳定存在并传递目标基因。
基因工程载体的基本结构通常包括以下几个部分：
复制起点：这是载体DNA复制的起始点，确保载体能够在宿主细胞中自主复制。
复制起点通常是来自病毒或质粒的序列。
选择标记：选择标记是用于在宿主细胞中识别和选择已成功导入载体的细胞。
常见的选择标记包括抗生素抗性基因和营养缺陷型互补基因。
多克隆位点：多克隆位点是一段位于载体上的DNA序列，用于插入目标基因。
该位点通常包含多个限制性内切酶识别序列，以便将目标基因方便地插入到载体中。
启动子和终止子：启动子是用于控制目标基因在宿主细胞中的表达的DNA序列，而终止子则标志着基因表达的结束。
这些元件确保目标基因在宿主细胞中以预期的方式表达。
复制子和原核序列：这些序列允许载体在特定的宿主细胞（如细菌）中复制和维持。
原核序列还为载体提供稳定性，并确保其在细胞分裂过程中传递给后代细胞。
此外，基因工程载体的设计还需考虑一些重要因素，如载体的大小、拷贝数、稳定性和毒性等。
为了获得理想的基因转移和表达效果，科学家们需要仔细选择和构建合适的载体，以满足特定的实验需求和应用场景。
基因治疗中的基因传递载体比较与选择建议
基因治疗中的基因传递载体比较与选择建议基因治疗是一种新兴的治疗方法，通过向患者的细胞中引入正常的基因，以纠正产生疾病的异常基因。
在基因治疗过程中，选择适当的基因传递载体对于基因的有效传递至关重要。
在此，我将比较常用的基因传递载体，并提供选择建议。
基因传递载体是一种用于将治疗性基因传递给细胞的工具。
它们可以是病毒或非病毒载体。
常用的病毒载体包括腺相关病毒（AAV）、腺病毒、逆转录病毒等。
而非病毒载体则包括质粒、脂质体等。
首先，我们来比较病毒载体和非病毒载体。
病毒载体具有高效的基因传递能力和长期表达的优势。
特别是AAV，因其能够稳定地整合到宿主基因组中，被广泛研究和应用于基因治疗领域。
然而，病毒载体也存在一些潜在的危险性，如免疫响应、细胞毒性和有限的装载容量。
此外，病毒载体的制备过程繁琐、昂贵且时间长，限制了其在临床应用中的推广。
相比之下，非病毒载体相对安全，制备简单、成本低廉。
质粒是常见的非病毒载体，具有较大的载荷容量和可定制性。
但是，非病毒载体的基因传递效率和稳定性较差，且易被内生性核酸酶降解，进而降低了基因传递效果。
基于以上比较，我提出以下建议：1. 在选择基因传递载体时，要根据具体情况考虑病毒载体和非病毒载体的优缺点。
如果治疗需要长期稳定的基因表达，可以优先考虑病毒载体，特别是AAV。
如果治疗方案需要大容量基因载荷或较短期的基因表达，非病毒载体如质粒可以是一个合适的选择。
2. 在使用病毒载体时，需要注意选择对目标细胞类型有亲和力且少有免疫反应的病毒载体。
对于AAV来说，不同亚型对不同细胞类型有不同的亲和力，因此需要进行亚型选择。
3. 需要充分评估基因传递载体的安全性。
病毒载体的毒性和免疫原性是关键问题，因此需要进行严格的体外和体内实验，评估载体的安全性和免疫原性。
4. 在选择非病毒载体时，应考虑其基因载荷容量、转染效率和稳定性。
需要进行合适的质粒构建和优化，以提高基因传递效果。
5. 不同疾病可能需要不同的基因传递载体。
质粒载体种类
质粒载体种类
质粒载体是在基因工程中经常使用的一种工具，常见的质粒载体种类包括：
1. Shuttle质粒载体：能够在多个宿主生物中复制的质粒载体，通常用于在不同宿主中进行基因表达或基因转导的研究。
2. 表达质粒载体：用于将特定基因的DNA序列插入到质粒载
体中进行表达的载体，通常包括启动子、转录终止子和选择标记基因等。
3. 空质粒载体：通常只包含质粒的骨架结构，没有包含具体的基因，常用作对照实验的负对照。
4. 感受态质粒载体：这种质粒载体可与RNA或DNA片段融合，形成DNA-RNA复合体，通常用于RNA干扰实验。
5. 水平转移质粒载体：这种质粒载体能够在细菌中进行一种称为水平转移的传递，用于研究基因在不同细菌中的传播。
6. 呈味性质粒载体：这种质粒载体能够在菌落中形成代谢产物，在实验室中常用于菌落筛选。
以上是一些常见的质粒载体种类，不同种类的质粒载体在基因工程中扮演不同的角色，被用于不同的研究目的。
第三章-载体与宿主的选择ppt课件
载体应具备的条件
具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 具有较高的外源DNA的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有合适的筛选标记
2 质粒
2.1 质粒的定义
质粒（Plasmid）：细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子 ，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到 宿主染色体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的 ，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具。
2.6 重要的大肠杆菌质粒载体
2.6.
pSE2124
Pst I
C l a I pSC101
H in d III
松弛型复制
Pvu I
Bam H I
氯霉素可扩增
Pst I
Apr
Tcr Sal I
pBR322
拷贝数 50 - 100 / cell
4363 bp
用于基因克隆
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这 使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义
2.3 质粒DNA的分离纯化
实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：
噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工 程的有用载体，因为：
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增
3.1 大肠杆菌的 l 噬菌体
3.1.1 l 噬菌体的生物学特性： 生物结构
双螺旋共价闭合 环（SC构型）
开环双螺旋 （OC构型）
三种病毒表达系统的异同点
三种病毒表达系统的异同点⼀、病毒表达系统简介病毒载体是指以病毒为基础的载体，也是⽬前最常⽤的基因导⼊⽅式之⼀。
通过对病毒基因组的遗传改造，使之能够携带外源⽬的基因和相关的病毒元件，并被包装成病毒颗粒。
病毒进⽽侵染宿主，使携带的外源基因在宿主体内表达。
病毒的基因组可分为编码区和⾮编码区。
其中，编码区包含病毒的必需基因和⾮必需基因，可分别表达产⽣病毒的结构蛋⽩和⾮结构蛋⽩；⾮编码区则含有病毒复制和包装所需的全部顺式作⽤元件。
由于野⽣型病毒常常具有致病性，为了避免实验或治疗中使⽤的病毒恢复成野⽣型，必须对病毒载体进⾏⼀系列的遗传改造。
譬如删除病毒基因组的⾮必需区，将顺式作⽤元件和反式作⽤元件分开连接⾄不同的载体上，或结合利⽤不同种病毒的必需蛋⽩等，最⼤程度地保证实验的安全性。
哺乳动物病毒表达系统常常包含⼀到多个载体，将所需的载体转染包装细胞后，在反式因⼦的作⽤下，病毒复制、包装所需的顺式作⽤元件和外源基因表达盒即可被包装，最终产⽣带有外源基因的病毒颗粒。
经浓缩和纯化后的病毒液即可⽤于侵染⽬标宿主细胞或动物体，实现外源⽬的基因在宿主体内的表达。
⼆、病毒表达系统的优势病毒的转导效率⽐常规真核表达载体⾼很多，因此特别适合于介导外源基因在难转染甚⾄⽆法转染的哺乳动物细胞中表达。
三、辉骏⽣物病毒服务简介辉骏⽣物的病毒产品包括慢病毒、腺病毒和逆转录病毒，服务项⽬包括：各类病毒载体的构建和病毒包装，以及慢病毒介导的稳定表达株建⽴等。
慢病毒表达系统：⼀种很常⽤的哺乳动物病毒表达系统；慢病毒感染宿主细胞时，可将携带的外源基因随机、稳定地整合⼊宿主细胞基因组中，实现⽬的基因稳定、长期的表达，⾮常适合于基因过表达稳定细胞株的建⽴和RNAi研究。
图1 慢病毒感染宿主细胞原理图腺病毒表达系统：⼀种很常⽤的哺乳动物病毒表达系统；但与慢病毒不同的是，腺病毒基因组及其携带的外源基因不会整合⼊宿主细胞的基因组中，⽽是游离于宿主基因组外独⽴表达，因此可实现⽬的基因瞬时、⾼丰度的表达，同时还避免了因整合⽽引发的潜在的基因突变和随机效应，安全性和可控性⾼。
基因工程载体及其选用
载体的选择标准
宿主范围
根据外源基因的表达和克隆需求选择合适的宿主 范围。
选择性标记
选择具有合适选择性标记的载体，以便于筛选和 纯化。
复制能力
选择能够在宿主细胞内稳定复制的载体，以确保 外源基因的持久表达。
插入容量
考虑载体的插入容量，以确保能够容纳所需的外 源基因片段。
基因组。
基因治疗
人工染色体可插入正常基因，通过基因转移技术将 其导入病变细胞，以治疗遗传性疾病和恶性肿瘤等 疾病。
生物制药
人工染色体可用来克隆和表达药物相关基因，为生 物制药提供有效的工具。
05
基因工程载体的比较与选择
载体的比较因素
载体的基本结构与功能
01ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
02
03
04
质粒载体
通常由一个复制子、一个选择 性标记和一个多克隆位点组成 ，用于在细菌中克隆和表达基 因。
噬菌体载体
病毒载体
由噬菌体DNA和相关基因组成 ，用于将外源基因整合到宿主 细菌基因组中。
基于病毒DNA或RNA构建， 用于将外源基因导入细胞中进 行表达。
人工染色体
能在宿主细胞内稳定复制，并遗 传给下一代细胞的质粒，常用于 基因克隆和表达。
100%
表达型质粒
除了具有复制能力外，还能表达 出特定的蛋白质或性状，常用于 基因表达和蛋白质生产。
80%
穿梭质粒
一种既能复制也能整合到宿主细 胞染色体上的质粒，常用于基因 转移和基因治疗。
质粒载体的应用场景
基因克隆与表达
容量大小
不同载体能够容纳的DNA片段大小不同，选 择时应考虑外源基因的大小和复杂性。
基因治疗的三大类基因传递载体与基因传递效率评估
基因治疗的三大类基因传递载体与基因传递效率评估基因治疗是利用基因传递载体将修复或替代基因传递到患者的细胞中，以治疗遗传性疾病、癌症等难治性疾病的一种方法。
在基因治疗过程中，选择合适的基因传递载体和评估基因传递效率是非常重要的一步。
本文将介绍基因治疗中的三大类基因传递载体以及基因传递效率的评估方法。
第一类基因传递载体是病毒型载体。
病毒型载体可以将基因传递到目标细胞内，并整合到宿主基因组中，实现长期稳定的基因传递效果。
常用的病毒型载体包括腺病毒（Adenovirus）、逆转录病毒（Retrovirus）和腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）等。
这些病毒型载体具有高效率的基因传递能力，但也存在一些问题，比如免疫反应、随机插入等。
然而，病毒型载体在基因治疗中仍然是最常用的载体，因为它们可以针对不同类型的细胞和组织进行基因传递。
第二类基因传递载体是非病毒型载体。
非病毒型载体是指没有感染细胞的能力，通常可以通过物理或化学手段将基因传递到细胞中。
常见的非病毒型载体有质粒DNA、利用电穿孔或超声波破裂、脂质体等。
相比病毒型载体，非病毒型载体有许多优点，如安全性高、简易制备、规模化生产等。
然而，非病毒型载体的缺点是传递效率相对较低，对于某些细胞类型的基因传递效果较差。
第三类基因传递载体是基因编辑工具。
基因编辑工具一般用于精确修改基因，包括锌指核酸酶（Zinc Finger Nucleases，ZFNs）、类转录因子效应子（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）和CRISPR/Cas9等。
这些工具可以通过靶向特定的DNA序列来实现基因的精确修饰，比如基因敲除、插入和突变等。
基因编辑工具具有高效的基因传递能力和精确性，但也面临着安全性和伦理问题的挑战。
为了评估基因传递效率，科研人员通常会采用多种方法来确定基因传递的效果。
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农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2008,16(2):286~291*基金项目： 国家自然科学基金 （No.30270973， 30571335） 项目资助。
**通讯作者。
Author for correspondence.博士， 教授， 主要从事动物基因工程方面的研究。
Tel ： 02085285469;Email ： <zhangyl@>. 收稿日期：20070824 接受日期： 20071012 ·研究论文· 普通质粒载体与Semliki 森林病毒复制子载体表达 GHRH 的比较*任晓慧 2， 3 ，罗胡英 3 ， 刘松财 2 ，张明军 2 ，欧阳松应 4 ，张永亮 1，2** （1.华南农业大学动物科学学院， 广州 510642；2.吉林大学农学部畜牧兽医学院， 长春 130062；3.河北农业大学海洋学院， 秦皇岛 066003；4.中国协和医科大学，北京 100730） 摘要: 新一代 Semliki 森林病毒 RNA 复制子源自甲病毒属( )Semliki 森林病毒的基因组， 它克服了一些现有的质粒载体表达效率低的缺点。
研究首先对 pIRESneo 表达载体用 H 玉酶切和去磷酸化， 连接 基因，构建了普通真核 表达载体 pIRESneo ； 然后采用脂质体介导分别将含报道基因复制子载体 pCMVrep以及两个普通表达载体pLNCX和 pIRESneo 转染 293细胞； 将表达生长激素释放激素( )的复制子载体 pCMVRep和普通载体pIRES 和 pCDNA3转染 293细胞。
分别对不同载体转染细胞表达的茁 半乳糖苷酶以及利用RIA 和RTPCR对表达的进行了定量分析， 结果表明：复制子载体表达外源基因的效率比非复制子载体高 2～3倍。
关键词：生长激素释放激素；Semliki 森林病毒； RNA 复制子 中图分类号: S188 文献标识码:A文章编号: 10061304(2008)02028606Comparison of Conventional Plasmid Vector andderivedVectors in Expressing Growth Hormone Releasing Hormone ()REN Xiaohui 2,3 ,LUO HuYing 3 ,LIU Songcai 2 ,ZHANG Mingjun 2 ,OUYANG Songying 4,ZHANG Yongliang1,2** The elements for (SFV)RNA replicon,a kind of new generation vector,comes from thegenus.It was designed to overcome the poor efficacy of some current plasmid vector.Genes coding for viral replicases are reserved while genes coding for structure proteins are replaced by foreign gene in RNA replicon.High level replication of RNA and expression of foreign gene in cytoplasm are regulated by the replicases.To evaluate the effects of the SFV RNA replicon on the efficiency of gene expression, gene was inserted into pIRESneo which digested byH 玉and dephosphorylated by shrimp alkaline phosphatase,and pIRESneo vector was constructed.RNA replicon vector pCMVrep and two conventionalpromoterbasedvector (pLNCX and pIRESneo)were transfected by Lipofectin to prepared 293cells,respectively.RNA replicon vectorpCMVRep (Growth hormone releasing hormone)and two conventionalpromoterbased vector (pCDNA3.1(+)and pIRESneo)were transfected by Lipofectin to prepared 293cells,respectively,too.Results of quantitating for 茁galactosi dase expressed from transfected cells and quantitating forexpressed from transfected cells by RIA and RTPCR showed thatthe express level of RNA replicon vector was superior to ordinary vector and 2~3times higher than normal plasmid vector.This will provide a beneficial exploring to improve the efficiency of gene expression in eukaryoticcell.growth hormone releasing hormone(GHRH);;RNA replicon甲病毒 （ ） 属于披膜病毒科 （Togaviridae ）， 包括辛德毕斯病毒（ ，SINV ）、西 门利克森林病毒 （ ， SFV ）、 委内瑞拉马脑炎病毒（ ，第 2期 任晓慧等：普通质粒载体与 Semliki森林病毒复制子载体表达 GHRH的比较VEEV） 等 30个成员。
SFV复制子是基于 Semliki森 林病毒的真核表达载体， 包含病毒基因组 5'和 3'末 端的顺式作用序列、 全部非结构蛋白基因， 其病毒结 构蛋白基因被外源基因所取代。
质粒 DNA直接转 染细胞， 在 启动子控制下由细胞 RNA聚合酶域胞内转录成复制子 RNA， 再在复制酶控制下复制 RNA。
外源基因由亚基因组 mRNA启动子控制转录 成 mRNA， 并高水平表达 （Frolov .,1996）。
RNA 复制于细胞浆内， 排除了核的参与， 由于宿主细胞缺 乏内源性的反转录酶，不存在常规 DNA质粒的整 合宿主基因组的可能性， 因此与其它表达载体相比， SFV复制子表达系统具有宿主范围广，表达效率 高， 安全性好等优点。
此类载体已被广泛地应用于基 因治疗和分子生物学研究领域 （DiCiommo and Bremner1998;Leitner .,2000）。
生长激素释放激素（Growth hormone releasing hormone， GHRH） 是生长激素的正调控因子， 在畜牧 业和医学领域具有重要的应用价值。
但 GHRH在体 内的半衰期非常短，只有 10~20min。
张永亮等 （2000， 2003） 和白忠彬等 （2002） 对 基因进行 了改造， 人工合成了编码全长 186个碱基 （包括信号 肽） 的 基因， 并构建了 pcDNA3真核 表达载体， 实现了在 CHO细胞中的表达。
用基因转 染技术可以将 质粒导入动物体内表达， 具有 促进生长的作用。
为探索 SFV DNA新型载体用于 GHRH外源蛋白高效表达研究的可能性， 本研究对 RNA复制子载体和普通载体在细胞水平上的表达 进行了比较性研究，为寻求高效的基因表达系统以 提高动物生产性能提供有价值的实验资料。
1材料和方法1.1 材料293细胞和 pIRESneo载体 （Clontech） 为本室 保存； pIRESneo、 pCDNA3.1(+)和 pCMVRep为本课题组构建 （张永亮等, 1998；刘松财等,2006）； pCMVRep载体为 Wolfgang Leitner教授惠赠； pLNCX载体由军 事医学科学院军事兽医研究所扈荣良研究员惠赠； 茁 半乳糖苷酶检测系统 E2000， 美国 Promega公司 产品； 山羊抗人生长激素释放激素 （GHRH） 多克隆 抗体， Santa Cruz公司产品； FITC标记的兔抗山羊 IgG， 购自中杉金桥生物技术有限公司； GHRH神经 肽放免药盒购自第二军医大学神经生物学教研室； 15日龄昆明种小鼠由吉林大学医学部实验动物中 心提供。
1.2pIRESneo 载体的构建及各种质粒载 体的制备H玉酶切 pCMVrep， 凝胶回收片段； H玉酶切 pIRESneo后， SAP碱性磷酸酶 去磷酸化， 连接与电击转化， 构建 pIRESneo载体， 经酶切和测序鉴定。
常规 SDS碱裂解法对 3种 茁 半乳糖苷酶表达质粒（pCMVrep、 pLNCX和 pIRESneo）， 以及 3种 GHRH 表达质粒（pCDNA3.1(+)、 pIRESneo和 pCMVRep） 进行大量提取与纯化。