DL_苯丙氨酸的酶法拆分研究001
酶法拆分技术研究
酶法拆分技术研究作者：刘正威来源：《管理观察》2009年第13期摘要：生物酶法具有转化率及光学纯度高、成本低、反应条件温和、环境污染小等绿色工艺优点，随着生物技术的不断发展，酶法拆分越来越广泛应用于手性药物的制备中。
关键词：酶手性药物拆分法在有机药物合成及天然药物中，有许多具有手性碳或手性中心，因而具有光学异构体。
结构特异性药物是作用于受体、酶、蛋白质、离予通道等作用机制，在结构及电性效应上与这些物质互补，而产生激动或拮抗作用，表现出不同的生理效应。
因此，光学异构体往往在生物活性上具有较大的差异。
但目前临床应用的合成药物约有500多种为外消旋体，而单一对映体的疗效高、副作用低，服用的剂量小，更符合临床应用要求。
近几年手性药的年增长率已经超过20%，2005年全世界上市的新药中约有60%为具有手性的单一对映体药物。
因此，手性药物的开发已非常重要。
手性药物的制备可采用不对称合成方法、生物酶法或经化学合一成方法先制备药物的消旋体，然后再进行拆分而制得。
消旋体药物的拆分有多种方法，传统拆分方法是采用手性拆分剂与不同对映体一形成盐或复合物，根据其在溶剂中的不同溶解性进行分离，或采用物理方法进行诱导析晶分离得到有效的单旋体。
该方法具有拆分效，效率低，光学纯度差，另一单旋体需要消旋化后进行再拆分，操作繁琐，配套设备多、拆分剂及溶剂的消耗量较大，拆分成本较高。
近年来上市的手性药物不断增长，手性药物的制备和拆分技术也有较，大的发展，如液相酶法、固相酶法、不对称转换法、包结法等拆分技术，均较传统的拆分方法拆分效率高，且光学纯度好，拆分成本低，对环境友好。
酶是一种高活性、高特异性和高立体选择性的催化剂，可催化多种化学反应。
由于生物酶有很高的对映体选择性，利用生物酶作催化剂拆分手性药物，具有选择性定向、拆分效率高、光学纯度好的优点，可得到光学纯度很高的单对映体药物，这一方法优越。
酶法拆分有液相酶法和固相酶法两种，液相酶法是经微物发酵产生生物酶，直接利用其酶液进行拆分。
L-苯丙氨酸的生产(课堂PPT)
代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
❖ 3、葡萄糖一直是合成Phe的主要碳源，但随着 研究的深入，显现出很多弊端，如产生葡萄糖 效应和大量副产物乙酸，都会使细菌生长受到 抑制；而甘油价格低廉，容易获得，以甘油为 碳源进行微生物的生产将会成为一种趋势。 总之，虽然目前代谢工程技术在苯丙氨酸 菌种选育中的应用仍然存在许多不足之处，但 代谢工程确实为发酵法高产苯丙氨酸提供了巨 大的推动力，随着研究的深入，必然会为整个 苯丙氨酸产业的发展做出更大的贡献。
表：携带不同表达质粒的大肠杆菌的粗抽提物 的酶比活增减倍数
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
苯丙氨酸生物合成途径关 键基因的串联表达：
优化关键酶基因 pheA、aroF、 ppsA、 tktA的协同表达
pheA:编码分支酸变 位酶和预苯酸合成 酶。简写成A
aroF:编码DHAP合成 酶。简写成F
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
（2）增加PEP 的合成 磷酸烯醇丙酮酸合成酶(PpsA)和磷酸烯醇丙酮
酸羧激酶(PckA)是糖代谢中心途径中生成磷酸烯 醇丙酮酸(PEP)的2个关键酶,在大肠杆菌中分别由 ppsA和pckA基因编码.扩增ppsA,pckA基因，使这 两个基因单独表达或串联表达，都能提高PEP的合 成量，进而提高DAHP的合成量。
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代谢工程在L-苯丙氨酸的生产中的应用
aroG基因编码的3-脱氧-D-阿 拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶是 Phe合成途径中的关键酶之一, 受到苯丙氨酸的反馈抑制.为得 到解除苯丙氨酸反馈抑制的突 变AroG,分别以Escherichia coli (E.coli)野生型和突变型 aroG基因和Salmonella typhimnrium(S.typhimnrium) 野生型aroG基因为亲本,通过 DNA suffling技术对aroG进行 改组,获得的中,在含 有Phe类似物对氟苯丙氨酸(pFP)的培养基上筛选转化子,获 得4个解除Phe反馈抑制的克 隆..
L-苯丙氨酸
种子培养
斜面培养：LB培养基 斜面培养：LB培养基 种子培养基：蛋白胨1 氯化钠1 酵母粉0 种子培养基：蛋白胨1%;氯化钠1%;酵母粉0.5%;葡 萄糖2 萄糖2%;调pH=7.5;抗菌素Km(硫酸卡那霉素) pH=7 抗菌素Km(硫酸卡那霉素) 发酵培养基：Na2HPO4 12H 20g/L; 发酵培养基：Na2HPO4·12H2O20g/L;柠檬酸钠 6g/L; g/L; 谷 氨 酸 钠 0.4g/L; 酪 氨 酸 0.6g/L; 葡 萄 糖 g/L; g/L; 20g/L;Km40mg/L 20g/L;Km40mg/L 补料培养基：CaCL2 补料培养基： CaCL2·2H2O0.6g/L;酪氨酸 500mg/L;葡 g/L;酪氨酸500mg/L; 萄糖500g/L;MgSO4 萄糖500g/L;MgSO4·7H2O1g/L;VB1500mg/L;氨水28% g/L;VB1500mg/L;氨水28% 斜面培养→一级种子培养→二级种子培养→ 斜面培养→一级种子培养→二级种子培养→三级 种子培养→ 种子培养→发酵罐
L-苯丙氨酸在国内的生产状况
目前国内有10余家制药厂和试剂厂生产L 目前国内有10余家制药厂和试剂厂生产L- 苯丙氨 酸（见下表），但生产规模普遍偏小，产量极低， 见下表） 但生产规模普遍偏小，产量极低， 产品一般用于本厂生产药品和生化试剂， 产品一般用于本厂生产药品和生化试剂，不能满 足国内市场日益增长的需求。 足国内市场日益增长的需求。
提高Ｌ－苯丙氨酸产量的策略 提高Ｌ－苯丙氨酸产量的策略 Ｌ－
选育L 酪氨酸和L 选育L-酪氨酸和L-色氨酸营养缺陷型突变株 选育L 选育L- 苯丙氨酸 、 L-酪氨酸 ﹑ L-色氨酸抗性突 变株 敲除合成丙酮酸激酶基因来增加PEP的供应 敲除合成丙酮酸激酶基因来增加PEP的供应 扩增大肠杆菌中合成转酮醇酶（ 扩增大肠杆菌中合成转酮醇酶（磷酸戊糖途径中 合成E 的关键酶）的基因来增加E 合成E4P的关键酶）的基因来增加E4P的供应 降低副产物乙酸的生成 筛选抗噬菌体（BP筛选抗噬菌体（BP-1）的突变菌株
植物苯丙氨酸代谢相关酶基因启动子研究进展
植物 启动子 是重要 的顺式 作用元 件 ， 位于结 构基 因 ５ 端上 游 区 的 Ｄ 是 ’ ＮＡ 序 列 ， 能指 导 Ｒ 它 ＮＡ 聚合 酶与模板 的正确 结合 ， 是转 录调控 的中心 。研究苯 丙氨 酸代谢相 关酶基 因 的启 动子 ， 能从分 子机理 分析其
化苯 丙氨酸转 化为 肉桂酸 ， 促进 黄酮 、 豆素 等次生代 谢物 的生成 。Ｐ 香 ＡＬ只 存在 于植 物 和微生 物 中， 够 能 应 答伤 害 、 病原 菌 、 物激素 等多种 胁迫诱 导 。 植 ］
１ ２ 苯 丙氨 酸解氨 酶基 因启 动子研 究 ． （ ） 丙氨 酸解 氨酶基 因启动 子类 型 植物 Ｐ １苯 ＡＬ活性 的调控主要 在转 录水平进 行 ， 且受 到 Ｐ 并 ＡＬ启 动 子 的影 响 。现 已在 豌 豆 （ ｓｍ ａｉｕ ． “ 、 南 芥 （ ａ ｉ ｏ ｓ ）５、 芹 （ ｅｒｓｌ ｕ ｒｓ — Ｐｉ ｕ ｓｔ ｍ Ｌ ） ］ 拟 ｖ Ａｒｂｄ ｐ ｉ ｌ 欧 ｓ ｊ Ｐ ｔｏｅｉ ｍ ｃｉ ｎ ｐ ｕ 【、 ｍ）６ 白杨 木 （ ｏ ｕｕ ｉ ｏａ ｐ × Ｐ。 ｅｔｉｅ ） ３ 扁 豆 （ ｏｉｈ ｓ ａ ｌｂ Ｌ ） ］ 菜 豆 （ ｈ ｓｏｕ ｊ Ｐ ｐ ｌｓ ｒｃ ｃ ｒ ａ ｔ ｈ ｄ ｌ ｄ ｓ［ 、 ｏ ７ Ｄ ｌ ｏ ｂａ ． Ｅ 、 ｃ ｌ ８ Ｐ ａ ｅｌｓ ｖ ｌａ ｉ Ｌ ）９、 稻［ 麻 风树 （ ａｒ ｐ ａＣ Ｆａ ． Ｅ］ ｕｇ ｒｓ ． Ｌ 水 ］ １ 、 Ｊ ｔｏ ｈ Ｃ ＳＬ ）ｎ 等植物 中获得 苯丙氨 酸解氨 酶基 因的启动 子 ； Ｕ 通 过 ５ 端侧翼 区缺失实 验 ， 现启 动子 一些 特定 区域 和保 守 元件 对 Ｐ ’ 发 ＡＬ的 表达 水 平有 重 要 作用 。分 为 ４
DL-苯丙氨酸的合成和拆分
浙江人学坝Ｉ‘学位论殳
课题就是在这一背景下开展的。 单一手性化合物的获得方法有三种：１）手性源合成法：以手性物质为原料合
成其他手性化合物。这种方法是有机化学家最常用的方法。但是由于天然手性物 质的种类有限，要合成多种多样的目的产物会遇到很大困难，而且步骤繁多的合 成路线也使得最终产物成本十分高昂。２）不对称合成法：是在催化剂或酶的作 用下合成得到单一对映体化合物的方法。化学不对称合成和生物不对称合成近 ２０年来取得了长足进展，并且已丌始进入工业化生产。但是化学不对称合成高 旋光收率（如ｅｅ９０％以上）的反应仍然有限，所得产物的旋光纯度对于大多数实际 应用来说仍不够高。生物不对称合成具有很高的对映选择性，反应介质通常为缓 冲水溶液，反应条件温和，但对底物的要求高，反应慢，产物分离因难，因而在 应用上也受到…定的限制。３）＃ｂＮ旋体拆分法：是在手性助剂的作用下，将外消 旋体拆分为纯对映体，这种方法已被广‘泛使用。掘统计，大约有６５％的非天然 手性药物是由外消旋体或中Ｉｔ日Ｊ产物的拆分得到的【３】。
ＣＨ２ＣＨＣＯＯＨ
Ｉ
ＮＨ２
英文名：ｐｈｅｎｙｌａｎｉｎｅ，缩写为Ｐｈｅ 分子式：ＣｇＨｌｌＮ０２ 分子量：１６５ １９
苯丙氨酸为无色至白色片状晶体或结晶性粉末。有特殊气味和苦味。约在 ２７１—２７３℃熔化并分解。Ｌ－苯丙氨酸和Ｄ－苯丙氨酸的熔点为２８３—２８４℃（分解）。 １０％水溶液的ｐＨ值为５．４－６．０。在受热、光照、空气中稳定。与葡萄糖一起加热 则着色。碱性下不稳定。溶于水（３９／１００ｍｌ，２５＂Ｃ）。难溶于乙醇、稀无机酸和 碱性溶液。Ｌ－苯丙氨酸的旋光度为－３５。（Ｃ＝２，水），Ｄ一苯丙氨酸的旋光度为
ａｃｔｉｖｅ ｓａｌｔ ｗｉｔｈ Ｌ（＋）·ｔａｒｔａｒｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｍｅｔｈａｎ０１．Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｓａｌｔ ｒｅａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｑｕｅｏｕｓ
苯丙氨酸衍生物分子印迹聚合物的制备及手性拆分研究
性物质的化学及物理性质的极其相似， 决定其检测 和分离是化 学 工 作研 究 者 的难 题 。手 性 技 术 工 业 通 常采用 生物 酶拆 分 、 化学 拆 分 等方法 ，但 步骤 复 杂， 且适用 范围窄。近几年来， 分子 印迹技术为手 性 分子 的分离 提供 了一条 新颖 且有 效的途 径 ， 已 并 在 分离提纯 、 疫 分 析 等 领域 ， 示 出广 泛 的应 用 免 显 前景ｌ 。采用分子 印迹技术合成制备手性色谱 ｌ “Ｊ 固定相 ，因为 其 特 异选 择 性 和 产业 化 后 的 价 格低 廉等优点 ， 成为手性物质拆分研究 的热点。 分子印迹技术是 以待分离 、 检测的物质为模板 分子 ， 预定性地制备对其具有高度选择性的功能性 高分 子材料 。其 制 作 步骤 为 ： １以待 拆 分 的单 一 （） 对映体或其 它难分离 、 检测的分子为模 板， 与可聚 合的功能性单体 以共价键 或非共价键形成稳定的 配合物 ；２ 加入交联剂及引发剂 ， （） 合成刚性且 交联度高的聚合物 ；３ 用恰 当的溶剂洗脱除去高 （） 聚物 中的模 板分 子 ， 物 中留 下 了与模 板 分子空 聚合
作者简介 ： 李
一
萍 （９４一） 女 ， １７ ． 研究生
ｌ 一 ２
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第 ２ 卷第 ２期 １ ２０ 年 ３月 ０２
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第 ｆ２ ３月 ２ １ ２０卷第 ２期 ｉ 年
分析试验室
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苯丙氨酸定量检测试剂盒（酶法）说明书
苯丙氨酸定量检测试剂盒（酶法）说明书【产品名称】通用名称：英文名称：【包装规格】【预期用途】【检验原理】【主要组成成分】【储存条件及有效期】【适用机型】【样本要求】【检验方法】【参考值（参考范围）】【检验结果的解释】【检验方法的局限性】【产品性能指标】【注意事项】【参考文献】【生产企业】【医疗器械生产企业许可证编号】【医疗器械注册证书编号】【产品标准编号】【说明书批准及修改日期】【产品名称】通用名：苯丙氨酸定量检测试剂盒（酶法） 英文名称：Phenylalanine Kit （Enzyme ）【包装规格】96人份/盒 480人份/盒【预期用途】用于定量检测采集在S&S903# 滤纸上的新生儿全血样品中苯丙氨酸的浓度。
本试剂盒适用于新生儿苯丙酮尿症（PKU ）的筛查检测。
仅用于体外检测。
苯丙酮尿症（简称PKU ）是一种较常见的常染色体隐性遗传性氨基酸代谢病，发病率约1/10,000。
本病可因苯丙氨酸羟化酶缺乏引起，也可因辅酶因子BH 4缺陷引起。
这些缺陷致使苯丙氨酸不能被转化为酪氨酸，导致大量的苯丙氨酸及其代谢产物在体内堆积，引起中枢神经系统损害。
其临床主要表现为：发育迟缓，毛发、皮肤及虹膜变浅，癫痫，进行性智力低下等。
由于本病的早期发现早期治疗，对患儿的生长发育、智力发育不受影响，因此被我国列为新生儿疾病筛查项目之一。
检测方法还有细菌抑制法、荧光法等。
【检验原理】采用三氯醋酸（TCA）从干血片中萃取苯丙氨酸。
苯丙氨酸被苯丙氨酸脱氢酶转化成苯丙酮酸 。
这个反应伴随着反应混合物中存在的辅酶NAD+减少，生成NADH，这个氧化还原反应中把添加的四唑盐转化成橙黄色物质Formazane。
Formazane 的量与样本中苯丙氨酸的量成正比。
使用酶标仪检测其光密度值，即可换算成其对应的苯丙氨酸浓度值，酶标仪波长使用450nm。
【主要组成成分】名称96人份/盒 480人份/盒 包装酶稀释液（Triton X-100缓冲液） 11ml /瓶 55ml /瓶无色透明玻璃瓶或棕色玻璃瓶底物（四唑盐）11ml /瓶 55ml /瓶 中和液（碳酸盐缓冲液） 5.5ml /瓶 27.5m l/瓶 三氯醋酸溶液（3%） 17ml /瓶 85 m l/瓶 酶（冻干粉） 1瓶（冻干粉） 5瓶（冻干粉） 辅酶（冻干粉） 1瓶（冻干粉）5瓶（冻干粉）96孔微孔板2块 10块 铝箔袋 标准血片S1～S5 1.1、2.8、5.3、9.6、17.3mg/dl 1份 2份 无色透明塑料袋质控血片C1：2.2– 4.2 mg/dl C2：4.6– 8.6 mg/dl 1份2份说明书 1份 质量验证单1份注：标准品或质控品的浓度若有改变，将在试剂盒内放通知单，同时电话通知。
氨基酰化酶的固定化和苯丙氨酸消旋体的拆分
氨基酰化酶的固定化和苯丙氨酸消旋体的拆分
酰胺氨基酰化酶(Aminoacylase, AACase)，又称酰胺氨基脱水酶，是一
种有用的酶，用于离子交换层析（IEC），表面活性剂制备和药物改性
等方面。
AACase可用于酰胺肽、抗生素和非抗生素多种氨基酸的脱氢
和脱水，以及其他有机物的羧基氨基酰化作用，主要应用于制药工业。
一、酰胺氨基酰化酶的固定化：
1、依托微球的氨基酰化方法：小的硅酸盐粒子，具有良好的化学稳定性，可以通过酰胺氰基化术固定AACase。
2、电化学固定化：将AACase电沉积到不锈钢或其他金属电极上，从
而实现AACase稳定固定化，而不会降解或失活。
3、adsorption-free固定化技术：在这种技术中，AACase被定向活化，
然后通过Ca2＋极性结合固定框架，实现AACase固定化。
二、苯丙氨酸消旋体的拆分：
AACase还可以用于拆分对映化苯丙氨酸(L-Phenylalanine)消旋体。
传
统方法可实现100％的拆分消旋体，由于AACase的作用，消旋效率可
提高到98％，大大降低了投资和生产成本。
综上所述，酰胺氨基酰化酶是一种有效的酶，可用于制定各种有机及
非有机物质的酰胺氨基酰化，苯丙氨酸消旋体等，这些反应需要稳定、有效的固定化。
通过依托微球的氨基酰化、电沉积、活性定向固定三
种方法可以有效地实现AACase的固定化，有效拆分苯丙氨酸消旋体，使得酰胺氨基酰化反应效率更高，经济性更好。
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第 20 卷第 1 期 化学反应工程与工艺V o l 20, N o 12004 年 3 月Chem ical R eactio n Eng ineering and T echnolo gyM ar, 2004文章编号: 1001- 7631(2004)01- 0064- 06D L-苯丙氨酸的酶法拆分研究 何仕国 俞一军 许文松(浙江大学化学工程与生物工程系, 浙江 杭州 310027)摘要: 利用氨基酰化酶能立体专一地水解氨基酰化物的特点, 选择性地水解N -乙酰-L -苯丙氨酸得到 L -苯丙氨酸, 经分离后再水解N -乙酰-D-苯丙氨酸得到 D-苯丙氨酸。
研究中分别考察了 pH 值、温度、酶用量、底mol LpHw (酶)/w (底物)= 1∶41. 4, 加入浓度为 1×10- 3mol/L 的C o 2+ , 将 N -乙酰-D-苯丙氨酸用有机溶剂结晶和盐酸水解 10 h) 得到光学纯度 OP = 98. 8%的 L -苯丙氨酸, 收率 70. 3%; OP = 96%的 D-苯丙氨酸, 收率63%。
关键词: 苯丙氨酸; 氨基酰化酶; 拆分中图分类号: Q814文献标识码: A手性异构体(对映体)的存在是自然界的一种普遍现象,生命界中普遍存在的糖为 [1]D 型, 氨基酸为 L 型。
在医药化学领域中这一点尤为突出,已知药物中约有30%～40%是手性的 。
手性药物(chi-ral drug) 是指有药理活性作用的对映纯化合物。
苯丙氨酸又称 A-氨基-B-苯丙酸,L -苯丙氨酸是人和动物必需的氨基酸之一,还是合成抗病毒和抗癌药物及新型甜味剂的原料,D -苯丙氨酸能增强人体 的免疫功能, 具有出色的镇痛作用。
手性化合物D L -苯丙氨酸的拆分方法很多,其中主要有结晶法、手性试剂法、色谱法、膜分离法及酶拆分法。
酶促拆分法具有催化效率高、专一性强的特点, 而且拆分产物旋光度高、副产物少、产品较 易分离提纯。
特别是氨基酰化酶是较理想的适合拆分的酶,因为其造价低、不需昂贵的辅助因子、对有机溶剂耐受力强, 对氨基酸有较好的立体选择性。
木瓜蛋白酶和猪肾酰化酶都可对N-酰基-D L -氨基酸进行拆分, 但两者所起的作用是不同的。
木瓜蛋白酶促致的是N -酰基-L -氨基酸对芳香胺的酰化反应, 生成酰苯衍生物( 图 1); 猪肾酰化酶则 催化 N -酰基-L -氨基酸的水解反应, 生成 L -氨基酸( 图2) 。
这两种酶对N -酰基-D-氨基酸都没有作 用。
这是它们可对 D L -氨基酸进行拆解的根本原因。
从工业化的可能性来看,采用猪肾酰化酶拆分的方法更简便, 反应步骤少。
故决定采用猪肾酰化酶作为酶促拆分剂。
1 实验部分1. 1 实验材料及仪器猪肾酰化酶I:北京百灵威化学公司 A R; 乙酸酐: 无锡化学试剂厂 A R ; 三乙胺:上海试剂三厂A R ; 浓盐酸: 杭州瓶窑医药化工厂CP ( 36%～38%) ; 乙酸乙酯: 杭州双林化工厂A R ; 茚三酮:上海三 爱思试剂有限公司A R ( > 95% ) ; 氯化钴: 宁波市化学试剂厂A R。
WZZ-2A 型自动旋光仪, 上海精密科学仪器有限公司; PHS-2C 型精密酸度计, 上海精科雷磁;WRR 型熔点测定仪,上海物理光学研究所。
- 1[2] [2]第 1 期 何仕国等 . D L -苯丙氨酸的酶法拆分研究65图1 木瓜蛋白酶拆分 N -乙酰-DL -苯丙氨酸示意图图 2 猪肾酰化酶 I 拆分 N -乙酰-D L -苯丙氨酸示意图F ig 1 T he flow o f the Resolutio n o f N -acety lpheny lalanine by P apainFig 2 T he flo w of the Reso lution of N -acetylpheny lalane by A minoacy lase1. 2 分析方法比旋光度AD = A/ L ×c式中,A 为测得的旋光度;L 为样品试管长度,dm; c为浓度g / ( 100m L )。
光学纯度(opt ic purit y ) (OP )O P=A obs / A max ×100%实验中采用WZZ-2A 自动数显旋光仪测定旋光度,用WR R 型熔点测定仪测定熔点(mp ) 。
酶活测定方法: 25℃, pH7. 0, 1m in 催化1Lmo lN -乙酰-L -苯丙氨酸水解的猪肾酰化酶I 酶量定 义为 1 单位。
购买的纯酶比活为 290000LmolN-乙酰-L -苯丙氨酸/ h/mg 蛋白氮。
1. 3 实验步骤1. 3.1 DL-苯丙氨酸N-乙酰化实验1取16.5g (0. 1mol )DL -苯丙氨酸放入带有冷凝回流管、温度计和搅拌器的250m L 三口烧 瓶中, 将 10g ( 0. 25m ol)N aOH 溶于100m L 水中, 冷却后加到烧瓶中, 搅拌使苯丙氨酸完全溶解,再缓慢滴加乙酸酐13.3mL (0.14mol) ,控制反应温度在30℃以下。
加完后再搅拌约 3h,用茚三酮检测至无紫色出现, 即所有氨基酸都转变成乙酰基化合物 。
用浓盐酸调节 pH 至 2. 0, 冷却,有大量白色片状结晶析出,抽滤,干燥后得N -乙酰-D L -苯丙氨酸 20g , 收率为 96. 6% , mp 147～147.5℃。
1. 3. 2 酶法拆分( 猪肾酰化酶I )实验2～实验7将N -乙酰-D L -苯丙氨酸溶于水, 分别改变溶液的pH 值、反应体系的温度、酶用 量、底物和钴离子浓度, 得到含酶的溶液, 在恒温箱内 37℃下保温 24h, 然后将溶液取出加热10min, 使酶絮凝变性。
过滤除去变性的酶, 将滤液减压蒸馏, 控制温度在 40℃以下, 浓缩至50～100m L ,滴加100mL 无水乙醇, 冷藏过夜, 过滤,滤饼用无水乙醇洗涤2次, 将滤液再次浓缩, 重复上一次操作,得 到少量固体, 保存滤液。
合并2次所得经真空干燥的 L-苯丙氨酸。
详见表2。
1. 3.3 N-乙酰-D -苯丙氨酸的结晶和水解实验8 将实验6所得滤液减压浓缩至干,残渣用少量热水溶解,用 2.5m ol/ L 的硫酸调节pH 至[2]20[3]66化学反应工程与工艺 2004 年到微黄色结晶,过滤干燥。
再用乙酸乙酯溶解,加入干燥乙醚得白色结晶 20N -乙酰-D 20-苯丙氨酸8. 5g,[4]mp 167～169℃, A D= + 48.2°(c= 2,乙醇溶液)。
(文献值:mp 171℃, A D = + 51° (c= 2,乙醇溶液) )。
收率82.1%( 以原料 N -乙酰-DL -苯丙氨酸的 0. 5 倍摩尔量计) , 计算得光学纯度OP = 94.5%。
实验9将结晶得到的N -乙酰-D-苯丙氨酸8. 5g 溶于6m ol/L 的盐酸 150m L ,加热升温, 回流反 应 10h, 然后减压浓缩至固体析出, 再加 10mL 水, 再减压蒸馏至干。
所得固体溶于80℃水, 加入三乙胺调节pH至5.5(等电点) ,加入乙醇使之成为80%乙醇溶液, 有大量白色固体析出, 冷却至5℃以下 保温过夜, 过滤,滤饼用乙醇洗后真空干燥得白色粉末状固体 D -苯丙氨酸 5. 2g , mp279～282℃,A D = + 33. 6°, (c= 2,水溶液)( 文献值:mp 283～284℃, A D = + 35° ) ,O P= 96%, 收率为 63%(以起始原料N -乙酰-D L -苯丙氨酸的0. 5倍摩尔量计)。
2 实验结果及讨论2. 1 N-乙酰化反应N-乙酰化反应为亲电取代反应,芳胺氮原子的电子云密度愈高愈易被酰化,而对酰化剂来说,酰基碳原子所带部分正电荷密度越高越易起酰化作用。
一般常用的酰化剂有羧酸、羧酸酐、酰氯等,其活泼性的大小排列为羧酸< 羧酸酐< 酰氯。
用羧酸对苯丙氨酸酰化的反应速率很慢 。
另外还做了对比实验, 也使用乙酸酐为酰化剂, 分别就两条不同的合成 N-乙酰-D L -苯丙氨酸的路线进行了试验,从收率和最后得到的产物的熔点的分析来看, 两条路线都是切实可行的( 表 1)。
在乙酰化反应中, 终点的控制是采用氨基酸与茚三酮(ninhy drin)的显色反应。
表 1 DL-苯丙氨酸 N-乙酰化合成不同路线比较Table 1 The Diff erent Methods for the Synthesis of N-acetylphenylalanine实验序号 物料 收率, %熔点/℃1苯丙氨酸、乙酸、乙酸酐 78. 7147～148对比实验 1苯丙氨酸、NaOH 、乙酸酐 96. 6147～147.52. 2 pH值对酶法拆分的影响实验3 对此进行了一定的探索,从实验结果( 表2, 图3)可以看出 pH 值对酶促反应的影响很 大,当pH 值过高或过低时, 不但影响最终产品的收率, 还影响产品的纯度,所得产品的旋光度达不到要求,这可能是因为在过酸或过碱的条件下,酶活降低且旋光性物质有一定程度上的消旋。
比较适宜 的pH 值为7.0。
表 2 酶促拆分的影响因素考察Table 2 The Inf lucing Factors on the Resolution by Aminoacylase序号 氨酸量/gm ol ・L mol ・L -12 20. 7 50 7. 0 37 0. 1 0 24 98 66.7 3(a) 20. 7 50 5. 0 37 0. 1 0 24 86. 6 23. 0 3(b) 20.7 506.370.1 0 2498.3 48.5 3(c) 20. 7 50 8. 0 37 0. 1 0 24 82. 8 42.4 4(a) 20. 7 50 7. 0 20 0. 1 0 48 92. 3 30. 3 4(b) 20.7 507.300.1 0 2493.1 49.7 4(c) 20. 7 50 7. 0 42 0. 1 0 24 91. 4 19.4 5(a) 20. 7 50 7. 0 37 0. 05 0 24 98.6 50.9 5(b) 20. 7 507.37 0. 2 0 24 97. 4 64.2 6 20. 7 50 7. 0 37 0. 1 0. 001 24 98. 8 70.3 7(a) 20. 7 100 7. 0 37 0. 1 0. 001 24 97. 4 71.5 20 20[5] [6] 2+酶量/mgpH 温度/℃ 时间/h OP , % 收率, %第 1 期 何仕国等 . D L -苯丙氨酸的酶法拆分研究67Fi g图 3 pH 对光学纯度 OP 和得率 Y 的影响 3 T he Influence of pH on the OP a nd Y ield F ig 4 图 4 温度对光学纯度 O P 和得率 Y 的影响T he Influence o f T emper ature o n t he O P and Y ield2. 3 反应温度对酶法拆分的影响实验4 就温度的影响进行了一系列的试验,从表2和图4看出,较适宜的温度为37℃。