β地中海贫血基因检测怎么做
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法课件
35cycles
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
3.杂交 ：
15ml管 探针膜条（做好记号） A液 5-6ml DNA溶液（PCR产物）25ul
沸水浴10min
42℃杂交1.5小时以上
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
4.洗膜 ： 50ml塑料管
B液 40ml
42预热
取出膜条，置于 50ml塑料管中
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
⑵PCR的反应动力学： PCR的三个反应步骤反复进 行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩 增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的 拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循 环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际 反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序 列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐 积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入 线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种 效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的 种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数 情况下，平台期的到来是不可避免的。
β地中海贫血基因检测PCR-反向点杂交法
PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧 核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的天然 复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高 温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链 或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物 结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)： 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引 物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列 为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就 可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环 的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目 的基因扩增放大几百万倍。
β-地中海贫血基因检测(荧光PCR熔解曲线法20141013下午)
β-地中海贫血基因检测
（荧光PCR熔解曲线法）
β 地中海贫血是指β 链的合成受部分或完全 抑制的一组血红蛋白病。因本病多为点突变，故 常用荧光PCR熔解曲线法确定突变类型。我国各 民族的β 地贫基因突变情况有一定差异，南方汉 族的突变基因以CD41-42(-TCTT)、CDL7(A→T)、 IVS-Ⅱ-654(C→T)和TATAbox-28(A→G)为主，占 85%～90% 。
3min
40-80 ℃（0.4 ℃ /5s）升温
4.检查结果的判断 ：源自【原理】PCR技术原理
该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷 酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链 DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡 核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结 合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下， DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端， 并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合 成一条新的DNA互补链。而且这种新链又可成为 下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万 倍。
荧光PCR熔解曲线法原理 解链曲线（熔解曲线）： 在连续加热使DNA变性的过程中以温度对 DNA溶液的A260值作图，可得一条“S”形曲线， 称为解链曲线（熔解曲线） 。 解链温度（Tm）： DNA解链曲线中吸光度 值达到最大吸光度值的50% 时的温度称为解链温度， 也称为融解温度。此时DNA 分子中50%的双链被解开。
加入 5ul DNA溶液 反应液B管（做好记号）
人β地中海贫血基因分型检测的试剂及检测方法[发明专利]
![人β地中海贫血基因分型检测的试剂及检测方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/9587f58c783e0912a3162a93.png)
专利名称：人β地中海贫血基因分型检测的试剂及检测方法专利类型：发明专利
发明人：胡晓艳,钟宇萍,吴宇亮,李科铮
申请号：CN201811531566.1
申请日：20181214
公开号：CN111321211A
公开日：
20200623
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及基因检测技术领域，具体提供一种人β地中海贫血基因分型检测的试剂及检测方法。
该试剂包括：分别针对β、β、β、β、β、β基因位点的第一、第二、第三、第四、第五、第六对引物；第一、第二、第三、第四、第五、第六单位点探针。
本发明的试剂检测结合率高、通量大而且检测成本低。
申请人：北京大学深圳医院,深圳鼎新融合科技有限公司
地址：518000 广东省深圳市福田区莲花路1120号
国籍：CN
代理机构：深圳中一联合知识产权代理有限公司
代理人：张全文
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β地中海贫血基因检测反向点杂交法ppt课件
反向斑点杂交技术
反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等提 出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异 性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同 时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取 代固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测 一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异 性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原 体的检测等领域有其独特的优势。
反向斑点杂交技术原理
反向斑点杂交采用生物素标记的引物进行靶核酸的扩 增，将扩增产物同固定在尼龙膜上的探针进行杂交， 一次杂交反应可以检测多种靶序列。该方法具有快速、 简便，高灵敏度和特异性的特点，广泛应用于病原体 检测、基因突变检测、基因分型以及遗传多态性检测 等多个方面，具有潜在的临床应用价值。
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
βEM
31M
IVS-I-1M
43M
-32M -29M -30M 14-15M CAP
IntM
IVS-I-5M
杂交膜条
41-42N 654N -28N
71-72N 17N
βEN
31N
27/28M
41-42M 654M -28M 71-72M 17M
15min 10min 1min 30sec 30sec 7min
35cycles
反应条件按照试剂盒要求
影响PCR的因素见理论课内容
3.杂交 ：
15ml管 探针膜条（做好记号） A液 5-6ml DNA溶液（PCR产物）25ul
沸水浴10min
42℃杂交1.5小时以上
4.洗膜 ：
50ml塑料管
地中海贫血检测方法
地中海贫血检测的方法目前,用于地中海贫血检测的方法的代表性技术大体可分为以下两类:检测基因缺失突变的单管多重跨越断裂点PCR技术和多重连接探针扩增技术(MLPA);检测基因点突变的反向点杂交技术(RDB)、变性高效液相色谱技术(dHPLC)]和DNA序列分析技术等。
此外,最近发展的基于实时荧光PCR平台的新技术,如用于α地贫缺失拷贝数定量的实时荧光PCR直接检测技术、以及用于检测β地贫点突变的基于探针熔解曲线的基因分型技术(PMCA),可能是下一步更新换代的技术选择。
上述胛p PCR、RDB和MLPA等为地贫检测的主流技术。
1.Southern 印迹法优点：分析缺失型α-地中海贫血分子缺陷的可靠技术缺点：操作繁冗，不宜作为常规手段2.联合检测平均红细胞参数（MCV、MCH）+红细胞脆性检测+Hb（血红蛋白）电泳MCV：平均红细胞容积 MCH：平均红细胞血红蛋白量3.PCR-RDB法（PCR/寡核苷酸探针反向斑点杂交法）检测中国南方常见的17种β地贫突变：CD41～42(-TCCT)、IVS-2 nt654 C →T、-28 A→G、CD71～72（+A）、CD71～72（+T）、CD17 A→T、CD26 G→A、CD31（-C）、CD27～28（+C）、CD43 G→T、-32 C→A、-29 A→G、-30 T→C、CD14～15（+G）、CAP、Int及IVS-1 nt5 G→C4.α地中海贫血的基因诊断依据Gap-PCR原理采用单管四重PCR法（多重PCR技术）对其基因组DNA进行扩增，同时检测-α3.7、-α4.2、--SEA和正常对照4种等位基因型，采用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，通过片断大小判断患者的基因型。
5.采用PCR-RFLP方法检测非缺失型α地贫Hb Constant Spring(HbCS)。
β-地中海贫血基因检测(PCR-反向点杂交法)
pcr扩增
DNA提取
利用特定的试剂从血细胞中提取出DNA。
pcr扩增
使用聚合酶链式反应（PCR）技术对DNA进行扩增，使其数量增加，便于后续 的检测。反向点Fra bibliotek交制备探针
将目标基因序列设计成特定的探针，并固定在尼龙膜上。
杂交反应
将扩增后的DNA与固定在膜上的探针进行杂交，通过碱基互 补配对原则，将目标基因序列特异性地结合在膜上。
纳米技术
利用纳米材料和纳米技术提高检测的灵敏度和特异性，降 低检测误差。
要点二
基因组编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因组编辑技术，对β-地中海贫血基因 进行精确编辑和修复，从根本上治疗地中海贫血。
临床应用的拓展
早期筛查
将β-地中海贫血基因检测纳入新生儿筛查 计划，实现早期发现和干预，降低疾病对 患儿的影响。
β-地中海贫血基因检测(pcr反向点杂交法)
• β-地中海贫血基因检测介绍 • pcr-反向点杂交法介绍 • β-地中海贫血基因检测(pcr-反向点
杂交法)流程 • β-地中海贫血基因检测(pcr-反向点
杂交法)的临床意义
• β-地中海贫血基因检测(pcr-反向点 杂交法)的未来发展
01
β-地中海贫血基因检测介绍
03
耗时长：需要进行PCR扩增和杂交反应， 整个过程需要一定时间。
04
对实验条件要求高：需要严格控制实验条 件，避免交叉污染和假阳性结果。
03
β-地中海贫血基因检测(pcr-反 向点杂交法)流程
样本采集和处理
血液样本采集
从患者静脉抽取适量血液，用于 后续的基因检测。
样本处理
将采集的血液进行离心，分离出 血浆和血细胞，保留血细胞用于 后续的DNA提取。
遗传性β地中海贫血病CD17点突变的快速简便检测
遗传性β地中海贫血病ＣＤ17点突变的快速简便检测摘要：利用聚合酶延伸技术及双链特异性嵌入染料的特性，建立了一种快速简便的基因点突变的检测方法，在特定引物聚合过程中，不同基因型的聚合反应进程被实时转换为荧光信号，通过监测荧光信号的变化实现基因点突变的快速检测，不需要复杂的凝胶电泳、荧光和同位素标记等操作，通过对β珠蛋白基因CD17点突变的检测，证实该方法是一种廉价、简便、快速的筛查遗传性地中海贫血病β珠蛋白基因CD17点突变的方法，该方法可扩展到各种基因的点突变检测。
关键词：点突变；聚合酶；遗传性地中海贫血病；基因突变筛查β地中海贫血病(β地贫)是由于β珠蛋白基因的突变或缺失导致的构成血红蛋白HbA(α2β2)的卢珠蛋白肽链合成减少或不能合成，造成α与β肽链合成失衡所引起的一种常染色体隐性遗传病，若胎儿同时接受来自父母的两个β地贫基因，则为突变纯合子，绝大多数表现为重型β地贫疾病，目前尚无有效疗法，这些病人往往幼年夭折或靠输血维持生命，通过基因检测预防地贫患儿的出生是控制该遗传病的可行方法。
β-地贫基因常以点突变最为常见，β珠蛋白基因的CDl7(A→T)点突变是最早报道的与β地贫疾病相关的点突变之一，β地贫基因突变的传统检测方法是以凝胶电泳为基础的方法。
操作繁琐复杂，费时长，目前常用的诊断方法是聚合酶链反应结合斑点杂交技术，该方法准确性高，但需要放射性同位素标记和繁琐的分子杂交技术：Pun等报道了一种变性高效液相色谱基因分型新技术，无需放射性同位素标记，但这种方法操作复杂，仪器昂贵，实验周期长；新发展起来的实时荧光PCR技术已用于遗传性血色病HFE基因点突变检测，操作简便，但探针的设计难度和检测仪器成本较高，限制其广泛应用，利用双链结合染料嵌入双链DNA发出荧光的原理，我们建立了一种在常温下实时检测聚合酶活性的简便方法，本文在此基础上，基于聚合酶延伸技术和双链特异性嵌入染料特性，发展了一种快速简便的点突变实时检测方法，该方法通过染料的嵌入和荧光信号的变化实现点突变检测，不需昂贵仪器，也不需复杂的凝胶电泳操作和标记等过程，操作方便、简单，利用该方法，对β地贫疾病相关的CD17突变进行了检测，该方法为基因点突变及单核苷酸多态性的检测提供了一个快速简捷的有效方法，为药物筛选、疾病防治和单倍型计划提供一种新的手段和思路。
β-地中海贫血基因检测标准操作规程
某医院检验科作业指导书WORK INSTRUCTOR标题：β-地中海贫血基因检测标准操作规程β-地中海贫血基因检测标准操作规程1原理采用PCR 体外扩增和DNA 反向点杂交相结合的DNA 芯片技术：。
2器材2.1 试剂2.1.1 全血基因组提取试剂：深圳亚能全血DNA 快速提取试剂盒（25人份/盒）。
有效期：1年。
2.1.2 亚能β-地中海贫血基因诊断试剂盒（25人份/盒）。
主要组成： 储存条件：试剂盒Ⅰ保存在﹣18℃以下；试剂盒Ⅱ保存在2～8℃。
有效期：6个月。
2.1.3 自备试剂：2.1.3.1 20×SSC （pH 7.0）NaCl 175.3g 柠檬酸钠 88.2g加蒸馏水 750mL 溶解，用pH 计调pH 至7.0，最后定容至1000mL ，并高压灭菌保存。
试剂盒ⅠPCR 反应液 25管 23L试剂盒Ⅱ膜条 25张 POD 母液1管 75L TMB 1瓶 10mL 矿物油 1管 1mL 30％ H 2O 21管75L2.1.3.210% SDS（pH 7.0）SDS 20g加蒸馏水 180mL溶解，用pH计调pH至7.0，最后定容至200mL。
2.1.3.31M柠檬酸钠（pH 5.0）柠檬酸钠294g加蒸馏水 700mL溶解，用浓HCl调pH至5.0，最后定容至1000mL。
2.1.3.4A液（2×SSC，0.1%SDS， pH 7.4）20×SSC 100mL10% SDS 10mL加蒸馏水定容至1000mL2.1.3.5B液（0.5×SSC，0.1%SDS， pH 7.4）20×SSC 25mL10% SDS 10mL加蒸馏水定容至1000mL2.1.3.6C液（0.1M柠檬酸钠，pH 5.4）1M柠檬酸钠 100mL加蒸馏水定容至1000mL2.1.3.7显色液（新鲜配制使用，按顺序加入以下溶液）C液 19 mLTMB 1 mL30% H2O2 2μL2.2仪器某公司某型移液器某公司某型离心机某公司某型生物安全柜某公司某型PCR仪某公司某型水浴锅某公司某型分子杂交仪某公司某型水平摇床某公司某型扫描仪3操作规程3.1DNA提取3.1.1在1.5mL离心管中加入800L裂红液及100L抗凝全血，充分混匀，室温放置2～3min，8000rpm离心2分钟，弃去上清，小心保留管底沉淀。
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导语：地中海贫血是对我们的身体危害比较大一种疾病，一般比较轻的患者，症状不怎么明显，如果严重的话，有的时候，还会出现晕倒休克等一些不好的
地中海贫血是对我们的身体危害比较大一种疾病，一般比较轻的患者，症状不怎么明显，如果严重的话，有的时候，还会出现晕倒休克等一些不好的现象出现，有很多人认为地中海贫血会遗传，这样的疾病，不仅仅影响我们的身体健康，甚至还会影响我们的下一代的身体，那么应该怎么取检查呢？
地中海贫血相关的检查，可以做血红蛋白全套及地中海贫血基因检测，不需要空腹；但是如果根据您的病情，还需要做其他需要空腹检查的话，建议您还是空腹来检查。
如果女生这三个项目都低于正常值的话，即有90%的可能携带地贫基因；如果男士MCV和MCH都有降低的话而HGB没有降低，即有90%的可能是地贫基因的携带者.需要去医院做基因分析，约1000多元，就能明确知道自己的基因.积极行动，预防地贫，刻不容缓！x0d静止型α地中海贫血基因携带者和β地中海贫血基因携带者同健康人无异，轻型α地中海贫血和β地中海贫血仅有轻度贫血，常无明显的临床症状，在幼儿时期和孕期易误诊为缺铁性贫血，在做血液常规检查时β地中海贫血基因携带者、轻型α地中海贫血患者和轻型β地中海贫血患者会有异常的发现，他们均有平均红细胞体积(MCV)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCH)的下降，其中的β地中海贫血经血红蛋白A2测定可明确诊断，而α地中海贫血需经基因检查才能明确诊断.
静止型α地中海贫血基因携带者常无MCV和MCH的下降.α地中海贫血复合β地中海贫血后MCV、MCH值的变化会有所改变.因此建议血
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