黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钙的方法
高通量筛选葡萄糖酸钙高产菌株
米浆 1. 0 g，CaCO3 5. 0 g，琼脂 20. 0 g，pH 6. 5 ～ 7. 0。 培养基于 121℃ ，灭菌 20 min。
1. 3 主要与仪器
DHZ-D 大容量恒温振荡器，太仓市实验设备厂；
MJX-160C 型霉菌培养箱和 YXOQ-LS-75S11 立式蒸
汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂； SW-
葡萄糖酸及其盐类广泛应用于食品、医药、化工、 建筑等行业，其中葡萄糖酸钙是白色晶体或粉末，不 仅能够预防钙缺乏症，促进牙齿和骨骼发育，还可治 疗血钙含量过低引起的抽搐和镁中毒等疾病。作为 营养药物，葡萄糖酸钙具有易溶解和吸收的特性，静 脉注射或口服皆可，因此在临床中用途广泛［1 － 3］。
葡萄糖酸 钙 的 制 备 普 遍 采 用 生 物 发 酵 法［4］，一 般以黑曲霉作为生产菌种。葡萄糖酸钙用途广，市场 需求量大，筛选高产菌种是提高其产量的关键。高通 量筛选技术是 20 世纪 80 年代发展起来的目的菌种 选育的新技术，具有微型、高效和低成本等优点，已广 泛应用于菌种选育［5 － 7］。本文以经紫外线-LiCl 复合 诱变处理的黑曲霉为研究对象，建立高通量筛选葡萄 糖酸钙高产菌种的方法。
发酵培养基（ g / L） ： C6 H12 O6 ·H2 O 330. 0 g，CO （ NH2 ） 2 0. 1 g，KH2 PO40. 02 g，MgSO4 ·7H2 O 0. 2 g， 玉米浆 1. 0 g，CaCO3 38. 0 g，pH 6. 5 ～ 7. 0。
上述培养基均于 115℃ ，灭菌 30 min。
致死率 /%
=
对照菌落数 － 处理菌落数 对照菌落数
× 100
1. 4. 2 葡萄糖酸钙的测定方法
1. 4. 2. 1 酶标板分光光度法
定量核磁共振波谱法测定葡萄糖酸钙原料药的绝对含量
中国医药生物技术2020年2月第15卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2020, V ol. 15, No. 1 71 DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2020.01.014·技术与方法·定量核磁共振波谱法测定葡萄糖酸钙原料药的绝对含量李怡然，朱明慧，朱志玲，姚静，山广志葡萄糖酸钙作为临床常用药物，主要起降低毛细血管渗透性的作用。
适用于过敏性皮肤病，如荨麻疹、湿疹、皮肤瘙痒症、接触性皮炎等。
作为产后出血的辅助用药使用，能够减少心血管不良反应[1-3]，同时也是一种膳食补充剂，用于儿童、孕妇、老年人钙的补充[4]。
葡萄糖酸钙的制备方法有电解氧化法、溴化法、金属催化合成法、发酵法等。
发酵法因工艺稳定，成本低廉，被多数厂家应用。
发酵法是以黑曲霉为生产菌种，经菌种逐级培养，发酵代谢的酶将葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，再经碳酸钙中和精制而成[5]。
《中国药典》2015 年版采用EDTA 滴定法测定葡萄糖酸钙制剂中钙的含量[6]，对葡萄糖酸基仅采用鉴别反应进行考察，未对其含量进行控制。
有文献采用HPLC 法[7]或离子色谱法[8]测定葡萄糖酸钙的含量，但由于葡萄糖酸在水溶液中存在糖酸和内酯的转化，容易造成测量误差。
自1963 年qNMR 法[9]应用于定量分析以来，其应用范围日益广泛，各国药典均收载了该方法。
qNMR 技术的优势在于不需要对照品，仅以已知含量的核磁对照品作为内标，扫描待测物的共振峰面积直接计算H 的个数，对化合物进行绝对含量的测定[10]，适用于无对照品原料药的首次定量。
本文采用qNMR 技术，利用无水氘代溶剂，排除了水分和残留溶剂及其他无机物干扰，准确测定了葡萄糖酸钙原料的绝对含量。
1 材料与方法1.1 仪器与试剂Bruker Avance III HD 600 MHz 核磁共振波谱仪（BBO 探头）购自德国布鲁克公司；Mettler Toledo MS105 电子分析天平购自瑞士梅特勒-托利多公司；氘代DMSO（批号：PR-28072/07206DM1）购自美国Cambridge Isotope Laboratories 公司；葡萄糖酸钙（批号：LC80Q34）购自北京百灵威科技有限公司；顺丁烯二酸（批号：BCBM8127V，NMR对照品级，纯度：99.94%）购自美国Sigma-Aldrich 公司。
黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠分离纯化工艺
黑曲霉（Aspergillus niger）是一种常用的微生物菌株，可以利用其进行葡萄糖酸钠的发酵生产。
以下是黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠分离纯化工艺的简要流程：
1. 发酵生产：
黑曲霉通过代谢过程，将培养基中的碳源转化为葡萄糖酸钠。
发酵过程中需要控制发酵温度、pH值、氧气供应等因素，以提高产量和质量。
2. 分离：
将发酵液经过离心分离或压滤，将菌体和培养基分离。
分离后的发酵液中含有葡萄糖酸钠、杂质和其他副产物。
3. 过滤：
将分离后的发酵液通过滤器进行过滤，去除大颗粒的杂质，减少后续纯化步骤的负担。
4. 萃取：
使用适当的有机溶剂对过滤后的发酵液进行萃取，将其中的葡萄糖酸钠转移到有机层中。
将有机层与水层分离，得到含有葡萄糖酸钠的有机相。
5. 沉淀：
将有机相中的葡萄糖酸钠转化为钠盐沉淀，可以采用钠碳酸或氢氧化钠等化学物质进行反应。
沉淀后，对其进行过滤和洗涤，得到较为纯净的葡萄糖酸钠固体。
6. 干燥：
将葡萄糖酸钠固体在干燥器中进行干燥，去除其中的水分，得到最终产品。
以上是黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠分离纯化工艺的主要步骤。
在实际操作中，还需要对每个步骤进行具体的优化和控制，以提高产品的产量和质量。
葡萄糖氧化酶的发酵生产与发酵工艺的研究
２．２ 青霉菌发酵生产葡萄糖 氧化酶
工业化生产多采用黑曲霉， 其产酶水平较高。但青霉葡萄糖 氧化酶米氏常数小，反应速度 快，也引起人们较大的兴趣。
胡常英等人［６］以产葡萄糖氧 化酶的点青霉（ Ｐ ｅ ｎ ｉ ｃ ｉ ｌ ｌ ｉ ｕ ｍ ｎｏｔａｔｕｍ）．８３１２为出发菌株，经紫外 线诱变处理，初筛、复筛得到了 一株（Ｎｏ Ｔ１１１）高产葡萄糖氧化酶 的菌株，连续 １２次对其传代试验， 该突变株遗传性状稳定，摇瓶产 酶水平达到 ５５．７Ｕ／ｍＬ，比出发株 （３６．２Ｕ／ｍＬ）提高了５３．９％。发酵液未 检出青霉素的成份。该诱变株的 建立和对所产酶的研究，为促进 青霉葡萄糖氧化酶工业化生产， 提高酶的应用质量，降低生产成 本提供了科学依据。
葡萄糖氧化酶的发酵生产
与发酵工艺的研究
宫艳艳，徐学明
（江南大学食品学院，无锡 ２ １ ４ ０ ３ ６ ）
摘 要：葡萄糖氧化酶是酶应用技术领域中一种非常重要的酶，作为国 家允许使用的酶制剂之一，它在食品、医药、饲料等行业中得到了广泛应用。 该文简要介绍了葡萄糖氧化酶及两种菌种的葡萄糖氧化酶的发酵生产，对发 酵工艺的影响进行了探讨，并展望了其在食品工业上的应用前景。
切关系，导致了它在科研、医药
和食品工业生产上广泛的应用。
２０ 世纪初 Ｍａｘｉｍｏｕ 在黑曲霉
培养物中发现吸氧酶系统。１ ９ ２ ４
年Ｍａｌｌｉａｒｄ发现了葡萄糖酸。１９２８
年，Ｍｕｌｌｅｒ 用黑曲霉菌丝体压制
进行葡萄糖酸形成的酶学研究，
探明在葡萄糖存在时能消耗氧，
黑曲霉葡萄糖酸发酵的工艺控制方法
收稿日期 :2008 - 01 - 22 作者简介 :蔡皓 (1970 - ) ,男 ,湖北武汉人 ,硕士 ,讲师 ,主要从事微生物发酵及后提取的研究 ; 通讯联系人 : 李庆 ,博士 ,讲师 。E2
mail :liqing @mail. hzau. edu. cn 。
6 4
蔡 皓等 :黑曲霉葡萄糖酸发酵的工艺控制方法/ 2008 年第 6 期
ED TA 定钙法[4] :发酵过程中葡萄糖酸的生成导 致发酵液 p H 值下降 ,利用 Ca (O H) 2 及 CaCO3 与葡萄 糖酸中和来维持发酵 p H 值时 ,生成葡萄糖酸的钙盐 , 通过直接测定发酵液中钙离子的含量可折算得到生成 的葡萄糖酸浓度 ( W G) 。
WHale Waihona Puke G=cE×V V
E S
(2) 种子培养基 (g ·L - 1 ) :葡萄糖 (水解糖) 40 ,麸 皮 32 , ( N H4 ) 2 H PO4 01 4 , KH2 PO4 01 2 , MgSO4 · 7 H2 O 01 2 ,CaCO3 10 ,p H 值 51 6 。
(3) 发酵培养基 ( g ·L - 1 ) : 葡萄糖 (水解糖) 100 ～ 300 , ( N H4 ) 2 H PO4 01 4 , KH2 PO4 01 2 , MgSO4 · 7 H2 O 01 15 ,CaCO3 27～81 ,p H 值 51 6 。 11 11 3 主要仪器
21 1 葡萄糖含量的控制方式 葡萄糖在较高含量下 ,对许多微生物的生长和代
谢都有抑制作用 ,使菌体生长速率和产物生成速率处 于较低水平 ,发酵时间大大延长 。
图 1 10 L 发酵罐中不同发酵方式对发酵产酸的影响 Fig. 1 Effect of mode of fermentation on production of
酶解法制备葡萄糖酸钙
获得葡萄糖酸钙溶液
试验结果
吸光值 1.414 2.682 2.891 2.958 3.01
浓度 （%）
0.5
1
3
5
7
样品的吸光值为1.636，通过表中的数据整合出的 标准曲线得出葡萄糖的浓度为0.58%
试验过程及其产物照片
（2）糖化酶（EC 3.2.1.3）又 称葡萄糖淀粉酶，它作用于淀 粉时，从淀粉分子的非还原端 开始逐个地水解α -1,4糖苷键， 生成葡萄糖和一些低聚糖，且 糖化酶还有一定的水解α -1,6 糖苷键和α -1,3糖苷键的能力
试 验 原 理
葡萄糖氧化酶 4C6H12O6+3O2+2H2O 4C6H12O7+2H2O2 2C6H12O7+CaCO3 过氧化氢酶 Ca(C6H11O7)2+CO2+H2O
淀粉糊化
操作步骤
冷却至55-60℃ 加入糖化酶
调节 ph=4.5 于60-65℃ 恒温水浴 糖化3-4h
三，糖化
抽滤，得到透 明糖液
加入活性 炭，在 80℃搅拌 30min
测量葡萄糖含量
操作步骤
葡萄糖+CaCO3 (过 量) 加过氧化氢酶和 葡萄糖氧化酶
四，双酶氧化
反应结束，加 活性炭脱色 35℃搅拌反应，通过pH 判断反应进行的程度
（4）过氧化氢酶 2H2O2 2H2O+O2 （EC1.1.1.1.6） 它以过氧化氢作 （ 3 ）葡萄糖氧化酶（ EC 1.1.3.4 ）是 为专一的底物， 一种糖蛋白，它能够特异性的氧化 β - 催化过氧化氢分 D-葡萄糖生成中间产物D-葡萄糖酸- δ 解为水和氧气保 - 内酯和过氧化氢，并发生非酶促反应 护酶受到过氧化 水解为葡糖酸。 氢的毒害。
固定化酶法制备葡萄糖酸钙的研究
生产葡萄糖酸钙的方法有发酵法 、化学法和酶法 ，其 固定化酶），１０ ３ ２ ０％ Ｈ０ ，２ ２２ ８℃振荡反应４ ｎ ｍｉ，
中发 酵 法 使 用 较 为 普 遍 ，但 是 生 产 成 本 较 高 ，纯 化 工 Ｊ ６ ０ｇ ３ ０ Ｌ ８％ Ｈ Ｓ ４ Ｈ ２Ｏ 终止反应 （ 照管先） Ｈ Ｓ ４ 对 Ｊ ２Ｏ 溶 Ｈ
ａ ｍｐ ｏ ｅ ｎ ｉ ｒ ｖ ｄＡＢＴ ａ ｉａ ａ ｉｎ ｄ ｃ ｌ ｒ ａｉ ｎ ａ ｓ ｙ Ｊ． ｒ ｅ Ｓ ｒ ｄ ｃ ｌｃ ｔ ｅ ｏ ｏ ｉ ｔ ｓ ａ ［］ Ｆ ｅ ｏ ｚ ｏ Ｒ ｄｃ ｏ Ｍｅ ， ９ ９ ２ （ —Ｏ ： ２ １ １ ３ ． ａ ｉ Ｂｉｌ ｄ １ ９ ， ６９ １ ） １ ３ — ２ ７
力 、清 除ＡＢＴ 由基 能 力 以及 油 脂 抗 氧 化 试 验 其 中 Ｓ自
品 科 学 ，２ ０ ，２ （ １ ： ８ 培６ ０８ ９ １） ４
筛 选 效 果 较 好 的 段 。结 果 表 明 白芍 提 取 物 的 不 同极 性 段 物 质 均 具 有 抗 氧 化 活 性 ， 其 中 乙酸 乙 酯 极 性 段 物 质
其次为氯仿段 、正丁醇段 ， 水段和石油醚 段表现 出的 抗动植物油脂氧化 能力。
抗 氧 化 能力 相 似 ，最 弱 。
４ 讨 论
参 考 文 献
［］ 苏 玮 ，郭 群 ． １ 白芍 的现 代 药 理 研 究 概 况 ［Ｊ中 医 药 信 息 ， １９ ， Ｊ＿ ９ ６
１ （０ ３ ０ ４） ： ９ ｌ ． 一 １
ｏ ｉａ ｅ （ ｘ ｄ ｓ ＧＯＤ）ａ ｄ ｃ ｔｌｓ ｎ ａａａ ｅ（Ｃ ）ｗｅｅ ｃ ｖ ｌｎ ｌ ｍｍｏ ｉ ｚ ｄ ｏ ｌｔｒ ｌｅ ｙ ｅｐ ｅｒ ａｅ ｈｔ ｓｎ Ｔ ｅ ＡＴ ｒ ｏ ａｅ ｔ ｉ ｙ ｂ ｌ ｅ ｎ ｇｕ ａａｄ ｈ ｄ — ｒｔｅ ｔｄ ｃ ｉ ａ ． ｈ ｉ ｏ
高产葡萄糖酸黑曲霉菌株的诱变选育
高产葡萄糖酸黑曲霉菌株的诱变选育作者：白长胜，孟维珊来源：《现代畜牧科技》 2018年第8期摘要：以一株产葡萄糖酸的黑曲霉为出发菌株，对其进行紫外线诱变处理，筛选得到一株产葡萄糖酸较高的菌株，产酸力比原始菌株提高了1. 16倍，经连续传代7代，产酸性能未出现较大的差异，具有较好的遗传稳定性。
关键词：黑曲霉；葡萄糖酸；紫外线诱变；产酸能力中图分类号：TQ9 21.2文献标识码：A文章编号：2095-9737(2018)08-0001-02Mutagenic breeding of yielding highly gluconic acid Aspergillus niger strainBai Changsheng,Meng Weishan(Institute of animal husbandry of Heilongjiang,Qiqihar, Heilongjiang161005 ,China)Abstract:The Gluconic acid production capacity of Aspergillus niger YS was done original fungus,after UV mutagenetic treat ment,a high- yielding mutant strain was obtained from a lot of mutants. The acid productivity of the mutantstrain was l.16times than the original strain. The mutant strain has stable acid production after subculture 7 times.Key words: Aspergillus niger; gluconic acid; UV mutation; acid productivity葡萄糖酸及其衍生物（如葡萄糖酸盐、葡萄糖酸δ-内酯）作为蓬松剂、凝固剂、鳌合剂、酸味剂而广泛应用于食品、化工、水处理、建材和医药等行业。