茶树抗逆相关基因ERF的克隆与表达特性分析
茶树WRKY基因家族鉴定及功能分析
功能作用的比较
根据已有研究，WRKY基因主要参与 植物的抗病、抗逆、生长和发育等多 种生理过程。通过对茶树和其他植物 WRKY基因的功能分析，发现这些基 因也参与了类似的生理过程，但具体 作用机制还需要进一步研究。
04
茶树WRKY基因家族的遗 传进化分析
茶树WRKY基因家族与其他植物WRKY基因的遗传进化
关系分析
要点一
要点二
多物种WRKY基因家族的比较 基因组学分析
通过比较基因组学方法，将茶树WRKY基因家族与其他 植物WRKY基因进行比较分析，揭示它们之间的相似性 和差异性，以及它们在进化过程中的共性和特性。
茶树与其他植物WRKY基因的 遗传进化树构建
部分WRKY基因家族成员具有组织表达特异性，如WRKY1在叶片 中高表达，WRKY3在根中高表达。
逆境胁迫诱导
部分WRKY基因家族成员可被逆境胁迫诱导表达，如干旱、高温、 盐胁迫等，暗示其在茶树抗逆反应中发挥重要作用。
02
茶树WRKY基因家族功能 分析
茶树WRKY基因家族在抗病性中的作用
1 2 3
鉴定出多个WRKY基因家族成员，包括WRKY1、WRKY2、WRKY3等。
对每个成员进行序列特征分析，发现它们具有典型的WRKY结构域和保守的 WRKYGQK序列。
茶树WRKY基因家族成员分布特征
分布在不同染色体上
WRKY基因家族成员在茶树的多个染色体上分布，显示出广泛的存 在特征。
组织表达特异性
茶树WRKY基因家族在生长发育调控中的作用
生长发育机制
WRKY基因在植物生长发育过程 中发挥重要作用，可以参与调节 植物激素合成及信号传导途径， 控制植物生长发育。
茶树对干旱胁迫和复水响应的生理、分子机理
茶树对干旱胁迫和复水响应的生理、分子机理一、本文概述随着全球气候变化的加剧，干旱成为影响茶树生长和茶叶品质的主要环境因子之一。
干旱胁迫不仅会导致茶树生理代谢的改变，还可能引起茶叶产量和品质的下降。
因此，研究茶树对干旱胁迫和复水响应的生理、分子机理，对于提高茶树的抗旱性和优化茶叶生产管理具有重要意义。
本文旨在深入探讨茶树在干旱胁迫和复水过程中的生理变化和分子响应机制，以期为茶树的抗旱育种和茶园水分管理提供理论支撑和实践指导。
本文将首先介绍干旱胁迫对茶树生长和生理特性的影响，包括叶片水分状况、光合作用、抗氧化系统、渗透调节物质等方面的变化。
随后，文章将重点阐述茶树在干旱胁迫下的分子响应机制，包括基因表达、蛋白质互作、信号转导等方面的研究进展。
文章还将关注复水过程中茶树的生理和分子恢复机制，探讨茶树如何通过调节自身生理代谢和基因表达来适应水分条件的改变。
本文将对茶树抗旱性研究的前景进行展望，以期为茶树的可持续发展和茶叶产业的提质增效提供有益参考。
二、茶树干旱胁迫的生理响应干旱胁迫对茶树生理活动产生显著影响，这主要体现在茶树的生理生化指标上。
在干旱条件下，茶树叶片的叶绿素含量通常会下降，导致叶片颜色变淡，光合作用减弱。
叶片的脯氨酸含量会上升，作为一种渗透调节物质，帮助茶树维持细胞内外渗透压平衡，减轻干旱带来的伤害。
干旱胁迫下，茶树的丙二醛（MDA）含量也会增加，反映了细胞膜系统受损的程度。
干旱胁迫还会影响茶树的抗氧化系统。
在干旱条件下，茶树的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）等抗氧化酶活性会发生变化，这些酶类的活性变化有助于清除细胞内产生的活性氧自由基，减轻氧化胁迫对细胞的伤害。
在干旱胁迫下，茶树的生理响应还表现在气孔导度和蒸腾速率的变化上。
干旱胁迫会导致茶树气孔导度减小，蒸腾速率降低，以减少水分散失，维持体内水分平衡。
这种生理响应是茶树对干旱环境的一种适应机制。
茶树在干旱胁迫下表现出一系列的生理响应，这些响应是茶树为了适应干旱环境而发生的生理变化。
ERF植物转录因子与植物抗逆研究
酵母单杂交方法—体内分析转录因子与DNA结合特性或转录激活活性
（3）同源克隆 同源克隆的优点是在植物材料的基因信息未知的情况下，通过已知
（3）泛素介导的蛋白降解途径是翻译后调控转录因子蛋 白水平的另一个机制。
4、转录因子研究方法
4.1 克隆转录因子的方法
基于转录因子具有表达丰度低、与顺式元件特异性结合且DNA结合序 列保守等特点。目前，分离克隆转录因子常用的方法主要有以下几种：
（1）转座子标签法与RNA差异显示法 相结合的克隆方法
1、转录因子的结构特征
转录因子的三维结构中，N端通常含有与顺式作用元件 相结合的关键结构域。在转录调控过程中，转录因子通过 其 DNA结合域与靶序列特异结合，来实现对靶基因的精确 调控。
转录因子一般由4个功能区域组成： DNA结合区(DNA binding domain) 转录调控区(Transcription regulation domain)
（5）规模化分离、鉴定转录因子超家族成员 随着基因组测序技术的迅猛发展，多种植物的基因组已经测序完毕。
因此，利用生物信息学方法从全基因内分离、鉴定家族基因已成为研究 热点。这有助于全面系统深入解析基因的功能，在拟南芥、水稻、大豆 及其他一些作物的基因组中系统分析AP2/ERF家族基因已有报道。
总之，上述五种克隆转录因子的方法并不是孤立的, 需要结合实 验材料、实验目的等实际情况，综合采用上述一种或多种方法克隆目 的基因。
ERF植物转录因子研究与植物抗逆
转录因子在植物防卫反应和逆境胁迫应答过程中扮演着非 常重要的角色。在植物抗逆反应过程中，当植物受到外界环境 胁迫后，植物通过其信号传导途径有效地调控体内相关功能基 因的表达，进而引发一系列生理、生化反应，形成高效有序的 信号调控网络，以降低或消除给植株带来的危害。
【国家自然科学基金】_茶树(camellia sinensis)_期刊发文热词逐年推荐_20140802
科研热词 茶树 限制性核酸内切酶 西双版纳 茶 花芽 日变化 多酚氧化酶基因 响应 净光合速率 pcr-rflp cdna-aflp
推荐指数 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2009年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42
推荐指数 10 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2010年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
2012年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49
科研热词 推荐指数 茶树 11 表达分析 4 序列分析 3 铝 2 茶树(camellia sinensis) 2 愈伤组织 2 基因克隆 2 race 2 钙 1 转基因 1 萌发 1 茶黄素 1 茶多酚 1 茶 1 芽休眠与萌发 1 芽 1 脂氧合酶基因 1 肌动蛋白基因csactin1 1 细胞周期蛋白依赖激酶基因 1 组织培养 1 红茶 1 类黄酮3-o-葡萄糖基转移酶 1 类黄酮3' 1 类钙调蛋白 1 矿质营养 1 生长素相关基因 1 生长 1 生理生化 1 玉米和茶叶 1 激素调控 1 泛素活化酶基因 1 油茶 1 氧化铕 1 模拟酸雨 1 植物激素 1 根癌农杆菌 1 机理 1 普洱茶 1 抗氧化酶 1 抗hiv药物 1 多酚氧化酶 1 原核表达 1 内生细菌 1 全长cdna 1 克隆 1 光质 1 myb转录因子 1 cdna克隆 1 5'-羟化酶 1
茶树主要逆境胁迫反应及其适应逆境的生理机制
收稿日期：２０２１－１０－３１初稿；２０２１－１２－０９修改稿基金项目：２０２１年省级农业科技创新及推广项目（广东省现代农业产业技术体系创新团队）（２０２１ＬＭ１１１７）；广东省英德市国家现代农业产业园。
作者简介：莫晓丽（１９９７－），女，硕士研究生。
研究方向：茶树种质资源。
Ｅ－ｍａｉｌ：１２９１５０５５９８＠ｑｑ．ｃｏｍ通讯作者：黄亚辉（１９６９－），男，博士，研究员。
研究方向：茶树资源、茶叶加工。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｈｕｉｈｕａｎｇｚｚ＠１２６．ｃｏｍ茶树主要逆境胁迫反应及其适应逆境的生理机制莫晓丽，黄亚辉（华南农业大学，广东 广州 ５１００００）摘 要：茶树是我国南方地区的主要经济作物，近年来随着全球气候变暖的影响，茶树逆境胁迫日益严重，研究其生理特性和抗逆机制亟待加强。
本文对近年来国内外有关茶树抗逆的生理表现及其抗逆途径进行综述，分析了干旱、高温低温、盐、低氮磷钾、重金属等逆境胁迫对茶树生长的危害，茶树可通过生长发育调节、渗透调节、代谢调节等诸多途径提高自身抗逆性。
关键词：茶树；逆境生理；抗逆性中图分类号：Ｓ５７１．１文献标识码：Ａ文章编号：２０９６－０２２０（２０２１）０４－０１８５－０６犚犲狊狆狅狀狊犲狊犪狀犱犚犲狊犻狊狋犪狀犮犲犕犲犮犺犪狀犻狊犿狊狅犳犜犲犪犘犾犪狀狋狊狋狅犛狋狉犲狊狊犲狊–犃犚犲狏犻犲狑ＭＯＸｉａｏ ｌｉ，ＨＵＡＮＧＹａ ｈｕｉ（犛狅狌狋犺犆犺犻狀犪犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犌狌犪狀犵狕犺狅狌，犌狌犪狀犵犱狅狀犵５１００００，犆犺犻狀犪）犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｇｌｏｂａｌｗａｒｍｉｎｇｈａｓｂｒｏｕｇｈｔａｂｏｕｔａｎｅｖｅｒ－ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｓｔｒｅｓｓｓｅｒｉｏｕｓｌｙｉｍｐａｃｔｉｎｇｔｈｅｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｏｎｅｏｆｔｈｅｍａｊｏｒｅｃｏｎｏｍｉｃｃｒｏｐｓｉｎＣｈｉｎａ，犆犪犿犲犾犾犻犪狊犻狀犲狀狊犻狊．Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｌｙ，ｒｅｓｅａｒｃｈｔｏｆｕｒｔｈｅｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓａｎｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｔｅａｐｌａｎｔｓｈａｓｂｅｃｏｍｅｕｒｇｅｎｔｌｙｎｅｅｄｅｄ．Ｔｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｒｅｖｉｅｗｓｒｅｃｅｎｔｌｙｐｕｂｌｉｓｈｅｄｄｏｍｅｓｔｉｃａｎｄｆｏｒｅｉｇｎｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｐｌａｎｔｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ．Ｔｈｅｈａｚａｒｄｏｕｓｓｔｒｅｓｓｅｓｏｆｄｒｏｕｇｈｔ，ｗａｔｅｒｌｏｇｇｉｎｇ，ｈｉｇｈｏｒｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｅｘｐｏｓｕｒｅ，ｓａｌｔ，ＮＰＫｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，ａｎｄｈｅａｖｙｍｅｔａｌｐｏｌｌｕｔａｎｔｓｏｎｔｈｅｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｒｅｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｓｅｌｆ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓｏｎｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｏｓｍｏｓｉｓ，ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ａｎｄｏｔｈｅｒｓｂｙｔｈｅｐｌａｎｔｓｔｏｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｖａｒｉｏｕｓｓｔｒｅｓｓｅｓａｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ．Ｒｅｌｅｖａｎｔｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｏｎｔｈｅｐｌａｎｔｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｔｅａｑｕａｌｉｔｙａｎｄｙｉｅｌｄｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ，ｒｅｓｏｕｒｃｅｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｅａｃｕｌｔｉｖａｒｓａｒｅｐｒｏｖｉｄｅｄｆｏｒｉｎ ｄｅｐｔｈｓｔｕｄｉｅｓ．犓犲狔狑狅狉犱狊：ｔｅａ（犆犪犿犲犾犾犻犪狊犻狀犲狀狊犻狊）；ｓｔｒｅｓｓｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ；ｓｔｒｅｓｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ 茶树［犆犪犿犲犾犾犻犪狊犻狀犲狀狊犻狊（Ｌ．）Ｏ．Ｋｕｎｔｚｅ］是我国南方地区的主要经济作物，是世界三大无酒精饮料之一，具有丰富的保健作用，经济价值高。
根据 ERF 转录因子的结构特征可以将其分为四个亚类
根据ERF 转录因子的结构特征可以将其分为四个亚类。
第I 亚类：AP2/ERF结合域由59 个保守的氨基酸组成，位于蛋白的中部，转录调控域位于蛋白N 端；第II 亚类：AP2/ERF 结合域由58 个保守的氨基酸组成，位于蛋白的N 端，蛋白的C 末端存在一个EAR 基序；第III 亚类：AP2/ERF 结合域也由58 个氨基酸组成，其N 和C 两端各有一个酸性激活域，蛋白C 末端还有一个MAPK 作用位点。
第IV 类：AP2/ERF 结合域同样由58 个保守的氨基酸组成，位于蛋白的N 端，转录调控域位于C 端，此外N 末端还具有一个保守的MCGGAI(I/L)元件[68]ERFs类转录因子可以受到多种胁迫的诱导表达,同时参与不同胁迫信号转导途径的交叉应答,所以它在非生物胁迫中有十分重要的调控作用番前的?STE/JF/基因可以提高番莉根系发育过程中的耐盐性,还可以在转基因植株中表现较高的相对含水量和较低的丙二酸含量及电解质外渗,同时可以积累游离脯氨酸和可溶性糖含量,此外还调节抗逆相关基因、P5CS、DREB3】、的激活表达(Lu et al.,2011)。
Gao等(Gao et al.,2008)将番燕基因转入水稻,经过干旱和高盐处理后,同对照相比转基因植株的抗旱以及耐盐能力增强,并积累了脯氨酸含量,降低了叶片的水分流失。
另外,基因不仅可以影响含有GCC-box或DRE/CRT顺式元件的Z//>5、Wcor413L OsPrx和等胁迫相关的功能基因表达,还影响Os-CDP欠7、OsCDPKlS和OsCDP欠/9等调节基因的表达。
ERF类基因WXPl和WXP2可以使叶蜡积累并提高拟南芥的抗旱性(Zhangetal.,2007)。
己有许多研宄表明胁迫相关基因可以受外源的诱导表达,也有-?些基因虽然ABA对其表达无影响,但是确可以受到干早和低温等的诱导,这就又涉及到ABA依赖和ABA非依赖的非生物胁迫的信号转导途径,Zhu等(Zhu ct al.,2010)通过EMSA试验证明RAP2.6可以与CE丨顺式元件结合,进而可以调控AtABI4等ABA相关基因的特异表达。
茶树两个MYB转录因子基因的克隆及功能验证
茶树两个MYB转录因子基因的克隆及功能验证贡年娣;夏涛;郭丽丽;王弘雪;赵磊;王婕;王文钊;刘亚军;王云生;高丽萍【期刊名称】《茶叶科学》【年(卷),期】2014(000)001【摘要】R2R3-MYB in Sg4 subgroup probably participated in the regulation of lignin biosynthesis, which possibly play an important physiological role in plant growth and development. Two MYB transcription factors CsMYB4-5 and CsMYB4-6 in Sg4 subgroup were cloned by RACE technology. Investigation showed that the amino acid sequence of CsMYB4-5 showed 48.45% identity to AmMYB330 from Antirrhinum majus and 44.79% to AtMYB3 from Arabidopsis thaliana, while CsMYB4-6 showed 69.80% identity to AmMYB308 from Antirrhinum majus and 62.41% to AtMYB4 from Arabidopsis thaliana by bioinformatics analysis. The result of real-time fluorescent quantitative PCR showed that these two genes had all high expression levels in root while low expression levels in stem. The analysis of prokaryotic expression revealed that the recombinant CsMYB4-5 and CsMYB4-6 were expressed with a molecular weight of about 32 kD and 27 kD respectively. Compared with wild tobacco, transgenic tobacco with CsMYB4-6 gene appeared following symptoms:the veins of leaf tighten, lamina surface betweenveins with sags and crests, with white freckles in old leaf, but in transgenic tobacco with CsMYB4-5 gene the elder leaves turned yellow.%第4亚组R2R3-MYB可能参与木质素合成的调控，从而影响植物的生长发育。
海南普通野生稻OrERF1的克隆和表达分析
海南普通野生稻OrERF1的克隆和表达分析干旱、低温和高盐等非生物胁迫严重影响植物生长发育和作物产量。
在长期的进化过程中植物已在分子、细胞和系统水平上进化出了一套复杂的调控机制来感受并响应各种外界刺激，转录因子调节下游基因的表达来应答环境变化是这一调控机制的重要环节。
AP2/ERF（apetala2/ethy-lene response factor）家族转录因子含有60～70个氨基酸组成的高度保守AP2结合域，是植物中最大的转录因子之一，通过调节下游基因的表达广泛参与植物的生长发育、激素应答及对生物和非生物胁迫的响应。
目前AP2/ERF转录因子已在拟南芥、水稻、玉米、大豆、西红柿、黄瓜等多种植物中得到鉴定。
根据DNA结合元件的不同，可将AP2/ERF 转录因子分为AP2、ERF、DREB（dehydration-responsive element-binding protein）和RA V（related to ABI3/VPl）4个亚家族，ERF家族是AP2/ERF转录因子大家族的一个主要亚家族，在调节植物对生物和非生物逆境反应中发挥重要作用。
普通野生稻（Oryza rufipogon，Griff）是亚洲栽培稻的祖先，能够长期生长在各种恶劣的自然条件下，具有很强的抗逆特性，是水稻抗逆育种重要的遗传资源。
海南普通野生稻最原始，遗传多样性最高，具有很高的开发利用价值。
在先前的研究中，筛选获得一批抗逆性较强的海南普通野生稻材料，能够长期在干旱、低温和贫瘠等条件下健康生长。
为了进一步了解海南普通野生稻的抗旱机理，对干旱条件下差异表达基因进行了分析，并筛选获得了一个编码AP2/ERF转录因子的基因片段（结果未显示），本文在此基础上对该基因进行克隆和表达分析，为揭示该基因的功能奠定基础。
1材料和方法1.1材料将收集的普通野生稻（Oryza rufipogon Griff）种子置于50℃烘箱中干燥48h，打破休眠，用1%的HgCl2消毒10min，清水冲洗4～5次。
植物抗病性相关的WRKY转录因子的结构功能
植物抗病性相关的WRKY转录因子的结构功能1植物抗病相关转录因子转录因子(transcription factor，TF)是指能够直接或间接与启动子核心序列TATA盒特异结合，并启动转录的一类调节蛋白，通过调节目的基因的转录效率来调控植物的生理生化过程。
转录因子包含转录激活因子和转录阻遏因子两种，是基因表达的重要调节因子。
根据DNA结合区域的不同，如螺旋．环．螺旋、锌指结构、螺旋．转角．螺旋和亮氨酸拉链结构等等，植物的转录因子可划分成多个家族，如NAC家族、MYB家族、WRKY家族等。
转录因子在植物的抗病过程中起重要的作用。
近年研究发现，ERF、MYB、WRKY等家族中许多转录因子参与调控植物JA、ET、SA及不同病原菌侵染的信号转导途径。
在ERF家族中，ERFl和ORA59是JA/ET信号途径的激活调控因子，且ERFl基因过表达可以激活植物抗病相关基因PDF1.2和几丁质酶合成基因ChiB的表达，增加植物对灰葡萄孢的抗性；ERF2、ERFl4过表达也使PDF1.2的表达水平增加，而ERFl4是PDF1.2的负调控因子，这些研究表明ERF家族中的多数基因对植物抗病起负调控作用。
在MYB家族中，MYB30与植物磷脂酶相互作用，是拟南芥抗细菌的正调控因子；MYB72是拟南芥根部关键的调节因子，根际有益的细菌可诱导MYB72表达，激发拟南芥产生抗病性。
WRKY蛋白是近年来发现的植物特有的一类转录因子家族，在拟南芥中有74个家族成员，在水稻中有多于100个家族成员，参与生长发育、叶片衰老等，但主要功能是协助植物对抗各种生物或非生物胁迫。
2 WRKY转录因子概述WRKY转录因子最初是Ishiguro从甘薯中分离得到。
其后在野燕麦、皱叶欧芹、拟南芥、烟草、水稻、沙漠豆科植物、鸭茅草、大麦、棉花、油菜当中克隆到WRKY基因。
截止目前已经在20多种高等植物以及一些低等正和生物如肠兰波鞭毛虫、粘液菌盘基网柄菌、绿藻中发现该基因。
《黄花苜蓿MfERF070基因的克隆及其抗逆功能初探》范文
《黄花苜蓿MfERF070基因的克隆及其抗逆功能初探》篇一一、引言随着现代生物技术的发展，植物基因克隆与功能研究已经成为生物学领域的前沿研究课题。
黄花苜蓿作为一种重要的豆科植物，具有较高的生态价值和经济价值。
近年来，黄花苜蓿的抗逆性成为了研究的热点。
MfERF070基因作为黄花苜蓿中的一种转录因子，在植物抗逆过程中可能发挥重要作用。
本文旨在通过克隆MfERF070基因并对其抗逆功能进行初步探讨，为进一步研究黄花苜蓿的抗逆机制提供理论依据。
二、材料与方法1. 材料实验所用的黄花苜蓿样本取自XXX实验室植物培养室。
基因克隆所使用的酶、试剂及载体均采购自XX公司。
2. 方法（1）基因克隆采用PCR技术，以黄花苜蓿的cDNA为模板，扩增MfERF070基因。
将PCR产物进行纯化、连接至载体，转化至大肠杆菌中，筛选阳性克隆。
（2）序列分析对阳性克隆进行测序，利用生物信息学软件对MfERF070基因的序列进行分析，包括开放阅读框（ORF）预测、氨基酸序列分析等。
（3）抗逆功能初探通过转基因技术将MfERF070基因导入模式植物中，观察其在不同逆境条件下的表达情况及对植物生长的影响，初步探讨其抗逆功能。
三、结果与分析1. 基因克隆结果通过PCR扩增成功获得MfERF070基因，序列分析表明该基因具有完整的开放阅读框，编码的氨基酸序列与已知的ERF转录因子家族成员具有较高的相似性。
2. 序列分析结果MfERF070基因编码的蛋白质属于ERF转录因子家族，具有典型的AP2/ERF结构域。
通过生物信息学分析，发现该基因可能参与植物对逆境条件的响应和调控。
3. 抗逆功能初探结果将MfERF070基因导入模式植物中，发现在干旱、盐渍和低温等逆境条件下，转基因植物的生存率和生长状况均优于野生型植物。
这表明MfERF070基因可能具有提高植物抗逆性的功能。
进一步分析发现，MfERF070基因在逆境条件下表达量显著上升，表明其可能作为逆境响应的关键基因参与植物抗逆过程。
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茶叶科学 2011，31（1）：53~58 Journal of Tea Science收稿日期：2010-07-26 修订日期：2010-11-27基金项目：国家科技支撑计划（2008BADC0B03）、国家自然科学基金（30871568）和安徽省自然科学基金（090411014） 作者简介：陈林波（1980— ），男，贵州道真人，硕士研究生，助研，主要从事茶树生理与分子生物学研究。
*通讯作者茶树抗逆相关基因ERF 的克隆与表达特性分析陈林波1,2，房超1，王郁1，李叶云1，江昌俊1*，梁名志21. 安徽农业大学茶叶生物化学与生物技术教育部重点实验室，安徽 合肥 230036；2. 云南省农业科学院茶叶研究所，云南 勐海 666201提要：对利用cDNA-AFLP 技术所获得的茶树低温诱导差异表达片段TDF ，通过RACE 方法获得含完整编码区序列的茶树ERF 基因cDNA 克隆，其开放阅读框编码212个氨基酸，包含一个保守的结构域AP2/ERF ，与多种植物ERF 蛋白具有高度同源性。
qRT-PCR 分析表明，茶树ERF 基因受低温、乙烯、脱水、NaCl 等上调表达，最大表达量分别是诱导前的121.1、22.6、2.6和2.2倍。
在不同组织器官中，茶树ERF 基因在转录水平上存在显著差异，成熟叶片中表达最高，其次是芽，而根和茎中表达量较低且相当，花和种子中表达极低。
推测该基因在茶树响应非生物胁迫中发挥重要作用以及在组织中的表达受到严格控制。
关键词：茶树；ERF 基因；基因克隆；qRT-PCR ；表达分析中图分类号：S571.1；Q786 文献标识码：A 文章编号：1000-369X （2011）01-053-06Cloning and Expression Analysis of Stress-resistant ERF Genesfrom Tea Plant [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze]CHEN Lin-bo 1,2, FANG Chao 1, WANG Yu 1, LI Ye-yun 1, JIANG Chang-jun 1*, LIANG Ming-zhi 21. Key Laboratory of Tea Biochemistry & Biotechnology, Ministry of Education ，Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China;2. Tea Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Science, Menghai 666201, ChinaAbstract: For A TDF, which has been gained from genes expressed differentially in tea plant under cold stress using cDNA-AFLP, containing a complete coding sequence cDNA was cloned by RACE ，named CsERF, and contains an ORF, which encodes a polypeptide of 212 amino acids including a conserved AP2 domains. Sequence alignment showed that CsERF protein shared high identity with other plants. qRT-PCR analysis showed that ERF gene was up-regulated by cold, ethylene, dehydration, NaCl and the maximum expression were 121.1, 22.6, 2.6, 2.2 times higher than before treatment, respectively. For different tea organs, transcriptional level of the ERF gene was the highest in mature leaves, the next was in bud, the third was in root and stem, and the lowest in flower and seed. It deduced that ERF gene was very important for tea plant in response to abiotic stress and was strictly controlled in expression of different organs.Keywords: Camellia sinensis , ERF Transcription Factor, gene clone, qRT-PCR, expression analysisAP2/EREBP 家族是植物中普遍存在的一类重要转录因子，广泛参与植物逆境诱导信号转导，主要调节植物对激素、病原、低温、干旱及高盐等分子应答反应[1-3]。
Sakuma 等[4]将AP2/EREBP 家族分为5个亚族：AP2亚族、RAV 亚族、DREB 亚族、ERF 亚族和其他类别。
其中，ERF (ethylene-responsive-element- binding factor )是AP2/EREBP 家族中成员最多54 茶叶科学31卷的一类，在植物防卫反应中具有重要作用。
近年来开展的茶树抗寒分子机理研究中，茶树DREB亚族的CBF基因[5]、RAV亚族的RAV 基因[6]已先后被克隆，并开展了相关功能研究，但ERF类转录因子至今未见报道。
本研究对课题组前期研究(利用cDNA- AFLP筛选茶树冷诱导相关基因，另文报道)中所获得茶树抗寒相关片段TDF(transcript derived fragment, TDF)，通过RACE(rapid amplification of cDNA ends, RACE)方法，获得含完整编码区序列的茶树ERF基因cDNA克隆。
用qRT-PCR(quantitativeRT-PCR)方法对其在各种非生物胁迫过程以及在不同组织中的表达特性进行了分析，为研究ERF在茶树抗寒分子机理中的作用奠定基础。
1 材料与方法1.1 实验材料与处理供试材料为安徽农业大学实验茶园国家级无性系茶树良种“舒茶早”(Camellia Sinensis cv. Shuchazao)的成熟叶片、芽、嫩茎、花、果和嫩根，以及选取未受病、虫侵害同等成熟度的茶树枝条进行胁迫处理：4℃诱导(放置于光照培养箱，条件为光照16 h，暗处理8 h，下同)、乙烯诱导(喷施0.1%乙烯溶液)、脱水处理(选取同部位的叶片摊放在滤纸上脱水)以及高盐诱导(插入300 mmol/L NaCl溶液中培养)，分别在0、3、6、9、12、24 h取样，取样后迅速放入液氮中固定，于-70℃保存备用。
1.2 方法1.2.1 总RNA的提取总RNA的提取，用2%的CTAB裂解后[7]，参照TIANGEN RNAprep pure Plant Kit试剂盒说明书进行，略有改动。
用DU800紫外分光光度计(美国Beckman公司)和1%的凝胶电泳,对总RNA进行定量和质量分析。
1.2.2 ERF全长的克隆和序列分析根据TDF片段序列设计5′端特异引物GSP1:GGTTTGGGATCGTGGCAAGAAGCAG和嵌套引物NUP1:TTCCCCCACGGTCTCT GCCTCAC，以及3′端特异引物GSP2:TGGCA ACCGACCGAAGGGAGGGAGT和嵌套引物NUP2：AAGGGGAAGCATTACAGGGGAG，按大连宝生物(TaKaRa)公司SMART TM RACE cDNA Amplification Kit说明书进行扩增，将扩增出的两端序列和中间片段进行拼接验证后获得ERF基因cDNA全长，验证引物P1：GATTTTGTGATGATGATGTGCA，P2：GCAAATCTTTCCCACCCTCCAA。
扩增产物回收按照凝胶回收试剂盒使用说明进行，连接到pMD18-T载体(TaKaRa)测序。
利用NCBI数据库和BioXM 2.6软件以及网站和http://cubic. /services/predictNLS进行序列分析和结构预测。
1.2.3 ERF基因的qRT-PCR分析利用全式金生物技术有限公司EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix合成单链cDNA以及TranStart Green qPCR SuperMix 进行qRT-PCR，反应体系为25 µL，扩增条件为95℃ 3 min；94℃ 5 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，40个循环；72℃ 2 min。
按相对定量法进行基因表达量的计算，相对表达量的比值=2-∆∆Ct，其中∆∆Ct=∆Ct(测定样品)﹣∆Ct(校准样本)，∆Ct(测定样品)=Ct(测定样品目标基因)﹣Ct(测定样品参照基因)，∆Ct(校准样本)=Ct(校准样本目标基因)﹣Ct(校准样本参照基因)。
以actin为参照基因，0 h样品或叶片为校准样本，ERF定量分析引物P3：AACTTCCCCCACGG TCTCTG，P4：CTCGTCTACGGCCTCCTCAA；内参引物P5：GCCATCTTTGATTGGAATGG，P6：GGTGCCACAACCTTGATCTT。
2 结果与讨论2.1 ERF基因全长cDNA的扩增根据TDF片段(该片段与ERF转录因子具有高度同源性)序列设计特异引物和嵌套引物，利用RACE技术分别对5′端、3′端进1期 陈林波，等：茶树抗逆相关基因ERF 的克隆与表达特性分析 55行特异扩增，扩增结果见图1。
将两端序列和中间片段进行拼接得到一个977 bp 的cDNA 序列。
为了验证其正确性设计验证引物P1和P2，经基因扩增与测序，结果与拼接获得的cDNA 中所对应的序列完全一致(图1-E )，此序列含完整编码区。
将获得的茶树ERF 基因序列提交GenBank ，获取基因登录号为：GU393024。
2.2 ERF 基因全长序列分析茶树ERF 基因最大开放阅读框为636 bp ，编码212个氨基酸，编码蛋白质理论分子量为23.48 kDa ，等电点（pI ）8.03。