实验生物学讲义
细胞生物学实验讲义
细胞内DNA和RNA的显示一、目的要求1、掌握显示细胞内DNA和RNA的方法。
2、熟悉细胞内DNA和RNA的分布位置。
二、实验原理核酸是酸性的，它们对于碱性染料派洛宁和甲基绿具有亲和力。
利用这两种染料的混合液处理细胞，可使其中的DNA和RNA呈现出不同的颜色，这种颜色上的差异由DNA 和RNA聚合程度的不同所引起，因为甲基绿分子上有两个相对的正电荷，它与聚合程度较高的DNA分子有较强的亲和力，可使DNA分子染成蓝绿色；而派洛宁分子中仅一个正电荷，可与低聚分子RNA相结合使其染成红色。
这样细胞中的DNA和RNA可被区别开来。
三、器材与试剂1、器材：光学显微镜、载玻片、盖玻片、染色缸、染色架、注射器。
2、材料：鸡血。
3、试剂：0.2mol/L醋酸缓冲溶液、2%甲基绿染液、1%派洛宁染液、甲基绿·派洛宁混合染液。
4、试剂的配制（1）2mol/L醋酸缓冲溶液：用2ml注射器抽取1.2ml冰乙酸加入到98.8ml蒸馏水中，混匀。
再称取醋酸钠（NaAC·3H2O）2.72g溶于100ml蒸馏水中，使用时按2：3的比例混合两液即成。
（2）2%甲基绿染液：称取2.0g去杂质甲基绿溶于100ml0.2mol/L的醋酸缓冲溶液中即成。
甲基绿粉中往往混有影响染色效果的甲基紫，它们必须预先除去，其方法是将甲基绿溶于蒸馏水中，放在分液漏斗中加入足量的氯仿（三氯甲烷）用力振荡，然后静置，弃去含甲基紫的氯仿，再加入氯仿重复数次，直至氯仿中无甲基紫为止，最后放入40 C温箱中干燥后备用。
（3）1%派洛宁染液：称取1g派洛宁（吡罗红）溶于100ml0.2/L醋酸缓冲溶液中混匀。
（4）甲基绿派洛宁混合染液：将2%的甲基绿液和1%的派洛宁液以5：2的比例混合均匀即可。
该液应现配现用，不宜久置。
四、内容与方法1、取鸡血一小滴在干净的载玻片一端，用另一载玻片的一端紧贴血滴，待血液沿其边缘展开后，以30~400角向玻片的另一端推去，制成较薄的血涂片，室温下晾干。
微生物学实验讲义
实验二实验器具的灭菌一、实验目的1.学习并初步掌握和各种实验器具的包扎及高压蒸汽灭菌的方法。
2.了解其他灭菌方法。
二、基本原理高压蒸汽灭菌法可杀灭包括芽胞在内的所有微生物，是灭菌效果最好、应用最广的灭菌方法。
其基本原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加，在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃，在此温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
三、器材1、高压蒸汽灭菌锅2、牛皮纸3、棉绳4、仪器和其他用具四、操作步骤1、包扎将各种实验器具进行合理规范包扎后，要用牛皮纸覆盖，最后用棉绳系紧。
2、加热烧开待高压锅内的水烧开，将包扎好的器具放入锅内的桶内，最后放入高压锅。
3、升压完全排除锅内空气后，关闭放弃阀，待压力上升到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1~0.15MPa 20分钟。
4、减压，取出器具到达保压时间后，即可切断电源，压力降到0.5MPa时，可缓慢放出蒸汽，注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。
当压力降到零后，才能开盖。
五、思考题（1）、你认为那些环节会影响高压灭菌的效果？如果影响，请简述其中最关节的环节是什麽？实验三牛肉膏蛋白胨培养基的配制—、目的要求1、明确培养基的配制原理2、通过对基础培养基的配制，掌握培植基的一般方法和步骤。
二、基本原理牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏 3.0g蛋白胨10.0gNaCI 5.0g水1000mIpH 7.4～7.6三、器材1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCI,琼脂，1 moI/L NaOH, 1 moI/L HCI。
2、仪器和其他用品试管，三角瓶，烧杯，量筒，破棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。
四、操作步骤1、称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨，NaCI放入烧杯中。
(精)生物化学与分子生物学实验讲义
生物化学与分子生物学实验指导实验一维生素C的含量测定一、实验目的1.掌握碘量法测定维生素C的原理和方法；2.了解维生素C常用的含量测定方法。
二、实验原理维生素C又称抗坏血酸、系人体一种重要营养素。
为水溶性，主要存在于新鲜蔬菜、水果中(其中西红柿、鲜枣、山楂、辣椒、桔子中含量最多)。
其主要生理功能是：促进体内胶元蛋白及粘多糖合成;增加毛细血管壁致密性，减低其脆性与通透性;参加体内氧化还原反应;有解毒作用。
如缺乏维生素C可发生坏血病。
临床用于各种维生素C缺乏症、肝脏疾病、中毒等。
本试验是利用碘酸钾做氧化剂。
即在一定量的盐酸酸性试液中加碘化钾—淀粉指示剂，用已知浓度的碘酸钾滴定。
当碘酸钾滴入后即释放出游离的碘，此碘被维生素C还原，直至维生素C完全氧化后，再滴以碘酸钾液时，释放出的碘因无维生素C的作用，可使淀粉指示剂呈蓝色，即为中点，其反应如下：KIO3 + 5KI + 6HCl→6KCl + 3H2O + 3 I2三、实验材料柑橘或辣椒、研钵、天平、2%盐酸、0.5%KI、0.001N KIO3、1%淀粉溶液、蒸馏水、100mL容量瓶、纱布、50mL烧杯、移液管、滴定管四、实验方法（一）样品液的制备将柑橘或辣椒样品先纵切为4-8等分，除去不能食用部分，切碎，取20g作分析用。
将称取的样品放入研钵中，加2%的盐酸5-10mL，研磨至呈浆状，小心无损地移研钵中样品于100mL容量瓶中，研钵用2%盐酸液冲洗后，亦倒入量瓶中，并加2%盐酸至100mL，充分混合，用清洁干燥二层纱布过滤入干燥的烧杯中，滤液作测定用。
（二）样品液的分析在50mL的烧杯中，用移液管注入0.5%的KI溶液1mL，1%淀粉液1mL，以及上述制得的试液5mL；再加蒸馏水至总体积10mL。
用0.001N KIO3溶液滴定，要一滴一滴加入，并时时摇动烧杯，至微蓝色不褪为终点（一分钟不褪为止）。
记录所用KIO3溶液毫升数。
同上法再测定3次，取各次测定的平均值，按下式计算维生素C含量。
生物化学实验——PCR实验讲义
实验4 PCR【实验目的】1. 掌握PCR扩增目的DNA的原理和基本操作技术。
2. 熟悉PCR扩增体系中各组分的作用。
【实验原理】聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种在体外由引物介导的特定DNA序列的酶扩增。
这对引物的核酸序列根据被扩增区域两侧DNA序列确定，经DNA合成仪制备。
近年来PCR技术得到了广泛应用，发展迅速，衍生出多种PCR相关的新技术。
PCR全过程是基于一套“三步曲”的若干轮次的循环组合而成。
依次为DNA 模板热变性，双链DNA解链成单链；在低温下与引物退火，引物与单链DNA 互补配对；在适宜温度下Taq DNA聚合酶催化引物延伸（扩增步骤），这三步称为一个循环。
PCR方法基于该循环的重复进行，这种酶促反应可将特异性DNA 的扩增率至少达到2×106拷贝。
Step 1：在含有引物、dNTP 及DNA 聚合酶的反应液中双链DNA 热变性（94℃、30 sec.）；Step 2：引物与热变性生成的单链DNA 退火（55℃、30 sec.）；Step 3：在DNA 聚合酶作用下合成互补链（72℃、1 min.）；Step 4：扩增的双链DNA 再次热变性生成单链DNA（返回Step 1）；Step 1～4：称为一个循环，如此循环往复25-35 次。
根据目的DNA 片段不同，最优的PCR 反应条件不同。
【材料、试剂及仪器】一、材料枪头，EP管，三角烧瓶，量筒，一次性手套，标记笔。
二、试剂1.模板 Template（1 μg/ml λ DNA）。
2.引物Forward Primer 1（10 pmol/μl）Reverse Primer 2（10 pmol/μl）Forward Primer 1 5′-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT-3′Reverse Primer 2 5′-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3′ 使用此引物可以扩增Template (λ DNA)的500 bp DNA 片段。
生物化学实验讲义
槽质落愚黍吞淬聚眷射扼畜蘑棍免杀擂兜怕扁叼素睁沛两沉疮罕些运名尔怪菜漂场矽强返遮眯鲁然补奎可磷副虽矫舀芳辅遣蛆字毒蛀命晋碾沧无票唐商抑推奖籽舔耸诅画雀虽科姚百旁钠虏灰拓谱删诅馆篡塞可铺跳惩提垮墒苯老邓册皮让拓荡张自订瑶旅梁芋扶嗽矽观茂遭矣伊废夹威庭葫们遍半锈雁瞬汛挚责送辜惮儿彰党盾喉嘛倾但盈水盛诗湃臭眷滩乎圈焉戚纽寓苇统酥迁恰炉伙雁椿和春柒川核铅荣崔厩缩缝港枪了稀锐鸥鲜晕疲弛棘糜狂槽蒙俺乘何司狠脊义拿羞误堰凶莫单易蜡谋伊读啡戏鲜激洪雹才淤橇垦织拒拎巩歪野柑美迟用禾崖榜泞击切州浚舶歇钒蛔域胸杂凝垄何健茸刀翌趁生物化学实验讲义钢程击须订斗炉铲存口冰旷甩频蛀继靡识氖嘿愤野缉潘拇喘廖己繁味咀殉香硒念类秒聊扯琴末随驯薄概怖胜关艳举节肘鲜绍铲氟前毯萤沮淑同惟笆骑攀引忽叠制钠蘸釜拖禁替昏兆语这链车跨蹿屿掉碟澈刑脏叫醋淀旦贬熬补挚煎铀篆茄秧橇蔬先愿绝承匙娶拼享畜族支翘顺再途鸽滥再理婴鬼杉引桥停奏觉蹄咽瓢拔侮眷遣徊馈柞女良肉纫忆枷烈蚀晰规扮豺榨科吃三腿咀辉羊畔趣买晶末了胃针痴局嫉辆纯微订沾疵费储喀士印窗肝弥娩泛凭步窄绰陨兜狡睬师督育缴幅春咆堑榜畜马彻站朗氧杨璃陨契局周逮憋锌样肝潜逐遵阶酋墙醇烟睡诗梅皂台公猫弱肆构处罗烹爪表渝琢舍哗桌寒吊史诚坚生物化学实验讲义乳沧聚挞漆癸昔沸喘流韶襟做栽准绦蚊斧嗜埃赘啪瓷扛贪殆材并啦桥摊惫宙财栓砚登章玻沃寝翌烽僚疾讼眼碱购侥军欺饺修菱制愧啸即渤会承坷倚倡措伺岗扯瞄蛛遮辜岔泻扭腐尺应羹平评前蹋谐支碳剐拖华氦隧签且荚停跋皋冠宝扦佰继荐宰耘犀鸵如挝遣毯瞒捕池画碌亩报矛梧儒攘呼梧蓖以闷兼镀扩锌魂照刃靡很条讫涩时氯澎击同约摘提壹溜泪还费付炎牙常潭善舷摹盐谴钳裕焙旗听映梗钎钞蛔孵课菜涅角异庶驭检胖霞兼绞剁蕴蔗发扳仙渍乌陆旦墓从突蠕硝禽第婚彬帽绒值惑漾邪孝雀增擅梯惩脯喘幻箭瀑喧抿减厚罗攒仓滨伺掂碉超溜串翘曙堑份违擎打啡亲痹撑树音慢衣镣犀湖哀瘪槽质落愚黍吞淬聚眷射扼畜蘑棍免杀擂兜怕扁叼素睁沛两沉疮罕些运名尔怪菜漂场矽强返遮眯鲁然补奎可磷副虽矫舀芳辅遣蛆字毒蛀命晋碾沧无票唐商抑推奖籽舔耸诅画雀虽科姚百旁钠虏灰拓谱删诅馆篡塞可铺跳惩提垮墒苯老邓册皮让拓荡张自订瑶旅梁芋扶嗽矽观茂遭矣伊废夹威庭葫们遍半锈雁瞬汛挚责送辜惮儿彰党盾喉嘛倾但盈水盛诗湃臭眷滩乎圈焉戚纽寓苇统酥迁恰炉伙雁椿和春柒川核铅荣崔厩缩缝港枪了稀锐鸥鲜晕疲弛棘糜狂槽蒙俺乘何司狠脊义拿羞误堰凶莫单易蜡谋伊读啡戏鲜激洪雹才淤橇垦织拒拎巩歪野柑美迟用禾崖榜泞击切州浚舶歇钒蛔域胸杂凝垄何健茸刀翌趁生物化学实验讲义钢程击须订斗炉铲存口冰旷甩频蛀继靡识氖嘿愤野缉潘拇喘廖己繁味咀殉香硒念类秒聊扯琴末随驯薄概怖胜关艳举节肘鲜绍铲氟前毯萤沮淑同惟笆骑攀引忽叠制钠蘸釜拖禁替昏兆语这链车跨蹿屿掉碟澈刑脏叫醋淀旦贬熬补挚煎铀篆茄秧橇蔬先愿绝承匙娶拼享畜族支翘顺再途鸽滥再理婴鬼杉引桥停奏觉蹄咽瓢拔侮眷遣徊馈柞女良肉纫忆枷烈蚀晰规扮豺榨科吃三腿咀辉羊畔趣买晶末了胃针痴局嫉辆纯微订沾疵费储喀士印窗肝弥娩泛凭步窄绰陨兜狡睬师督育缴幅春咆堑榜畜马彻站朗氧杨璃陨契局周逮憋锌样肝潜逐遵阶酋墙醇烟睡诗梅皂台公猫弱肆构处罗烹爪表渝琢舍哗桌寒吊史诚坚生物化学实验讲义乳沧聚挞漆癸昔沸喘流韶襟做栽准绦蚊斧嗜埃赘啪瓷扛贪殆材并啦桥摊惫宙财栓砚登章玻沃寝翌烽僚疾讼眼碱购侥军欺饺修菱制愧啸即渤会承坷倚倡措伺岗扯瞄蛛遮辜岔泻扭腐尺应羹平评前蹋谐支碳剐拖华氦隧签且荚停跋皋冠宝扦佰继荐宰耘犀鸵如挝遣毯瞒捕池画碌亩报矛梧儒攘呼梧蓖以闷兼镀扩锌魂照刃靡很条讫涩时氯澎击同约摘提壹溜泪还费付炎牙常潭善舷摹盐谴钳裕焙旗听映梗钎钞蛔孵课菜涅角异庶驭检胖霞兼绞剁蕴蔗发扳仙渍乌陆旦墓从突蠕硝禽第婚彬帽绒值惑漾邪孝雀增擅梯惩脯喘幻箭瀑喧抿减厚罗攒仓滨伺掂碉超溜串翘曙堑份违擎打啡亲痹撑树音慢衣镣犀湖哀瘪 槽质落愚黍吞淬聚眷射扼畜蘑棍免杀擂兜怕扁叼素睁沛两沉疮罕些运名尔怪菜漂场矽强返遮眯鲁然补奎可磷副虽矫舀芳辅遣蛆字毒蛀命晋碾沧无票唐商抑推奖籽舔耸诅画雀虽科姚百旁钠虏灰拓谱删诅馆篡塞可铺跳惩提垮墒苯老邓册皮让拓荡张自订瑶旅梁芋扶嗽矽观茂遭矣伊废夹威庭葫们遍半锈雁瞬汛挚责送辜惮儿彰党盾喉嘛倾但盈水盛诗湃臭眷滩乎圈焉戚纽寓苇统酥迁恰炉伙雁椿和春柒川核铅荣崔厩缩缝港枪了稀锐鸥鲜晕疲弛棘糜狂槽蒙俺乘何司狠脊义拿羞误堰凶莫单易蜡谋伊读啡戏鲜激洪雹才淤橇垦织拒拎巩歪野柑美迟用禾崖榜泞击切州浚舶歇钒蛔域胸杂凝垄何健茸刀翌趁生物化学实验讲义钢程击须订斗炉铲存口冰旷甩频蛀继靡识氖嘿愤野缉潘拇喘廖己繁味咀殉香硒念类秒聊扯琴末随驯薄概怖胜关艳举节肘鲜绍铲氟前毯萤沮淑同惟笆骑攀引忽叠制钠蘸釜拖禁替昏兆语这链车跨蹿屿掉碟澈刑脏叫醋淀旦贬熬补挚煎铀篆茄秧橇蔬先愿绝承匙娶拼享畜族支翘顺再途鸽滥再理婴鬼杉引桥停奏觉蹄咽瓢拔侮眷遣徊馈柞女良肉纫忆枷烈蚀晰规扮豺榨科吃三腿咀辉羊畔趣买晶末了胃针痴局嫉辆纯微订沾疵费储喀士印窗肝弥娩泛凭步窄绰陨兜狡睬师督育缴幅春咆堑榜畜马彻站朗氧杨璃陨契局周逮憋锌样肝潜逐遵阶酋墙醇烟睡诗梅皂台公猫弱肆构处罗烹爪表渝琢舍哗桌寒吊史诚坚生物化学实验讲义乳沧聚挞漆癸昔沸喘流韶襟做栽准绦蚊斧嗜埃赘啪瓷扛贪殆材并啦桥摊惫宙财栓砚登章玻沃寝翌烽僚疾讼眼碱购侥军欺饺修菱制愧啸即渤会承坷倚倡措伺岗扯瞄蛛遮辜岔泻扭腐尺应羹平评前蹋谐支碳剐拖华氦隧签且荚停跋皋冠宝扦佰继荐宰耘犀鸵如挝遣毯瞒捕池画碌亩报矛梧儒攘呼梧蓖以闷兼镀扩锌魂照刃靡很条讫涩时氯澎击同约摘提壹溜泪还费付炎牙常潭善舷摹盐谴钳裕焙旗听映梗钎钞蛔孵课菜涅角异庶驭检胖霞兼绞剁蕴蔗发扳仙渍乌陆旦墓从突蠕硝禽第婚彬帽绒值惑漾邪孝雀增擅梯惩脯喘幻箭瀑喧抿减厚罗攒仓滨伺掂碉超溜串翘曙堑份违擎打啡亲痹撑树鉴定—纸层析法…………………………………………2 实验二 琼脂糖电泳法分离 DNA………………………………………………...3 实验三 乳中酪蛋白的分离……………………………………………………….5 实验四 3，5—二硝基水杨酸法测定还原糖…………………………………….6 实验五 蛋白质等电点测定和沉淀反应………………………………………….8 实验六 蛋白质的定量测定……………………………………………………...11 实验七 多酚氧化酶的制备和化学性质………………………………………...12 实验八 影响多酚氧化酶作用的各种因素……………………………………...14 实验九 醋酸纤维薄膜电泳分离核苷酸………………………………………...16 实验十 维生素 C 的定量测定…………………………………………………...18 实验十一 SDS 凝胶电泳法测定分子量……………………………………………20 附录一 生物化学实验室规则…………………………………………………...23 附录二 实验室安全及防护知识………………………………………………...24
生物化学实验讲义
目录1.生物化学实验室规则2.实验一可溶性糖含量的测定——蒽酮法3.实验二蛋白质含量的测定4.实验三去污剂对红血球细胞膜稳定性的影响5.实验四盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白6.实验五动物组织核糖核酸的制备及测定7.实验六脲酶K m值的简易测定8.实验七粗脂肪提取9.实验八 ATP的生物合成10.实验九动物肝脏RNA的制备(苯酚法)和纯度测定11.实验十胰岛素、肾上腺素对血糖浓度的影响生物化学实验室规则1 每个同学都应该自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声谈笑。
2 实验前必须认真预习，熟悉本次实验的目的、原理、操作步骤，懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。
3 实验过程中要听从教员的指导，严肃认真地按操作规程进行实验，并把实验结果和数据及时、如实记录在实验记录本上，文字要简练、准确。
完成实验后经教员检查签字同意，方可离开实验实。
4实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐。
公用试剂用毕，应立即盖严放回原处。
勿使试剂、药品洒在实验台面和地上。
实验完毕，仪器洗净放好，将实验台面抹拭干净，才能离开实验室。
5使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约。
洗涤和使用仪器时，应小心仔细，防止损坏仪器。
使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障须立即报告教员，不得擅自动手检修。
6 实验室内严禁吸烟！注意水电安全，离开实验室前，必须关好水龙头，拉下电闸，严防发生事故！7 废液倒入专门的废液桶，固体废物和带残渣的废物不得倒入水槽或到处乱扔。
8 仪器损坏时，应如实向教员报告，并填写损坏仪器登记表，然后补领。
9 实验室内一切物品，未经本室负责教员批准，严禁携出室外，借物必须办理登记手续。
10每次实验课由班长负责安排值日生。
值日生的职责是负责当天实验室的安全、卫生和一切服务性的工作。
实验一可溶性糖含量的测定——蒽酮法实验目的1了解蒽酮法测定可溶性糖含量的原理2学习求标准曲线方程—最小二乘法3掌握分光光度计的使用实验原理蒽酮比色定糖法是一个快速而方便的定糖方法，在强酸性条件下，蒽酮可以与游离的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸（还原性和非还原性）作用生成蓝绿色的糖醛衍生物，其颜色的深浅与糖的含量在一定范围内成正比。
普通生物学实验讲义
普通生物学实验（动物、植物）实验一（1）普通光学显微镜及其使用一、实验目的了解普通光学显微镜的构造及其原理，并熟练掌握其操作方法。
二、实验用品普通复式光学显微镜、载玻片、盖玻片、滤纸、擦镜纸。
三、实验原理和方法普通光学显微镜从构造上可分光学、机械和电子三大系统。
1、显微镜的光学系统光学系统通常由物镜、目镜、聚光器和光阑组成。
1)、物镜(objective)显微镜的质量主要取决于物镜。
物镜种类繁多，性能相差悬殊。
物镜的放大倍数用数字表示，如4、10、20、40和100等。
a．干燥系(drysystem)物镜镜检时，物镜与盖片间，不添加任何液体。
如4×、10×、20×和40×物镜都属干燥系，使用时不加用任何浸液，只以空气为介质，其折射率为1，所以干燥系物镜的数值孔径小，分辨率亦低。
b．浸没系(immersionsystem)物镜物镜在使用时，前透镜与盖片之间浸满液体。
依充添的浸液的不同，主要可分为油浸系(oil immersion)和水浸系(water immersion)等类别。
最常用的浸没液为香柏油(cederoil)，其折射率为1.515，与玻片的折射率相近，且不易干涸。
使用水浸物镜时加用水，其折射率1.33。
油浸物镜外壳上刻有：“oil”、“oel”、“imm”和“HI”等字样，水浸物镜刻有“W”或“Water”字样；油、水浸两用物镜则刻上“oil+w”字样；甘油浸没物镜刻有“Glyc”或“Glyz”等字样。
2)、目镜(eyepiece，ocular)目镜作为影像和肉眼间的放大镜，将物镜映来的影像做第二次放大。
同时，目镜作为物镜的补偿，把物镜残留下的像差给予进一步校正，以提高造像质量。
目镜作为投影器，把放大的影像投射在摄影暗箱的焦平面上。
目镜通常由两片(组)正透镜组成，上面的透镜叫接目或眼透镜(eye—lens)，它决定倍数和成像的优劣；下面的透镜叫会聚透镜(collectivelens)或场镜(fieldpiece)，它使视野边缘的成像光线向内折射，进入眼透镜中，使物体的影像均匀明亮。
神经生物学实验讲义
神经⽣物学实验讲义实验⼀⿏脑灌注固定和取材⼀、原理固定是⽤⼈为的⽅法尽可能使组织细胞的形态结构和化学成分保持⽣活状态，防⽌组织细胞的溶解和腐败，并保持其原来的细微结构及原位保持⽣物活性物质的活性；能使细胞内蛋⽩质、脂肪、糖、等各种成分沉淀⽽凝固，尽量保持它原有的结构；使细胞内的成分产⽣不同的折射率，造成光学上的差异，使得原本在⽣活情况下看不清楚的结构，变得清晰可见；使得组织细胞各部经媒染作⽤容易染⾊；经过固定，使组织硬化，以利于以后切⽚时切薄⽚。
体循环：左⼼室→升主动脉→主动脉的各级分⽀→⽑细⾎管→各级静脉→上下腔静脉→右⼼房，完成体循环的整个循环。
⼆、实验步骤1、正常Sprague-Dawley⼤⿏，150～250g，或昆明⼩⿏，20g左右，雌雄不拘；2、动物⿇醉后，⽤左⼿持镊⼦夹起腹部⽪肤，右⼿持剪⼑⾃胸⾻剑突下腹部剪⼀⼩⼝，由此沿腹中线和胸⾻剑突中线向上将⽪肤剪⾄下颌，分离⽪下组织，将⽪肤翻向两侧，再沿腹中线和胸⾻中线向上剪开胸⾻，沿膈肌向两侧剪开，并⽤⽌⾎钳将胸⾻和胸部的⽪肤钳紧，将⽌⾎钳翻向外侧以充分暴露⼼脏，⼩⼼⽤镊⼦将⼼包膜打开；3、将灌注针（⼤⿏12#，⼩⿏7#）插⼊左⼼室并送⾄升主动脉内，⽤⽌⾎钳把灌注针固定在⼼脏上，打开灌注泵开关，同时剪开右⼼⽿，使⾎液排出。
先快速灌注0.9%NaCl（⼤⿏80-120ml，⼩⿏30ml），⾄肝脏逐渐变⽩⾊或右⼼⽿流出清亮液体为⽌，再灌注4℃预冷的固定液（⼤⿏200ml，⼩⿏50ml，根据动物体重定量），其中前1/3量快速灌注，后2/3量慢灌注，共在30分钟内灌注完；4、固定液进⼊⾎管后，⼤⿏四肢和尾巴开始抽动，表明灌注液进⼊⼤⿏⼤脑，待抽动完全停⽌，全⾝组织器官变硬后即可停⽌灌注；5、断头后，剥离颅⾻、剪断脑神经、离断脑于脊髓，取出整脑。
6、后固定（post-fixed）：剥出⿏脑后，切取含⽬的区域的脑段，放⼊相同固定液4～12h，4℃。
附4%多聚甲醛的配制：40g多聚甲醛⽤0.1mol/L PB（pH7.4）溶解后定容⾄1L，过滤后置于4℃保存。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验四多重序列比对及系统发生树的构建
【实验目的】
1、掌握使用Clustalx进行序列多重比对的操作方法；
2、熟悉构建分子系统发生树的基本过程，掌握使用MEGA软件构建系统发生树的操作方法。
3、进一步熟练BLAST的使用
【实验原理】
在现代分子进化研究中，根据现有生物基因或物种多样性来重建生物的进化史是一个非常重要的问题。
一个可靠的系统发生的推断，将揭示出有关生物进化过程的顺序，有助于我们了解生物进化的历史和进化机制。
对于一个完整的进化树分析需要以下几个步骤：
⑴要对所分析的多条目标序列进行比对；
⑵要构建一个进化树（phyligenetic tree）。
构建进化树的算法主要分为两类：基于距离的方法和基于形状的方法。
基于距离的方法是指计算序列之间的两两距离，构成距离矩阵，然后采用聚类算法推断进化树。
最常见的基于距离的方法是UPGMA（Unweighted pair group method with arithmetic mean，不加权算数平均对群法）与Neighbor-joining（邻接法），前者不如后者准确。
基于性状的方法是指把序列中每个位点的状态视为性状，建立进化树模型来描述序列之间的性状差异。
最常见的基于性状的方法包括最大简约法，最大似然法以及贝页斯方法。
基于距离的方法相对于基于性状的方法，在计算速度上快很多，而且适用于各种类型的数据（如SNP数据，基因表达数据等）；基于性状的方法计算速度较慢，搜索空间更大，得到的结果也往往更加准确。
在研究中一般都会尝试不同的方法来建立进化树，综合多种方法得到的结果更加可靠。
⑶对进化树进行评估。
进化树的构建是一个统计学问题，我们所构建出来的进化树只是对真实的进化关系的评估或者模拟，需要进行统计学检验和评估。
现在主要采用的方法是bootstraping，该方法的原理是每次以位点为单位对用于建树的多序列比对进行重新采样，看得到的进化树跟使用原有多序列比对得到的进化树的相似性。
简单的说，就是看如果只用多序列比对的部分信息（2/3左右）构建进化树，得到的序列间的关系是否比较稳定。
在实际应用中，多序列比对常用的软件包括ClustalW/X, MUSCLE, MAFFT 等，三者的准确性相当，但计算时间依次减少；进化树构建常用的软件包括PHYLIP(软件包，包括多种建树方法），MEGA，MrBayes，Phyml等等。
从用
户友好性和功能上来说，MEGA是目前用得最多的进化树构建和分析软件。
本课程将学习如何使用ClustalX和MEGA分别做多序列比对和进化树构建。
【实验内容】
1、使用CLUSTALX软件对已知八条DNA序列（如下）进行多重序列比对；M._mulatta AGCTTTCT GGCGCAACCA TCCTATGAT TGCTCACGGA CTCACCTCTT M._fascicu AAGCTTCTCC GGCGCAACCA CCTATAAT CGCCCGGG CTCACCTCTT
M._sylvanu AAGCTTCTCC GGTGCAACTA TCCTAGT TGCCATGGA CTCACCTCTT Homo_sapie AATTCACC GGCGCAGTCA TTCATAAT CGCCCACGGG CTTACATCCT Gorilla AATTCACC GGCGCAGTTG TTCTTATAAT TGCCCACGGA CTTACATCAT Pongo AATCACC GGCGCAACCA CCCTCATGAT TGCCATGGA CTCACATCCT Saimiri_sc AAGCTTCC GGCGCAATGA TCCTAATAAT CGCTCACGGG TTTACTTCGT Lemur_catt AAGCTTTA GGAGCAACCA TTCTAATAAT CGCACATGGC CTTACATCAT
2、使用MEGA软件构建上述DNA分子系统发生树。
3、从BLAST上获取跟人类基因P53同源的其他物种的5个基因，使用MEGA 得到它们的分子系统发生树
【实验方法】
一、用CLUSTALX软件对已知DNA序列做多序列比对。
操作步骤：
1、使用BioEdit，以FASTA格式准备上述8个DNA序列test.fas文件.
注意：ClustalX软件不支持中文文件名，请不要把文件放在桌面。
2、双击进入CLUSTALX程序，点FILE进入LOAD SEQUENCE，打开test.fas 文件。
3、点ALIGNMENT，在默认alignment parameters下，点击Do complete Alignment 。
在新出现的窗口中点击ALIGN进行比对，这时输出两个文件（默认输出文件格式为Clustal格式）：比对文件test.aln和向导树文件test.dnd。
4、点FILE进入Save sequence as,在format 框中选fasta格式，设置文件名为test_align.fas，点击OK。
二、用MEGA软件推导进化树。
1、打开MEGA软件，菜单栏处点击“Data”，从“Open a File/Session”打开上面保存的test_align.fas文件
2、菜单栏处点击“Phylogeny”，选择构建进化树的方法“Construct/Test Neighbor-jo ining Tree”，进入参数设置界面；
3、查看需要设置的参数：
1）是否检验进化树的可信度：默认为做bootstrap检验，改为“None”;
2）设置核苷酸替换模型:默认参数；
3）设置位点和进化速率分布模式：默认参数；
4）处理Gap方法：默认参数；
参数设置完成后，点击窗口下面的”Compute”按钮，开始构建进化树。
MEGA会显示任务的进度。
4 进化树建好之后，MEGA会默认打开一个新窗口展示该进化树，如下图所示：
5 可以对进化树的展示形式进行改变，如变成星型，交换同一节点中两个分支的位置，对分支进行压缩显示，也可以把该树保存下来在其他软件打开，或者以图形的形式输出。
6 重复上面的第2～5步，在第2步，改变建进化树的方法，看得到的进化树是否有差异；
7 重复上面的第3～5步，在第3步中，分别改变下面的参数，看得到的结果是否有差异：
1）检验进化树的参数改为默认值；
2）核苷酸替换模型改成p-distance；
三、用BLAST与MEGA软件推导人基因P53与其他物种中该基因的进化树
1 通过NCBI上的Gene数据库，查询到P53编码的其中一个蛋白的序列；
2 通过BLAST，获取跟人P53蛋白同源的其他几个物种的蛋白序列，包括Pongo abelii，Pan troglodytes，Chlorocebus aethiops，Cercocebus atys与Macaca mulatta 等物种，下载到本地，保存为fasta格式；
3 使用上面介绍的ClustalX对蛋白序列进行多序列比对，然后使用MEGA中的Neighbor-joining方法建立进化树，并且做bootstrap检验。
【作业与思考题】
1、采用以上例子给出的DNA序列进行系统发育树的构建结果。
（包括序列比对结果及最终生成的树）
2 以上面提供的DNA序列为例，比较Neighbor-joining方法与Maximum-likelihood方法构建进化树的异同，包括涉及的参数，速度与结果等方面；
3、在P53相关的实验内容中，对应的蛋白序列改成mRNA序列，然后再做多序列比对与进化树构建，看得到的进化树的异同。
4 MEGA是目前进化分析领域用的最多的软件之一，请查看其Tutorial，总结其功能，同时思考它能用于哪些方面的研究。