第三章 蛋白质
3．氨基酸和蛋白质
罗勃特 P.威尔逊
3.1 简介
蛋白质约占鱼类干重的65-75%。鱼类不断利用氨基酸形成新的蛋白质或者替代已有的蛋白质。如果日粮中蛋白质含量过多，只有一部分将被用于形成新的蛋白质，其余的将被转变成能量。
最初的氨基酸实验日粮是根据鸡全卵蛋白、大鳞大麻哈鱼卵蛋白和大鳞大麻哈鱼卵黄蛋白来表示的。根据鸡全卵蛋白氨基酸组成配置的氨基酸实验日粮被用来测定大鳞大麻哈鱼氨基酸定性需求。
3.2 蛋白质需求
3.2.1 总需求
3.2.1.1 有鳍鱼
像其它动物一样，鱼类没有真实的蛋白质需求量，但是需要必需氨基酸和非必要或非必需氨基酸之间很好的平衡。测定的几种鱼类幼鱼的蛋白质需求量总结在表格3.1中。由于没有充分考虑下面这些因素：(a)日粮能量含量(b)日粮蛋白质的氨基酸组成(c)日粮蛋白质的消化，所以一些需求量值估计过高。
同其它动物一样，鱼类最理想的日粮蛋白质水平受到能蛋比平衡，氨基酸组成，测试蛋白的消化，和非蛋白能量来源的影响。实验日粮中能量过量会限制饲料的消耗，像其它动物一样，鱼类摄食是为满足能量需求。在许多鱼类中许多饲料原料的可代谢能量还没有被测定，研究者运用生理燃料值来表示蛋白质需求和日粮能量水平的关系。
表3.1中的数据表明鱼类的蛋白质需求量比其它脊椎动物更高（两到四倍）。用饲料摄入量（每千克体重每天摄入蛋白质克数）和活体重增加（每千克活体重所获得的蛋白质克数）表示时，鱼类的日粮蛋白质需求量并不与其它脊椎动物不同。
3.2.1.2 甲壳纲动物
研究的许多甲壳纲动物的蛋白质需求量很高，范围为日粮干重的30%到60%（表3.3）。这些测定的数据有些估计过高了。甲壳纲动物营养研究很复杂。一些生物体在消化之前同样弄碎食物粒子，这可能会增强消化使得饲料消耗测定很
困难。
表3.1 测定的幼鱼的蛋白质需求量
种类蛋白质来源需求量（%）出处
尖吻鲈酪蛋白，动物胶45 Boonyaratpalin(1991)
庸鲽鱼粉51 Heliand和Grisdale-Helland(1998) 大西洋鲑鱼粉55 Grisdale-Helland 和Helland(1997) 饰金罗非鱼酪蛋白，卵蛋白34 Winfree和Stickney(1998) 鳟酪蛋白，鱼粉，FPC n53 Arzei 等(1995) 斑点叉尾鮰全卵蛋白32-36 Garling 和Wilsoe(1976)
大鳞大麻哈鱼酪蛋白，动物胶，氨基酸40 Delong 等(1958)
银大麻哈鱼酪蛋白40 Zeitoun 等(1974)
鲤酪蛋白38
31 Ogino 和Saito(1970) Takeuchi 等(1979)
石斑鱼金枪鱼肌肉粉40-50 Teng 等(1978)
鳗鲡鱼粉40 De la Higuera 等(1989) 欧洲海鲈鱼粉50 Hidalgo 和Alliot(1988) 鯧鯵鱼粉，大豆粉45 Lazo 等(1998)
金头鲷酪蛋白，FPC，氨基酸40 Sabaut和Luquet(1973)
美鳊鱼粉，酪蛋白29 Lochmann 和Phillips(1994)
鲫鱼粉，酪蛋白29 Lochmann 和Phillips(1994)
草鱼酪蛋白41-43 Dabrowskl(1977)
杂交斑纹鲈（金眼石鮨×条纹
石鮨）
鱼粉，酪蛋白35 Nematipour 等(1992
日本鳗鲡酪蛋白，氨基酸44.5 Nose 和Arai(1972)
大口黑鲈酪蛋白，FPC 40 Anderson 等(1981)
遮目鱼酪蛋白40 Lin 等(1979) 莫桑比克罗非鱼白鱼粉40 Jauncey(1982) 尼罗罗非鱼酪蛋白30 Wang 等(1985) 鲽鳕鱼肌肉50 Cowey 等(1972) 红鳍东方鲀酪蛋白50 Kanazawa 等(1980) 虹鳟酪蛋白，动物胶40 Zeitoun 等(1973) 似石首鱼鱼粉，酪蛋白35-45 Daniels 和Robinson(1986) 真鲷酪蛋白55 Yone(1976) 小口黑鲈酪蛋白，FPC 45 Anderson 等(1981) 月鳢鱼粉52 Wee 和Tacon(1982) 红大麻哈鱼酪蛋白，动物胶，氨基酸45 Halver 等(1964)
条纹石鮨鱼粉，SP b47 Millikin(1983) 金鲈酪蛋白，动物胶，氨基酸35 Brown 等(1996)
黄尾魳裸玉筋鱼科鱼粉55 Takeda 等(1975) 鱲鱼粉32 Shyong 等(1998) 红腹罗非鱼酪蛋白35 Mazid 等(1978)
a鱼类蛋白质浓度
b 大豆蛋白盐
表3.2 鱼类和其它脊椎动物蛋白质摄入量与生长相关参数
参数鱼其它脊椎动物特定生长率 2.765 2.445
日粮蛋白质.40.3 20.0
16.5 12.0
最大生长蛋白质摄入量
（mg摄取蛋白质/g动物体重/天）
31.0 29.0
蛋白质保存效率
[100×（g保留蛋白质/g摄取蛋白质）]
蛋白质生长效率
1.945 1.965
（g增重/g摄取蛋白质）
饲料转换效率0.78 0.26
a数据来自Bowen(1987)
表3.3 甲壳类动物最适宜日粮蛋白质水平
物种蛋白质来源适宜水平出处
Homarus americanus 酪蛋白，动物胶，虾粉31 D,Abramo 等(1981) Homarus gammarus 鱼和甲壳类动物肉粉35 Lucien-Brun 等(1985)
大豆粉，金枪鱼粉，虾粉＞35 Balazs 和 Ross(1976) Macrobrachium
resenbergil
Metapenaeus monoceros 酪蛋白55 Kanazawa 等(1981) Palaemon serralus 鱼粉，虾粉40 Forster 和 Bwad(1973) Penaeus durarum 大豆粉28-30 Sick 和 Andrews(1973) Penaeus indicus 对虾肉粉43 Colvin(1976) Penaeus japonicus 虾粉40 Balazs 等(1973)
酪蛋白，卵蛋白素54 Deshimaru 和Kuroki(1974)
鱿鱼粉60 Deshimaru 和Shigeno(1972)
酪蛋白，卵蛋白素52-57 Deshimaru 和Yone(1978) Penaeus merguiensis Mytilus edulis粉34-42 Sedgwick(1979) Penaeus monodon 酪蛋白，鱼粉46 Lee(1971)
Penaeus setiferus 鱼粉28-32 Andrews 等(1972)
3.2.2 影响需求量的因素
3.2.2.1 规格和年龄
一般地，鱼类的蛋白质需求量随着规格和年龄的增大而降低。例如，最理想的日粮蛋白质水平鲑科稚鱼为日粮的45-50%，幼鱼为40%，一龄鱼需求量大约为35%日粮蛋白（Hilton和linger，1981；Hardy,1989）。
3.2.2.2 水温
据报道，水温的变化会改变一些鱼类的蛋白质需求量，而对于其它一些鱼则没有影响。一般来说，生长率和饲料摄入量随着水温升高而增加，因此，认为水温的改变对饲料摄入量比对蛋白质需求量的影响更大。
3.2.3 维持需求量
一种动物的维持蛋白质需求量被定义为维持氮平衡所需的蛋白质摄入量。动物的氮平衡就是氮摄入量等于氮排泄量，体重没有发生变化。
3.2.3.1 方法
第一种或直接的方法包括测定与粪便、尿和鳃损失相结合的内源氮排泄量。测定的鱼不投喂食物，饲喂非蛋白日粮或者饲喂低蛋白日粮。然后在考虑实验日粮的消化率和生物价值的情况下根据内源性氮排泄量数据计算出维持的蛋白质需求量。第二种或者间接的方法对鱼类来说是一种更简单和方便的方法。在这种方法中，氮保存量可以通过鱼类在实验结束时的氮消耗量和氮保留量的差值进行测定。这些数据同样可以与饲喂一种定额规格增长所获得的生长数据和和零增长所获得的氮或蛋白质摄入量相联系（Luquet和Kaushik，1981）。
3.2.3.2 维持需求量的测定
只有有限的几个研究报道了鱼类蛋白质的维持需求量。
3.3 氨基酸定性需求
1957年，Halver提出了第一个成功的鱼类氨基酸实验日粮。根据全鸡卵蛋白形成的实验日粮饲喂大鳞大麻哈鱼在12周实验期后表现出最好的生长率和饲料效率。因此，这种实验日粮被用于测定大鳞大麻哈鱼的定性氨基酸需求（Halver 等，1957）。这些研究者通过比较饲喂10周基础日粮和缺乏某种特定氨基酸日粮的大鳞大麻哈鱼的相对生长率测定了18种普通蛋白质氨基酸的必要性。结果表明以下的10种氨基酸对于大鳞大麻哈鱼来说是必需的：精氨酸、组氨酸、异亮
氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。所有研究的其它物种需要同样的这10种氨基酸。
3.4 氨基酸定量需求
3.4.1 方法论
3.4.1.1 氨基酸实验日粮
许多研究者使用Halver和他的合作者所发展的方法来测定鱼类的氨基酸定量需求。
其他研究者使用半纯合和纯氨基酸供应的实用日粮来判定特定鱼类的氨基酸需求量。
3.4.1.2 生长研究
根据常规生长反应曲线或散点图许多氨基酸需求量值已经被测定出来。设置重复组的实验鱼投喂包含不同等级水平的测试氨基酸，直到实验鱼的体重出现可测量的差异。体重增加的线性增长常随着氨基酸摄入量的增加而增大，直到出现特定氨基酸相应的最高点，此时体重不再增加或处于平稳状态。
运用各种方法测定或计算根据体重增加数据所得出的需求量值相应的拐点。
3.4.1.3 血清或组织氨基酸研究
一些研究者已经发现鱼类血清或血液和肌肉自由氨基酸水平和日粮氨基酸摄入量有较大的关系。
3.4.1.4 氨基酸氧化研究
这种方法是基于一种普遍的假说，认为当日粮中一种氨基酸有限或不足时，大部分氨基酸被用于蛋白质合成，小部分被氧化成CO
，而当日粮中氨基酸供应
2
过量时，许多将被氧化，因此氨基酸含量对于蛋白质分析不是一个限制性因素。产生一个氨基酸氧化明显增加的摄入水平可以作为特定氨基酸需求量的直接指示剂。
3.4.2 精氨酸需求量
鱼类的精氨酸需求量值总结在表3.4中。
3.4.3 组氨酸需求量
鱼类组氨酸的需求量值见表3.5。在研究的鱼类中各种鱼的组氨酸需求量存在着较好的一致性，需求量范围为蛋白质的1.5-2.5%。
3.4.4 支链氨基酸需求量
3.4.4.1 异亮氨酸需求量
鱼类的异亮氨酸需求量值见表3.6。除了日本鳗鲡和遮目鱼它们的需求值更高外，研究的其它鱼类的需求量大约为蛋白质的2.2-3%。
表3.4 精氨酸需求量
鱼类需求量a根据出处大西洋鲑 4.1 生长研究Lall 等(1994)
5.0-5.1 生长研究Berge 等(1997)
4.6 理想蛋白质Rollin(1999)
印度鲤 4.8 生长研究Ravi 和Devaraj(1991) 斑点叉尾鮰 4.3 生长研究Robinson 等(1981)
大鳞大麻哈鱼 6.0 生长研究Klein 和Halver(1970) 大麻哈鱼 6.5 生长研究Akiyama 和Arai(1993)
杂交胡鲇 3.6 理想蛋白质Unprasert(1994)
银大麻哈鱼 5.8 生长研究Klein 和Halver(1970)
3.2 生长研究Arai 和Ogata(1993)
4.9-
5.5 生长研究Luzzana 等(1998)
鲤 4.3 生长研究Nose(1979)
3.8 蛋白质添加物Ogino(1980)
欧洲海鲈 4.6 A/E比率b Kaushik(1998)
金头鲷 5.0 生长研究Luquet 和Sabaut(1974)
5.4 A/E比率Kaushik(1998)
杂交斑纹鲈 4.4 生长研究Griffin 等(1994a)
日本鳗鲡 4.5 生长研究Arai(Nose,1979)
比目鱼 3.4 A/E比率Forster 和Ogata(1998)
遮目鱼 5.3 生长研究Borlongan(1991) 莫桑比克罗非鱼 4.0 生长研究Jackson 和Capper(1982) 尼罗罗非鱼 4.2 生长研究Santiago 和Lovell(1988) 虹鳟 3.3 生长研究Kaushik(1979)
3.5 蛋白质添加物Ogino(1980)
3.5 生长研究Rodehutseord 等(1995)
3.5-
4.2 生长研究Chiu 等(1998)
3.8 生长研究Forster(1993)
3.6-
4.0 生长研究Walton 等(1986)
4.0 生长研究Kin 等(1992b)
4.1 生长研究Pack 等(1995)
4.7 生长研究Cho 等(1992)
5.4-5.9 生长研究Ketola(1983)
似石首鱼 3.7 A/E比率Moon 和Gatlin(1991) 红海鲷 3.5 A /E比率Forster 和Ogata(1998) Rohu 2.9 生长研究Khan 和Jafri(1993)
大菱鲆 4.8 A/E比率Kaushik(1998)
欧鲇 3.4 生长研究Toth(1986)
白鲟 4.8 蛋白质添加物Ng 和Hung(1995)
金鲈 4.3 生长研究Twibell 和Brown(1997)
a 用蛋白质百分比表示的需求量
b （必需氨基酸含量/包括半胱氨酸和酪氨酸在内的总必需氨基酸含量
表3.5 组氨酸需求量
鱼类需求量根据出处大西洋鲑 1.8 理想蛋白质Rollin(1999)
印度鲤 2.5 生长研究Ravi 和Devaraj(1991) 斑点叉尾鮰 1.5 生长研究Wilson 等(1980) 大鳞大麻哈鱼 1.8 生长研究Klein 和Halver(1970) 大麻哈鱼 1.6 生长研究Akiyama et al(1985a)
1.6 生长研究Akiyama 和Arai(1993)
杂交胡鲇 1.2 理想蛋白质Unprasert(1994) 银大麻哈鱼 1.8 生长研究Klein 和Halver(1970)
0.9 生长研究Arai 和Ogata(1993)
鲤 2.1 生长研究Nose(1979)
1.4 蛋白质添加物Ogino(1980)
欧洲海鲈 1.6 A/E比率b Kaushik(1998)
金头鲷 1.7 A /E比率Kaushik(1998)
日本鳗鲡 2.1 生长研究Arai(Nose,1979)
比目鱼 1.3 A /E比率Forster 和Ogata(1998) 遮目鱼 2.0 生长研究Borlongan 和Coloso(1993) 尼罗罗非鱼 1.7 生长研究Santiago 和Lovell(1988) 虹鳟 1.6 蛋白质添加物Ogino(1980) 似石首鱼 1.7 A /E比率Moon 和Gatlin(1991) 红海鲷 1.4 A /E比率Forster 和Ogata(1998) 大菱鲆 1.5 A /E比率Kaushik(1998)
a 用蛋白质百分比表示的需求量
b 见表3.4，用b标注
表3.6 异亮氨酸需求量
鱼类需求量根据出处大西洋鲑 3.2 理想蛋白质Rollin(1999)
印度鲤 2.4 生长研究Ravi 和Devaraj(1991) 斑点叉尾鮰 2.6 生长研究Wilson 等(1980)
大鳞大麻哈鱼 2.2 生长研究Chance 等(1964) 大麻哈鱼 2.4 生长研究Akiyama 和Arai(1993) 杂交胡鲇 2.0 理想蛋白质Unprasert(1994) 银大麻哈鱼 1.2 生长研究Arai 和Ogata(1993) 鲤 2.5 生长研究Nose(1979)
2.3 蛋白质添加物Ogino(1980)
欧洲海鲈 2.6 A/E比率b Kaushik(1998)
金头鲷 2.6 A /E比率Kaushik(1998)
日本鳗鲡 4.0 生长研究Arai(Nose,1979)
比目鱼 2.0 A /E比率Forster 和Ogata(1998)
湖红点鲑 2.0-2.6c生长研究Hughes 等(1983)
遮目鱼 4.0 生长研究Borlongan 和Coloso(1993) 尼罗罗非鱼 3.1 生长研究Santiago 和Lovell(1988) 虹鳟 2.4 蛋白质添加物Ogino(1980) 似石首鱼 2.9 A /E比率Moon 和Gatlin(1991)
红海鲷 2.2 A /E比率Forster 和Ogata(1998)
大菱鲆 2.6 A /E比率Kaushik(1998)
高首鲟 3.0 A /E比率Ng 和Hung(1995)
a 用蛋白质百分比表示的需求量
b 见表3.4，用b标注
c这些值是根据计算的实验日粮的氮含量再计算
3.4.4.2亮氨酸需求量
亮氨酸需求量值见表3.7。除了报道的日本鳗鲡和遮目鱼的需求值较高，约大于蛋白质的5%外，其它鱼类的需求量较一致，为蛋白质的3.3-3.9%。一般来说，根据A/E比率[（必需氨基酸含量/包括半胱氨酸和酪氨酸在内的总的必需氨基酸含量）×1000]和蛋白质添加物测定出的亮氨酸需求量比根据生长研究得出的需求值更高一些。
表3.7 亮氨酸需求量
鱼类需求量根据出处大西洋鲑 5.2 理想蛋白质Rollin(1999)
印度鲤 3.7 生长研究Ravi 和Devaraj(1991) 斑点叉尾鮰 3.5 生长研究Wilson 等(1980)
大鳞大麻哈鱼 3.9 生长研究Chance 等(1964) 大麻哈鱼 3.8 生长研究Akiyama 和Arai(1993)
杂交胡鲇 3.5 生长研究Unprasert(1994)
银大麻哈鱼 3.4 生长研究Arai 和Ogata(1993) 鲤 3.3 生长研究Nose(1979)
4.1 蛋白质添加物Ogino(1980)
欧洲海鲈 4.3 A/E比率b Kaushik(1998)
金头鲷 4.5 A /E比率Kaushik(1998)
日本鳗鲡 5.3 生长研究Arai(Nose,1979)
比目鱼 3.9 A /E比率Forster 和Ogata(1998)
湖红点鲑 3.5-4.6c生长研究Hughes 等(1983)
遮目鱼 5.1 生长研究Borlongan 和Coloso(1993) 尼罗罗非鱼 2.8-3.6 生长研究Santiago 和Lovell(1988) 虹鳟 4.4 蛋白质添加物Ogino(1980) 似石首鱼 4.7 A /E比率Moon 和Gatlin(1991)
红海鲷 4.2 A /E比率Forster 和Ogata(1998)
大菱鲆 4.6 A /E比率Kaushik(1998)
高首鲟 4.3 蛋白质添加物Ng 和Hung(1995)
a 用蛋白质百分比表示的需求量
b 见表3.4，用b标注
c这些值是根据计算的实验日粮的氮含量再计算
3.4.4.3 缬氨酸需求量
鱼类的缬氨酸需求量见表3.8。研究的物种的缬氨酸需求量存在着较好的一致性，表明缬氨酸需求量范围是蛋白质的2.5-4%。
3.4.4.4 相互作用
在不同鱼类中异亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸相互作用存在着一些差异。
表3.8 缬氨酸需求量
鱼类需求量根据出处大西洋鲑 3.9 理想蛋白质Rollin(1999)
印度鲤 3.6 生长研究Ravi 和Devaraj(1991) 斑点叉尾鮰 3.0 生长研究Wilson 等(1980)
大鳞大麻哈鱼 3.2 生长研究Chance 等(1964) 大麻哈鱼 3.0 生长研究Akiyama 和Arai(1993) 杂交胡鲇 2.4 理想蛋白质Unprasert(1994)
银大麻哈鱼 2.2 生长研究Arai 和Ogata(1993) 鲤 3.6 生长研究Nose(1979)
2.9 蛋白质添加物Ogino(1980)
欧洲海鲈 2.9 A/E比率b Kaushik(1998)
金头鲷 3.0 A /E比率Kaushik(1998)
日本鳗鲡 4.0 生长研究Arai(Nose,1979)
比目鱼 2.5 A /E比率Forster 和Ogata(1998) 湖红点鲑 2.6-3.3c生长研究Hughes 等(1983)
遮目鱼 3.6 生长研究Borlongan 和Coloso(1993) 尼罗罗非鱼 2.8 生长研究Santiago 和Lovell(1988) 虹鳟 3.1 蛋白质添加物Ogino(1980) 似石首鱼 3.1 A /E比率Moon 和Gatlin(1991)
红海鲷 2.5 A /E比率Forster 和Ogata(1998)
大菱鲆 2.9 A /E比率Kaushik(1998)
高首鲟 3.3 蛋白质添加物Ng 和Hung(1995)
a 用蛋白质百分比表示的需求量
b 见表3.4，用b标注
c这些值是根据计算的实验日粮的氮含量再计算
3.4.5 赖氨酸需求量
鱼类赖氨酸需求量值概述在表3.9中。一般地，赖氨酸是配制温水性鱼的饲料的第一限制性氨基酸（FRobinson等，1980b），可能也是其他鱼类的第一限制性氨基酸。
3.4.5.1 精氨酸-赖氨酸相互作用
表3.9 赖氨酸需求量
鱼类需求量a根据出处
非洲鲇 5.7 生长研究Fagbenro 等(1998b)
大西洋鲑 4.0 生长研究Anderson 等(1993)
3.2-3.6 生长研究Berge 等(1998)
6.1 生长研究Rollin(1999)
饰金罗非鱼 4.3 生长研究Liou(1989) 印度鲤 6.2 生长研究Ravi 和Devaraj(1991)
斑点叉尾鮰 5.1 生长研究Wilson 等(1977)
5.0 生长研究Robinson 等(1980b)
大鳞大麻哈鱼 5.0 生长研究Halver 等(1958) 大麻哈鱼 4.8 生长研究Akiyama 等(1985a)
5.0 生长研究Akiyama 和Arai(1993)
杂交胡鲇 4.8 生长研究Unprasert(1994)
银大麻哈鱼 3.8 生长研究Arai 和Ogata(1993) 鲤 5.7 生长研究Nose(1979)
5.3 蛋白质添加物Ogino(1980)
欧洲海鲈 4.8 生长研究Tibaldi 和Lanari(1991) 金头鲷 5.0 生长研究Luquet 和Sabaut(1974)
杂交斑纹鲈 4.0 生长研究Griffin 等(1992)
4.0 生长研究Keembiyehetty 和Gatlin(1992)
日本鳗鲡 5.3 生长研究Arai(Nose,1979)
比目鱼 4.6 生长研究Forster 和Ogata(1998) 遮目鱼 4.0 生长研究Borlongan 和Benitez(1990) 莫桑比克罗非鱼 4.1 生长研究Jackson 和Capper(1982)
尼罗罗非鱼 5.1 生长研究Santiago 和Lovell(1988) 虹鳟 3.7 生长研究Kim 等(1992b)
4.2 生长研究Walton 等(1984a)
4.2 生长研究Pfeffer 等(1992)
5.3 蛋白质添加物Ogino(1980)
6.1 生长研究Ketola(1983)
似石首鱼 4.4 生长研究Craig 和Gatlin(1992)
5.7 生长研究Brown 等(1988)
5.7 A /E比率b Moon 和Gatlin(1991)
红海鲷 4.4 生长研究Forster 和Ogata(1998) Rohu 5.9 生长研究Khan 和Jafri(1993)
5.7 生长研究Murthy 和Varghese(1997)
大菱鲆 5.0 A /E比率Kaushik(1998)
白鲟 5.4 蛋白质添加物Ng 和Hung(1995)
金鲈 4.1 生长研究Ruchimat et al,(1997b)
a 用蛋白质百分比表示的需求量
b 见表3.4，用b标注
3.4.6 含硫氨基酸需求量
蛋氨酸和半胱氨酸被分类为含硫氨基酸。鱼类需要足够量的蛋氨酸和半胱氨酸以满足其适当的蛋白质合成和其他生理功能。半胱氨酸被认为是鱼类的非必需氨基酸，是因为鱼类可以从必需氨基酸蛋氨酸合成半胱氨酸。当日粮中含有蛋氨酸而没有半胱氨酸时，一部分的蛋氨酸被用于蛋白质合成，一部分转换成半胱氨酸以结合形成蛋白质。如果日粮中含有半胱氨酸，将会减少日粮中蛋氨酸的需求量。因此，测定总的含硫氨基酸（蛋氨酸加半胱氨酸）需求量，蛋氨酸的日粮需求量被认为是无半胱氨酸或实验日粮中含有较低水平半胱氨酸时的需求量。3.4.6.1 蛋氨酸需求量
蛋氨酸或总的含硫氨基酸需求量值见表3.10。表明许多鱼类的需求量值大约是蛋白质的2-3%。
表3.10 蛋氨酸或总的含硫氨基酸需求量
鱼类需求量a根据出处
非洲鲇 3.2（0）b生长研究Fagbenro 等(1998a) 北极红点鲑 1.8(0) 生长研究Simmons 等(1999)
2.7(0) 透镜病理学Simmons 等(1999)
亚洲海鲷 2.9(0) 生长研究Coloso 等(1999)
大西洋鲑 3.1 理想蛋白质Rollin(1999)
饰金罗非鱼 2.8(0) 生长研究Liou(1989) 印度鲤 3.6(0) 生长研究Ravi 和Devaraj(1991) 斑点叉尾鮰 2.3(0) 生长研究Harding 等(1959)
大鳞大麻哈鱼 4.0(1 生长研究Halver 等(1959) 大麻哈鱼 3.0(1.2) 生长研究Akiyama 和Arai(1993)
杂交胡鲇 2.4(0) 生长研究Unpraseert(1994)
银大麻哈鱼 2.7(0) 生长研究Arai 和Ogata(1993) 鲤 3.1(0) 生长研究Nose(1979)
2.1(0) 生长研究Schwarz 等(1998)
1.6(0.8) 蛋白质添加物Ogino(1980)
欧洲海鲈 2.0(1) 生长研究Thebault 等(1985)
2.3 A/E比率c Kaushik(1998)
金头鲷 4.0 生长研究Luquet 和Sabaut(1974)
2.4 A/E比率Kaushik(1998)
杂交斑纹鲈 2.9(0.13) 生长研究Keembiyehetty 和Gatlin(1993)
2.1(0) 生长研究Griffin 等(1994b)
日本鳗鲡 3.2(0) 生长研究Arai(Nose,1979)
比目鱼 1.9 A/E比率Forster 和Ogata(1998)
遮目鱼 2.5(0.8) 生长研究Borlongan 和Coloso(1993) 莫桑比克罗非鱼 3.2(0.7) 生长研究Jackson 和Capper(1982) 尼罗罗非鱼 3.2(0.5) 生长研究Santiago 和Lovell(1988) 虹鳟 2.2(0) 生长研究Walton 等(1982)
2.3(0) 生长研究Kim 等(1992a)
1.9(0.2) 生长研究Cowey 等(1992)
2.4(0.2) 透镜病理学Cowey 等(1992)
3.0(0.3) 生长研究Rumsey 等(1983)
1.8(0.9) 蛋白质添加物Ogino(1980)
似石首鱼 3.0(0.12) 生长研究Moon 和Gatlin(1991)
红海鲷 2.2 A/E比率c Forster 和Ogata(1998)
Rohu 2.6(1) 生长研究Khan 和Jafri(1993)
大菱鲆 2.7 A/E比率Kaushik(1998)
白鲟 2.2 蛋白质添加物Ng 和Hung(1995)
金鲈 2.6(0.3) 生长研究Ruchimat 等(1997a)
a用蛋白质百分比表示的需求量
b圆括号内为半胱氨酸含量
c见表3.4，用b标注
3.4.6.2 半胱氨酸替换价值
正如上面所表示的，日粮中半胱氨酸能够减少鱼类最大生长所需的蛋氨酸。
3.4.6.3 其他含硫氨基酸的利用
3.4.7 芳香氨基酸需求量
3.4.7.1苯丙氨酸需求量
苯丙氨酸和酪氨酸的关系与蛋氨酸和半胱氨酸的关系相似，是两种重要的芳香氨基酸。酪氨酸被认为是非必需氨基酸是因为鱼类可以用必需氨基酸苯丙氨酸合成酪氨酸。如果日粮中含有酪氨酸，可以减少日粮中苯丙氨酸的需求量。因此，鱼类有一个总的芳香氨基酸需求量。
鱼类苯丙氨酸或总的芳香氨基酸需求量值见表3.11。
3.4.7.2 酪氨酸替换价值
由于鱼类新陈代谢需要苯丙氨酸和酪氨酸，并且苯丙氨酸仍需要满足鱼体的需要，只有一定部分的苯丙氨酸能够转换成酪氨酸，所以测定日粮中酪氨酸能够提供多少总的芳香氨基酸需求量就很重要了。
表3.11 苯丙氨酸或总的芳香氨基酸需求量
鱼类需求量a根据出处大西洋鲑 5.8 理想蛋白质Rollin(1999)
印度鲤 6.2 生长研究Ravi 和Devaraj(1991) 斑点叉尾鮰 5.0 生长研究Robinson 等(1980a)
大鳞大麻哈鱼 5.1 生长研究Chance 等(1964) 大麻哈鱼 6.3 生长研究Akiyama 和Arai(1993)
杂交胡鲇 4.0 理想蛋白质Unprasert(1994)
银大麻哈鱼 4.5 生长研究Arai 和Ogata(1993) 鲤 6.5 生长研究Nose(1979)
4.9 蛋白质添加物Ogino(1980)
欧洲海鲈 2.6 A/E比率b Kaushik(1998)
金头鲷 2.9 A/E比率Kaushik(1998)
日本鳗鲡 5.8 生长研究Arai(Nose,1979)
比目鱼 3.8 A/E比率Forster 和ogata(1998) 遮目鱼 5.2 生长研究Borlongan(1992) 尼罗罗非鱼 5.5 生长研究Santiago 和Lovell(1988) 虹鳟 4.3 生长研究Kim(1993)
5.2 蛋白质添加物Ogino(1980)
似石首鱼 4.5 A/E比率Moon 和Gatlin(1991) 红海鲷 4.1 A/E比率Forster 和Ogana(1998) 大菱鲆 5.3 A/E比率Kaushik(1998)
白鲟 5.3 蛋白质添加物Ng 和Hung(19945)
a 用蛋白质百分比表示的需求量
b 见表3.4，用b标注
3.4.8 苏氨酸需求量
鱼类苏氨酸需求量值概括在表3.12中。
表3.12 苏氨酸需求量
鱼类需求量a根据出处大西洋鲑 3.2 理想蛋白质Rollin(1999)
印度鲤 5.0 生长研究Ravi 和Devaraj(1991) 斑点叉尾鮰 2.0 生长研究Wilson 等(1978) 大鳞大麻哈鱼 2.2 生长研究DeLong 等(1962) 大麻哈鱼 3.0 生长研究Akiyama 等(1985a) 杂交胡鲇 2.8 理想蛋白质Unprasert(1994)
银大麻哈鱼 2.0 生长研究Arai 和Ogata(1993) 鲤 3.9 生长研究Nose(1979)
3.3 蛋白质添加物Ogino(1980)
欧洲海鲈 2.6-3.0 生长研究Tibaldi 和Tulli(1999)
2.7 A/E比率b Kaushik(1998)
金头鲷 2.8 A/E比率Kaushik(1998) 杂交斑纹鲈 2.6 生长研究Keembiyehetty 和
Gatlin(1997)
日本鳗鲡 4.0 生长研究Arai(Nose,1979)
比目鱼 2.3 A/E比率Forster 和Ogata(1998)
遮目鱼 4.5 生长研究Borlongan(1991) 尼罗罗非鱼 3.8 生长研究Santiago 和Lovell(1988) 虹鳟 3.4 蛋白质添加物Ogino(1980)
3.2-3.7 生长研究Rodehutscord 等(1995)
似石首鱼 2.8 A/E比率Moon 和Gatlin(1991)
2.3 生长研究Boren 和Gatlin(1995)
红海鲷 1.8 A/E比率Forster 和Ogata(1998)
Rohu 4.3 生长研究Murthy 和Varghese(1996) 大菱鲆 2.9 A/E比率Kaushik(1998)
白鲟 3.3 生长研究Ng 和Hung(1995)
a 用蛋白质百分比表示的需求量
b 见表3.4，用b标注
3.4.9 色氨酸需求量
鱼类色氨酸需求量值见表3.13。研究的各种鱼类的色氨酸需求量大约为蛋白质的0.5%-1%。
表3.13 色氨酸需求量
鱼类需求量a根据出处
印度鲤 1.0 生长研究Ravi 和Devaraj(1991) 斑点叉尾鮰0.5 生长研究Wilson 等(1978)
大鳞大麻哈鱼0.05 生长研究Halver(1965) 大麻哈鱼0.7 生长研究Akiyama 等(1985a)
杂交胡鲇0.6 理想蛋白质Unprasert(1994)
银大麻哈鱼0.5 生长研究Halver(1965)
0.5 生长研究Arai 和Ogata(1993)
鲤0.8 生长研究Nose(1979)
0.3 生长研究Dabrowski(1981)
0.6 蛋白质添加物Ogino(1980)
欧洲海鲈0.6 A/E比率b Kaushik(1998)
金头鲷0.6 生长研究Luquet 和Sabaut(1974)
0.6 A/E比率Kaushik(1998)
日本鳗鲡 1.1 生长研究Arai(Nose,1979)
比目鱼0.5 A/E比率Forster 和ogata(1998) 遮目鱼0.6 生长研究Coloso 等(1992) 尼罗罗非鱼 1.0 生长研究Santiago 和Lovell(1988) 虹鳟0.5 生长研究Walton 等(1984a)
0.6 生长研究Kim 等(1987)
1.4 生长研究Poston 和Rumsey(1983)
0.5 蛋白质添加物Ogino(1980)
似石首鱼0.8 A/E比率Moon 和Gatlin(1991) 红海鲷0.6 A/E比率Forster 和Ogata(1998)
Rohu 0.6 生长研究Khan 和Jafri(1993) 红大麻哈鱼0.5 生长研究Halver(1965) 大菱鲆0.6 A/E比率Kaushik(1998)
白鲟0.3 蛋白质添加物Ng 和Hung(1995)
a 用蛋白质百分比表示的需求量
b 见表3.4，用b标注
3.4.10 赖氨酸在鱼类和其它动物中的利用比较
测定的赖氨酸在鱼类和其它动物中的利用比较见表3.14。
表3.14 赖氨酸在鱼类和其它动物中的利用比较
参数斑点叉尾鮰Broiler鸡a猪b
规格10-40g 360-725g 1-5kg
生长率（克/天）0.5 26 200
赖氨酸需求量（日粮蛋白质的百分比） 5.0 5.7 5.8
赖氨酸利用率（生长克数/消化的赖氨酸克数）60.6 48.3 57.1
a NRC(1977)计算数据
b NRC（1988）计算数据
3.4.11 对虾的氨基酸需求量
最近成功地完成了对虾的氨基酸需求量的测定（表3.15）。以前缺乏在虾慢慢消耗饲料的过程中可以抵抗水浸的稳定饲料。1992年，Chen等利用一种微胶囊饲料测定出了精氨酸的需求量。这种纯氨基酸混合物最初涂上一层羟甲基纤维素明胶然后再涂上一层k-角叉胶，形成一种均质凝胶添加到已配好的饲料混合物中。
表3.15 根据生长研究的对虾氨基酸需求量
氨基酸需求量a物种参考
精氨酸 5.3 Penaeus monodon Millamena 等(1998)
5.5 Penaeus monodon Chen 等(1992)
组氨酸 2.2 Penaeus monodon Millamena 等(1999) 异亮氨酸 2.7 Penaeus monodon Millamena 等(1999)
亮氨酸 4.3 Penaeus monodon Millamena 等(1999)
赖氨酸 5.2 Penaeus monodon Millamena 等(1998)
3.1 Penaeus vannamei Akiyama(1986)
4.5-
5.2 Penaeus vannamei Fox 等(1998)
蛋氨酸 3.5 Penaeus monodon Millamena 等(1996a) 苯丙氨酸7.7 Penaeus monodon Millamena 等(1999)
苏氨酸 3.5 Penaeus monodon Millamena 等(1997)
色氨酸0.5 Penaeus monodon Millamena 等(1999)
缬氨酸 3.4 Penaeus monodon Millamena 等(1996b) a用蛋白质的百分比表示的需求量
3.5 测定氨基酸需求的其它方法
某些鱼类的必需氨基酸需求量和那种鱼的全鱼体组织必需氨基酸模式有关（Cowey和Tacon,1983;Wilson和Poe,1985）。
3.5.1 全鱼体组织和鱼卵的氨基酸组成
某些鱼类的全鱼体组织氨基酸组成见表3.16。一个特定的组织的必需氨基酸组成在各鱼类间保存相似并且不受如水温、投喂率和鱼体规格等因子的影响。1998年，Kaushik同样报道了两种不同规格种类的欧洲海鲈、金头鲷和比目鱼的
全鱼体氨基酸组成没有明显的差异，与规格或种类无关。
一般地，鱼卵氨基酸组成比表3.16中概括的全鱼体氨基酸组成变化更大。
表3.16 某些鱼类全鱼体组织的氨基酸组成a
氨基酸虹鳟b大西洋鲑b银大麻哈鱼c马苏大麻哈鱼d斑点叉尾鮰e 丙氨酸 6.57 6.52 6.08 6.35 6.31 精氨酸 6.41 6.61 5.99 6.23 6.67 冬氨酸9.94 9.92 9.96 9.93 9.74 半胱氨酸0.80 0.95 1.23 1.34 0.86 谷氨酸14.22 14.31 15.25 15.39 14.39 甘氨酸7.76 7.41 7.31 7.62 8.14 组氨酸 2.96 3.02 2.99 2.39 2.17 异亮氨酸 4.34 4.41 3.70 3.96 4.29 亮氨酸7.59 7.72 7.49 7.54 7.40 赖氨酸8.49 9.28 8.64 8.81 8.51 蛋氨酸 2.88 1.83 3.53 3.14 2.92 苯丙氨酸 4.38 4.36 4.14 4.63 4.14 脯氨酸 4.89 4.64 4.76 4.33 6.02 丝氨酸 4.66 4.61 4.67 4.48 4.89 苏氨酸 4.76 4.95 5.11 4.63 4.41 色氨酸0.93 0.93 1.40 0.83 0.78 酪氨酸 3.38 3.50 3.44 3.58 3.28 缬氨酸 5.09 5.09 4.32 4.85 5.15 a用g/100g氨基酸表示
b 数据来自Wilson和Cowey(1985)
c数据来自Arai(1981)
d 数据来自Ogata等(1983)
e 数据来自Wilson和Poe(1985)
3.5.2 组成量和需求量的关系
根据在其它动物中的观察，Cowey和Tacon（1983）表示一种鱼的必需氨基
第三章 蛋白质
3．氨基酸和蛋白质 罗勃特 P.威尔逊 3.1 简介 蛋白质约占鱼类干重的65-75%。鱼类不断利用氨基酸形成新的蛋白质或者替代已有的蛋白质。如果日粮中蛋白质含量过多，只有一部分将被用于形成新的蛋白质，其余的将被转变成能量。 最初的氨基酸实验日粮是根据鸡全卵蛋白、大鳞大麻哈鱼卵蛋白和大鳞大麻哈鱼卵黄蛋白来表示的。根据鸡全卵蛋白氨基酸组成配置的氨基酸实验日粮被用来测定大鳞大麻哈鱼氨基酸定性需求。 3.2 蛋白质需求 3.2.1 总需求 3.2.1.1 有鳍鱼 像其它动物一样，鱼类没有真实的蛋白质需求量，但是需要必需氨基酸和非必要或非必需氨基酸之间很好的平衡。测定的几种鱼类幼鱼的蛋白质需求量总结在表格3.1中。由于没有充分考虑下面这些因素：(a)日粮能量含量(b)日粮蛋白质的氨基酸组成(c)日粮蛋白质的消化，所以一些需求量值估计过高。 同其它动物一样，鱼类最理想的日粮蛋白质水平受到能蛋比平衡，氨基酸组成，测试蛋白的消化，和非蛋白能量来源的影响。实验日粮中能量过量会限制饲料的消耗，像其它动物一样，鱼类摄食是为满足能量需求。在许多鱼类中许多饲料原料的可代谢能量还没有被测定，研究者运用生理燃料值来表示蛋白质需求和日粮能量水平的关系。 表3.1中的数据表明鱼类的蛋白质需求量比其它脊椎动物更高（两到四倍）。用饲料摄入量（每千克体重每天摄入蛋白质克数）和活体重增加（每千克活体重所获得的蛋白质克数）表示时，鱼类的日粮蛋白质需求量并不与其它脊椎动物不同。 3.2.1.2 甲壳纲动物 研究的许多甲壳纲动物的蛋白质需求量很高，范围为日粮干重的30%到60%（表3.3）。这些测定的数据有些估计过高了。甲壳纲动物营养研究很复杂。一些生物体在消化之前同样弄碎食物粒子，这可能会增强消化使得饲料消耗测定很
植物蛋白质提取方法总汇
植物蛋白质提取方法总汇 一、植物组织蛋白质提取方法 1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入)，准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4小时)。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清液，样品制备完成。蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml 2、甘油(Glycerol)75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法 氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇)，摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时)，然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心(15℃8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准)，可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS 溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml)，使用前再加入1M的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！ 三、组织：肠黏膜 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：(1.5ml每1mlTRIPURE用量) 倒转混匀，置室温10min
第三章 蛋白质化学习题--生化习题及答案
第三章蛋白质化学 一、单项选择题 1．蛋白质分子的元素组成特点是 A．含大量的碳B．含大量的糖C．含少量的硫D．含少量的铜E．含氮量约16% 2．一血清标本的含氮量为5g/L，则该标本的蛋白质浓度是 A．15g/L B．20g/L C．31/L D．45g/L E．55g/L 3．下列哪种氨基酸是碱性氨基酸？ A．亮氨酸B．赖氨酸C．甘氨酸D．谷氨酸E．脯氨酸 4．下列哪种氨基酸是酸性氨基酸？ A．天冬氨酸B．丙氨酸C．脯氨酸D．精氨酸E．甘氨酸 5．含有两个羧基的氨基酸是 A．丝氨酸B．苏氨酸C．酪氨酸D．谷氨酸E．赖氨酸 7．在pH7.0时，哪种氨基酸带正电荷？ A．精氨酸B．亮氨酸C．谷氨酸D．赖氨酸E．苏氨酸 8．蛋氨酸是 A．支链氨基酸B．酸性氨基酸C．碱性氨基酸D．芳香族氨酸
E．含硫氨基酸 9．构成蛋白质的标准氨基酸有多少种？ A．8种B．15种 C．20种D．25种 E．30种 10．构成天然蛋白质的氨基酸 A．除甘氨酸外，氨基酸的α碳原子均非手性碳原子 B．除甘氨酸外，均为L-构型C．只含α羧基和α氨基D．均为极性侧链E．有些没有遗传密码11．天然蛋白质中不存在的氨基酸是 A．瓜氨酸B．蛋氨酸 C．丝氨酸D．半胱氨酸 E．丙氨酸 12．在中性条件下大部分氨基酸以什么形式存在？ A．疏水分子B．非极性分子 C．负离子D．正离子 E．兼性离子 13．所有氨基酸共有的显色反应是 A．双缩脲反应B．茚三酮反应 C．酚试剂反应D．米伦反应 E．考马斯亮蓝反应 14．蛋白质分子中的肽键 A．氨基酸的各种氨基和各种羧基均可形成肽键 B．某一氨基酸的γ-羧基与另一氨基酸的α氨基脱水形成 C．一个氨基酸的α-羧基与另一氨基酸的α氨基脱水形成 D．肽键无双键性质 E．以上均不是 15．维持蛋白质分子一级结构的化学键是 A．盐键B．二硫键 C．疏水键D．肽键
第三章 蛋白质化学期末复习样题
第三章蛋白质化学样题 一、选择题 1.蛋白质分子的一级结构概念主要是指（） A、组成蛋白质多肽链的氨基酸数目。 B、氨基酸种类及相互比值。 C、氨基酸的排列顺序。 D、二硫键的数目和位置。 2.下列何种结构不属蛋白质分子构象（） A、右手双螺旋 B、α-螺旋 C、β-折叠 D、β-转角 3. 在蛋白质三级结构中可存在如下化学键，但不包括（） A、氢键 B、二硫键 C、离子键 D、磷酸二酯键 4. 下列关于蛋白质四级结构的有关概念，何者是错误的（） A、由两个或两个以上亚基组成。 B、参与形成四级结构的次级键多为非共价键。 C、所有蛋白质分子只有具有四级结构，才表现出生物学活性。 D、组成四级结构的亚基可以是相同的，也可以是不同的。 5. 蛋白质变性是由于（） A、蛋白质一级结构的改变 B、组成蛋白质的共价键发生变化 C、蛋白质空间构象的破坏 D、辅基的脱落 6. 维系蛋白质一级结构的化学键（） A、盐键 B、肽键 C、氢键 D、分子间作用力 7. 对具有四级结构的蛋白质进行一级结构分析时（）
A、只有一个自由的α-氨基和一个自由的α-羧基。 B、只有自由的α-氨基，没有自由的α-羧基。 C、有一个以上的自由α-氨基和α-羧基。 D、既无自由的α-氨基，也无自由的α-羧基。 8. 蛋白质分子中的α-螺旋和β片层都属于（） A、一级结构 B、二级结构 C、三级结构 D、四级结构 9. 维系蛋白质分子中α-螺旋的化学键是（） A、肽键 B、离子键 C、二硫键 D、氢键 10. α-螺旋每上升一圈相当于几个氨基酸（） A、2.5 B.2.7 C.3.0 D、3.6 11. 谷氨酸的等电点是3.22，下列描述正确的是（） A、谷氨酸是碱性氨基酸 B、谷氨酸是酸性氨基酸 C、谷氨酸在pH=7的溶液中带正电荷 D、谷氨酸分子中含有一个氨基和一个羧基 12. 肽键是（） A、属于维系蛋白质二级结构的重要化学键 B、属于次级键 C、可以自由旋转 D、由肽键形成的肽平面包含了6个原子 13. 关于蛋白质二级结构的描述正确的是（） A、属于蛋白质的空间构象
3第三章蛋白质、脂肪、糖、水(文字)
幼儿需要的营养素之一————蛋白质 教学目的：掌握蛋白质的功能，人体对蛋白质的需要量与摄入量，蛋白质不足对机体的影响，提高蛋白质的营养措施，蛋白质的食物来源。 教学重点：蛋白质的功能教学难点：如何提高蛋白质营养 教学教程：复习营养素的分类 新授：蛋白质 （一）蛋白质：如果把人体当作一座建筑物，那么蛋白质就是这座大厦的建筑材料，所发说蛋白质是一切生命的物质基础，是人体组织更新和修补的生要原料，没有蛋白质就没有生命。为什么没有蛋白质就没有生命让我们来了解一下它的生理功能。 1、蛋白质的生理功能： （1）构成组织，修补组织工作：（构造了人的身体） 它是构成人体细胞和组织工作的生要成分，是主要原料（如血液、肌肉、神经、毛发、皮肤等都是由蛋白质组成的，） 另外，人的身体有数亿万计的细胞组成，细胞又处于不停息的衰老、死亡、新生的代谢过程中。如青年人表皮28天更新一次，胃粘膜三天更新，红细胞120天更新一次。 头发、指甲也在不断推陈出新。 （2）、调节生理功能（神经与体液，其中体液由激素来调节，激素由蛋白质构成，其此蛋白质还构成了人体内新陈代谢过程中起催化作用的酶，所以人体中许多具有重要生理作用的物质都是由蛋白质构成的。 （3）、增强抵抗力，保护人体机制的抗体就是各种蛋白质，或由蛋白质衍生而成的物质。 如运输功能：人体内氧气和二氧化碳的运输是通过血红蛋白来完成的。 （4）、供给能量：当食物蛋白质的氨基酸组成和比例来符合人体需要、或蛋白质过多，就会被当作能量来源氧化分解放出热量。 2、蛋白质的组成和营养价值 有20多种氨基酸组成：必需氨基酸8种，不能自行合成，必须由食物供给非必需氨基酸，能自行合成,幼儿生长发育需9种必须氨基酸，那9种请看书。 蛋白质营养价值的高低决定于氨基酸的种类、数量、比例是否符合人体的需要。 动物蛋白质所含的和种类、数量、比例都较接近人体蛋白，容易被人体吸收，称为优质蛋白质。如乳类、蛋、肉、鸡、鸭、鱼等。 植物类蛋白质因种类不全，营养价值低，属非优质 3、如何提高蛋白质的互补？（如何提高蛋白质的营养措施） 将几种营养价值较低的植物蛋白质混合食用，使所含氨基酸种类、含量得以互相补充，从而提高混合食物的营养价值，称为蛋白质的互补作用。 组织幼儿膳食时如何做到蛋白质的互补？ 注意食物种类多样化的膳食营养结构，避免偏食，在膳食中提倡粮、豆、菜混食，粗、细粮混合等调配方法。 1、蛋白质的食物来源：动物性食物：乳类、蛋、肉、鸡、鸭、鱼 植物性食物：豆类、谷类、干果类。 2、幼儿蛋白质的需要量 因幼儿生长构成新组织的需要，所需的蛋白质比成人多，尤其是优质蛋白质，幼儿的每日需要量3——3、5克。占所需蛋白质总量的50%较为理想。 常用食物中，每100克中：肉类含蛋白质10——20克，鱼15——20克，豆类20——30克，谷类8——12克 3、蛋白质不足对机体的影响：生长发育迟缓，体重过轻，抵抗力下降，甚至影响智力。
蛋白质组学在植物科学研究中的应用
蛋白质组学在植物科学研究中的应用 1. 植物群体遗传蛋白质组学 1.1遗传多样性蛋白质研究 基于基因组学的一些遗传标记，如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)、SSR(Simple Sequence Repeat)、ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)等，已经广泛地应用于植物遗传研究中。与基因组学的遗传标记相比，由于蛋白质组学的研究对象是基因表达的产物，是介于基因型和表型之间的特性，因而蛋白质组学标记是联系基因多样性和表型多样性的纽带，具有独特的意义。 通过蛋白质组比较来检测遗传多样性的变化已有许多成功的尝试。Barrenche等(1996年)比较了6个欧洲国家的23种橡树，分析了幼苗的总蛋白质，共得到530种蛋白质，其中101个具有多态性。实验结果显示种内和种间的距离非常接近，并且证实无梗花栎(Quercus petraea)和夏栎(Quercus robar)两个种的遗传分化水平很低。Picard等(1997年)利用2D-PAGE 分析了亲缘关系很近的硬粒小麦不同株系的遗传多样性，发现品系间的多态性很低并且7个蛋白可以用于基因型的鉴定。David等(1997等)也利用2D-PAGE技术比较了栽培于不同环境下但起源于同一种群的小麦，结果所有的种群都与原种群有差别，David等认为，这不是由随机漂移引起，而是由适应其各自的气候条件而形成。 1.2 突变体的蛋白质组学研究 突变体研究是植物遗传学的重要研究手段之一，应用蛋白质组学的方法对基因突变引起的蛋白质表达变化进行研究可以揭示一些植物生理生态过程的机制。具体做法通常是对在相同条件下栽培的突变体及野生型植物的2D-PAGE图谱进行比较，受到影响的蛋白质通过质谱法或Edman测序法进行鉴定，为研究表型突变背后的生化过程提供有价值的信息。
第三章 蛋白质化学
第三章蛋白质化学 一、填空题 1.氨基酸的等电点(pI)是指________________。 2.氨基酸在等电点时，主要以________________离子形式存在，在pH>pI的溶液中，大部分以________________离子形式存在，在pH 第三章（蛋白质）习题 一、选择题 1．组成蛋白质的基本单位是： a．L—。—氨基酸b．D—。—氨基酸 c．L—p—氨基酸d．D—p—氨基酸 e．以上都不对 2．关于下列氨基酸的说明，哪个是不正确的： a．酪氨酸和苯丙氨酸都含有苯环 b．苏氨酸和丝氨酸都含有羟基 c．亮氨酸和缬氨酸都是分枝氨基酸 d．脯氨酸和酪氨酸都是非极性氨基酸 e．组氨酸和色氨酸都是杂环氨基酸 3．下列哪种氨基酸溶液不能引起偏振光的旋转? a．丙氨酸b．甘氨酸c．亮氨酸 d．丝氨酸e．缬氨酸 4．属于亚氨基酸的是： a．组氨酸b．脯氨酸c．精氨酸 d．赖氨酸e．蛋氨酸 5．下列氨基酸在生理pH范围内缓冲能量最大的是：a．Gly b His c．Cys d．Asp e．Glu 6．哪一种蛋白质组分在280nm处，具有最大的光吸收? a．色氨酸的吲哚环b．酪氨酸的苯酚基 c．苯丙氨酸的苯环d．半胱氨酸的巯基 e．肽链中的肽键 7．有一混合蛋白质溶液，其pI值分别为4.6、5.0、5.3、6.7、7.3，电泳时欲使其中四种泳向正极，缓冲液pH应该是多少? a．4．0 h．5．0 c．6．0 d．7．0 e．8．0 8．与茚三酮反应呈黄色的氨基酸是： a．苯丙氨酸b．酪氨酸c．色氨酸 小组氨酸e．脯氨酸 9．关于蛋白质构象的下列描述，其中正确的是： a．指手性碳原子上某一原子或基团的方位 b．指几何异构体中顺式或是反式 c．指多肽链中一切原子(基团)随。—碳原子旋转，盘曲面产生的空间排布 d．指原子或基团改变涉及共价键的生成或断开 e．不涉及蛋白质分子中次级键的断裂与生成 10．维持蛋白质二级结构的主要化学键是： a．盐键b．疏水键c．二硫键 d．氢键e．范德华力 11．蛋白质的构象特征主要取决于： a．氨基酸的组成、顺序和数目 b．氢键、盐键、范德华力和疏水力 c．温度、pH和离子强度等环境条件 d．肽链间及肽链内的二硫键 e．各氨基酸之间的肽键 实验8 植物组织中可溶性蛋白质含量的测定 Ⅰ．斐林-酚试剂法 [原理] 斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应， 其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。由于肤键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。该法适于微量蛋白的测定(范围为5～l00μg蛋白质)。 [材料、仪器设备及试剂] (一)材料各种植物材料。 (二)仪器设备 722分光光度计，离心机，恒温水浴，定量加样器，冷凝回流装置一套，研钵，离心管，刻度移液管，微量滴定管，试管等。 (三)试剂 (1)0．5mol／L Na0H。 (2)斐林-酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成： A液：4％碳酸钠(Na2C03)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(Na0H)溶液等体积混合。 B液：1％硫酸铜(CuS04·5H20)溶液与2％酒石酸钾钠溶液等体积混合。 使用前将A与B按50:1的比例混合即成，此试剂只能在使用当天配制。 (3)斐林-酚试剂乙液：称取钨酸钠(Na2W04。H20)100g，钼酸钠 (Na2Mo04·2H20)25g，加蒸馏水700ml溶解于1500mL的圆底烧瓶中。之后加入85％的H3PO450mL，浓Hcl 100 mL，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10h。冷却后加入硫酸锂（Li2SO4.H2O）150g,蒸馏水50ml，溴水2-3滴，打开瓶口煮沸15min，以逐出过量的溴，冷却后溶液呈黄色（若仍绿色，须再滴加几滴溴水，继续煮沸15min）。待冷却后稀释至1000ml，过滤入棕色瓶中保存。使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L酸度。 因此在使用前应进行标定。标定方法：取5ml福林-酚试剂乙液放入锥形瓶内，用1mol/L标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞作指示剂，当溶液突然转红再转灰绿时，即为滴定终点。计算其相当的酸度，用盐酸或氢氧化钠溶液调至相当于1mol/L 的酸度。在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性稳定，但此实验的瓜只在pH≠10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。 第三章蛋白质化学 1蛋白质：是一类生物大分子，由一条或多条肽链构成，每条肽链都有一定数量的氨基酸按一定序列以肽键连接形成。蛋白质是生命的物质基础，是一切细胞和组织的重要组成成分。2标准氨基酸：是可以用于合成蛋白质的20种氨基酸。 3、茚三酮反应：是指氨基酸、肽和蛋白质等与水合茚三酮发生反应，生成蓝紫色化合物，该化合物在570mm波长处存在吸收峰。 4、两性电解质：在溶液中既可以给出H+而表现出酸性，又可以结合H+而表现碱性的电解质。 5、兼性离子：即带正电和、又带负电荷的离子。 6、氨基酸的等电点：氨基酸在溶液中的解离程度受PH值影响，在某一PH值条件下，氨基酸解离成阳离子和阴离子的程度相等，溶液中的氨基酸以兼性离子形式存在，且净电荷为零，此时溶液的PH值成为氨基酸的等电点。 7、单纯蛋白质：完全由氨基酸构成的蛋白质。 8、缀合蛋白质：含有氨基酸成分的蛋白质。 9、蛋白质的辅基：缀合蛋白质所含有的非氨基酸成分。 10、肽键：存在于蛋白质和肽分子中，是由一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基缩合时形成的化学键。 11、肽平面：在肽单元中，羧基的π键电子对与氮原子的孤电子对存在部分共享，C-N键具有一定程度的双键性质，不能自由旋转。因此，肽单元的六个原子处在同一个平面上，称为肽平面。 12、肽：是指由两个或者多个氨基酸通过肽键连接而成的分子。 13、氨基酸的残基：肽和蛋白质分子中的氨基酸是不完整的，氨基失去了氢，羧基失去了羟基，因而称为氨基酸的残基。 14、多肽：由10个以上氨基酸通过肽键连接而成的肽。 15、多肽链：多肽的化学结构呈链状，所以又称多肽链。 16、生物活性肽：是指具有特殊生理功能的肽类物质。它们多为蛋白质多肽链的一个片段，当被降解释放之后就会表现出活性，例如参与代调节、神经传导。食物蛋白质的消化产物中也有生物活性肽，他们可以被直接吸收。 17、谷胱甘肽：由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键连接构成的酸性三肽，是一种生物活性肽，是机体重要的抗氧化剂。 18、蛋白质的一级结构：通常叙述为蛋白质多肽链中氨基酸的连接顺序，简称氨基酸序列。蛋白质的一级结构反映蛋白质分子的共价键结构。 19、蛋白质的二级结构：是指蛋白质多肽链局部片段的构象，该片段的氨基酸序列是连续的，主链构象通常是规则的。 20、蛋白质的超二级结构：又称模体、基序，是指几个二级结构单元进一步聚集和结合形成的特定构象单元，如αα、βαβ、ββ、螺旋-转角-螺旋、亮氨酸拉链等。 21、蛋白质的三级结构：是指蛋白质分子整条肽链的空间结构，描述其所有原子的空间排布。蛋白质的三级结构的形成是肽链在二级结构基础上进一步折叠的结果。 22、蛋白质的结构域：许多较大（由几百个氨基酸构成）蛋白质的三级结构中存在着一个或多个稳定的球形折叠区，有时与分子的其他部分之间界限分明，可以通过对多肽的适当酶切与其他部分分开，这种结构成为结构域。 23、蛋白质的亚基：许多蛋白质分子可以用物理方法分离成不止一个结构单位，每个结构单位可以由不止一条台联构成，但特定且相对独立的三级结构，且是一个由共价键连接的整体，该结构单位称为蛋白质的亚基。 第五章植物蛋白质 目前，人类在对蛋白质代谢的研究和认识过程中，逐步得出了以下四个方面的结论：（1）任何生物细胞并不会合成全部自身遗传信息中所具有的蛋白质。但那些维持细胞生命活动基本代谢过程所需要的酶和蛋白质是必须合成的。 （2）由于细胞分化作用导致了各种专业化细胞的生成，使得不同的生物细胞所拥有的蛋白质各不相同，而且细胞的专业化可导致某些基本酶和蛋白质的合成终止。例如，在种子中，专门贮存蛋白质的细胞所含有的蛋白质，在叶片细胞中就没有；反之，在叶片细胞中专门进行光合作用的蛋白质在种子中也不存在。 （3）在一个细胞内，其合成和拥有的蛋白质种类，将随着生物的生长发育过程而发生一定的变化。例如，同工酶谱的变化。 （4）由人类DNA测序结果可知，真核生物基因不是一个基因决定一种蛋白质多肽链。由于DNA转录产物RNA可剪接和编辑，因而一个基因可以编码两条以上蛋白质多肽链。 第一节种子贮存蛋白质 人们通常将植物在某发育阶段合成、需保存到另一发育阶段才能发挥作用的蛋白质称为贮存蛋白质（storage proteins）。典型的贮存蛋白质一般都具有水溶性低、细胞中存在量大和脱水状态下几乎无生物活性的特征。 在粮食作物中最重要的种子贮存蛋白主要有两种，即谷类作物种子蛋白和豆类作物种子蛋白。 一、谷类作物种子蛋白 禾谷类种子的胚乳除含有大量淀粉外，还含有许多蛋白质。虽然胚中的蛋白质含量很高，但由于胚比胚乳小得多，所以从种子蛋白的总量上看，大部分蛋白质存在于胚乳中。 禾谷类种子蛋白质的分离提取通常按溶解性不同分为四个组分，即清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。其中清蛋白可溶于水；球蛋白则溶于稀盐溶液中。由于这两种蛋白在胚乳中含量较少，所以，有人认为它们可能是种子形成过程中酶蛋白的剩余物，并不是典型的种子贮存蛋白。 禾谷类种子中的蛋白质含量因品种、气候和栽培条件而异，其主要谷类蛋白质含量变化幅度见表1。 由表1可见，燕麦与其它谷物不同，其主要贮存蛋白是一种球蛋白。这种球蛋白由6条α-链和6条β-链组成，α-链分子量为22000Da，β-链分子量为32000Da。 用甲醇、乙醇、异丙醇提取的种子蛋白称为醇溶谷蛋白。它是大部分禾谷类作物种子中最主要的贮存蛋白，而且它常集中分布于一种专门用于贮存蛋白质的特化细胞器——蛋白体 第三章蛋白质化学 一、重点难点概述：学习要求：掌握蛋白质的概念和化学组成；掌握蛋白质的组成单位——氨基酸的结构和理化性质；掌握肽的概念和性质；掌握蛋白质的结构（包括初级结构和空间结构）及结构与功能的关系，掌握蛋白质和氨基酸的理化性质；了解蛋白质分析、分离和纯化的一般方法。 重点及难点：氨基酸的结构和性质；蛋白质的结构与功能的关系；蛋白质的分离纯化。 主要内容： 一、蛋白质的化学组成与分类 蛋白质：蛋白质（protein）是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸（Amino acid）按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。 （一）蛋白质的元素组成（二）蛋白质的基本单位——氨基酸（三）蛋白质的分类 二、蛋白质的大小与分子量 三、蛋白质的构象 四、蛋白质结构层次 五、蛋白质分子多样性 第二节蛋白质基本单位---氨基酸 一、蛋白质的水解 二、氨基酸的结构与分类 （一）基本氨基酸（20种）（二）修饰氨基酸（三）非蛋白质组分氨基酸 三、氨基酸的构型、旋光性和光吸收 (一) 氨基酸的构型（二）氨基酸的旋光性（三）氨基酸的光吸收性 四、氨基酸的酸碱性质 （一）氨基酸是两性电解质（二）氨基酸有特征滴定曲线（三）不同氨基酸的酸碱性质不同（四）氨基酸的甲醛滴定 五、氨基酸的化学反应 六、氨基酸的分离分析 （一）分配层析法分离氨基酸（二）分配柱层析（三）氨基酸的纸层析（四）氨基酸的薄层层析（五）氨基酸纸电泳（六）离子交换层析分离氨基酸 第三节蛋白质的共价结构 一、肽和键的结构 （一）肽键（二）肽键作为蛋白质主键的证据（三）肽键的特点（四）肽概念 二、肽的理化性质 （一）肽的物理性质：晶体的熔点很高（二）肽的解离（三）小肽的滴定及等电点确定 三、天然存在的活性肽 四、蛋白质一级结构举例 （一）胰岛素（二）核糖核酸酶的一级结构 五、蛋白质的氨基酸序列与生物功能 （一）同源蛋白质的种属差异与生物进化（二）同源蛋白质具有共同的进化起源 程彦伟,李建友,姜爱良,等.蛋白质组学在植物科学研究中的进展[J].江苏农业科学,2010(1):17-20. 蛋白质组学在植物科学研究中的进展 程彦伟1,2,李建友2,姜爱良2,齐耀程2,朱 倩2,赵 昕2,张 炜2 (1.洛阳师范学院生命科学系,河南洛阳471022;2.南京农业大学生命科学学院,江苏南京210095) 摘要:蛋白质组学是后基因组时代出现的一个新兴研究领域。随着模式植物拟南芥和水稻基因组测序完成,蛋白质组学已被广泛应用于植物研究的各个领域。本文综述了蛋白质组学在植物发育、逆境胁迫以及亚细胞水平的研究进展。 关键词:蛋白质组学;亚细胞水平;植物生长发育;逆境 中图分类号:Q946.1 文献标志码:A 文章编号:1002-1302(2010)01-0017-04 (上接第16页) [30]范世香,裴铁凡,迟振文.树干径流及林冠截留规律分析[J]. 辽宁林业科技,1992(1):54-57. 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[39]刘向东,吴钦孝,苏宁虎.六盘山林区森林树冠截留、枯枝落叶 层和土壤水文性质的研究[J].林业科学,1989,25(3):220-227. 近年来,随着模式植物拟南芥和水稻基因组测序完成,植物基因组研究己转入到功能基因组。目前一些研究功能基因组的新方法和试验技术体系如c D N A微阵列、D N A芯片、基因表达系统分析(s e r i a l a n a l y s i s o f g e n ee x p r e s s i o n,S A G E)和基因敲除(g e n e k n o c k o u t)均能有效分析大量基因的表达和功能模式,并取得了很大进展。但是基因功能的实现最终是以蛋白质形式体现的,核酸水平上的变化并不能确切反映其最终功能行使产物———蛋白质的变化;进一步而言,多种蛋白质合成之后要经过一定修饰(信号肽的切除、磷酸化修饰、糖基化修饰),以及亚细胞定位后才能发挥其功能[1]。因此有必要从蛋白质组水平上以及亚细胞水平上对细胞某一功能的实现机理进行研究。 1 蛋白质组学在植物发育中的应用 1.1 种子形成及萌发过程中的蛋白质组学研究 种子形成及萌发过程中,涉及到大量蛋白质的变化。前人已利用2-D电泳方法研究了大麦种子发育期间蛋白质组的变化。结果表明一些蛋白质如苹果酸脱氢酶在整个发育过程中均有表达,而其他蛋白质如抗坏血酸过氧化物酶和冷调节蛋白C o r14b分别与灌浆早期或成熟干燥阶段有关。 收稿日期:2009-05-20 基金项目:国家自然科学基金(编号:30400030);教育部新世纪优秀人才支持计划(编号:N C E T-05-0494)。 作者简介:程彦伟(1975—),男,河南清丰人,博士,讲师,主要从事植物逆境蛋白质组学研究。E-m a i l:c y w z t g@126.c o m。C o r14b蛋白质在种子成熟前干燥阶段出现,在成熟种子中含量最多,但在种子发芽期间降解,说明这个蛋白质在种子耐干性上具有一定作用。最值得关注的是发育过程中低分子量α-淀粉酶或胰蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂和参与抗氧化胁迫保护的酶大量积累。在整个灌浆时期α-淀粉酶或胰蛋白酶抑制剂表达量增加,而糜蛋白酶出现在发育晚期,这些抑制剂可能能够保护种子免遭昆虫危害[2]。 1.2 植物个体发育过程中的蛋白质组学研究 叶片是高等植物光合作用和蒸腾作用的主要位置,其功能的行使是植物产量和品质形成的重要基础。对水稻6个不同发育时期叶片蛋白质表达模式进行研究的结果表明,有49个蛋白质点在不同时期发生显著变化,质谱分析和数据库检索结果表明,中高丰度表达蛋白质随着水稻的生长,其累积量会稍微下降,而一些抗氧化蛋白质的累积量更是在水稻成熟早期显著降低[3]。 根在植物中行使多种重要功能,包括水分和营养吸收,合成氨基酸、植物碱、有机氮和植物激素等。Z h o n g等分离了水稻根中的蛋白,用考马斯亮蓝染色后得到292个蛋白点, 42个蛋白得到鉴定[4]。K o l l e r等结合2-D E和M u d P I T2种方法研究水稻根、叶和种子中的蛋白,一共发现了2528个不同的水稻蛋白,其中叶片蛋白1022个、根蛋白1350个[5]。目前,关于根发育过程中的细胞蛋白质组学已有相关研究,并鉴定到了多种蛋白质。这些蛋白质分别参与能量代谢、次生代谢、病害抵抗、贮藏、转运、信号传导、蛋白质合成、细胞结构形成以及细胞生长和分裂等过程[6-7]。相关结果还表明,发育 — 17 — 江苏农业科学 2010年第1期DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2010.01.017 一、植物蛋白质提取 1. TCA-丙酮法 （1）称量一定量的样品置于液氮预冷的研钵中，加少许PVPP，反复加液氮研磨至粉末。 （2）研磨好的样品用10 倍体积（w/V）的10%的TCA-丙酮溶液悬浮，加入0.1 M PMSF、 1 M DTT 至终浓度为1 mM PMSF、10mM DTT，超声5 分钟，于-20℃静置6 小时或 过夜后，4℃，20000g 离心15 分钟，弃上清。 （3）沉淀用10 倍体积于样品的丙酮溶液重悬浮，于-20℃静置1 小时后，4℃，20000g 离 心15 分钟，弃上清。 （4）重复步骤（3）一次。 （5）沉淀用10 倍体积于样品的乙醇/乙醚=1:1 洗，于-20℃静置1 小时后，4℃，20000g 离 心15 分钟，弃上清。 （6）重复步骤（3）一次。 （7）取出沉淀真空干燥约5 分钟，除尽有机溶剂。 （8）按10mg 干粉末加200 微升裂解液的比例，加入1 mM PMSF、10mM DTT，超声5 分钟，充分溶解1 小时，10℃，35000g 离心30 分钟，上清为所需的蛋白溶液。（9）用Bradford 法测定蛋白样品的蛋白浓度。 （10）蛋白样品溶液小量分装，-80℃保存。 注意事项： （1）TCA 有利于去除酚类色素等物质，但不利于蛋白的抽提，使用浓度不宜过高，在后 面丙酮处理中，尽量除去。 （2）蛋白样品保存：样品浓度不宜过高，建议将高浓度样品适度调整，为避免反复冻融 应分装保存，长期保存用-80℃，短期保存用-20℃。 （3）1M DTT：0.1542g DTT 用1ml MilliQ 水溶解，-20℃保存。 （4）0.1M PMSF：0.0174g PMSF 用1ml 异丙醇溶解，-20℃保存。 植物学报Chinese Bulletin of Botany 2009, 44 (4): 410?425, w w https://www.360docs.net/doc/01573280.html, doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2009.04.002 收稿日期: 2008-04-03; 接受日期: 2008-07-16 基金项目: 国家自然科学基金(No.30570932)、教育部新世纪优秀人才支持计划(No.NE CT-06-0327)和黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划项目(No.1152G015)* 通讯作者。E -mail: daishaojun@hotmail.c om .特邀综述. 植物蛋白质组学研究若干重要进展 喻娟娟1, 戴绍军1, 2* 1 东北林业大学生命科学学院林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040 2 哈尔滨师范大学生命科学与技术学院, 哈尔滨 150080 摘要 植物蛋白质组学近年来正从定性向精确定量蛋白质组学的方向发展。国际上近两年发表的约160篇研究论文报道了利用不断改进的双向电泳结合生物质谱技术、多维蛋白质鉴定技术, 以及包括双向荧光差异凝胶电泳、15N 体内代谢标记、同位素标记的亲和标签、同位素标记相对和绝对定量等在内的第2代蛋白质组学技术, 对植物组织(器官)与细胞器、植物发育过程和植物响应环境胁迫的蛋白质组特征, 以及植物蛋白质翻译后修饰和蛋白质相互作用等方面的研究成果。该文对上述报道进行总结, 综述了2007年以来植物蛋白质组学若干重要问题研究的新进展。 关键词 发育, 植物, 翻译后修饰, 定量蛋白质组学, 胁迫 喻娟娟, 戴绍军 (2009). 植物蛋白质组学研究若干重要进展. 植物学报 44, 410?425. 随着拟南芥(Arab idopsis thaliana )、水稻(Oryza sativa )和杨树(Populus trichocarpa )等植物全基因组序列测定的完成和基因组学研究的深入, 植物蛋白质组学研究已成为后基因组时代的热点之一。虽然与人类和酵母蛋白质组学相比, 植物蛋白质组学起步较晚, 但是自1997年第1篇植物蛋白质组学文章发表以来, 伴随着蛋白质组学技术体系的不断完善, 植物蛋白质组学发展迅速。近年来, 以水稻和拟南芥等模式植物为代表的多种植物组织(器官)的蛋白质表达谱分析相继完成, 并且植物发育和生殖过程中不同阶段的蛋白质组变化, 以及此过程中植物响应各种环境因子的差异表达蛋白质组也被大量报道。每年都有近百篇研究论文和关于该年度植物蛋白质组学研究进展的综述性文章发表(Canovas et al., 2004; Rossignol et al., 2006; Jorrin et al., 2007)。近两年, 国际上大约发表了160篇植物蛋白质组学方面的研究论文和50多篇综述, 这些文章报道的物种除了拟南芥和水稻以外, 还涉及以蒺藜苜蓿(Medicago truncatula )、大麦(Hordeum vulgare )和大豆(Glycine max )等为主的近 50个物种, 研究内容也涉及方法学、亚细胞蛋白质组、组织(器官)蛋白质组、植物响应胁迫蛋白质组、翻译后修饰蛋白质组和相互作用蛋白质组等多个方面(表1)。本文从上述几个方面综述了近两年来植物蛋白质组学的研究进展。 1 方法学 将双向电泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)与质谱(mass spectrometry, MS)联用仍然是目前进行植物蛋白质组学研究最常用的方法。同时, 在酵母和哺乳动物中建立并迅速发展的第2代蛋白质组学技术, 如多维蛋白质鉴定技术(multidimensional pro-tein identification technology, MudPIT)、双向荧光差异凝胶电泳(two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis, 2D-DIGE)、15 N 体内代谢标记(15N metabolic labeling)、同位素标记的亲和标签(isotope-coded affinity tag, ICAT)、同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute protein 一提取植物总蛋白（以植物花粉为例）： 1.三氯乙酸法（TCA）/丙酮(acetone)提取花粉总蛋白质 花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，用含10%TCA和1%DTT的acetone沉淀蛋白质，-20度2个小时(必要时过夜)，4度25000g离心20min后去上清，用含1%DTT的acetone溶液悬浮沉淀，-20度1个小时,再次离心去上清，将真空干燥的沉淀在等电聚焦缓冲液中(8M urea，20mmDTT,4%CHAPS,2%ampholyte,PH:3-10) 20度震荡1小时，20度25000g离心20min，收集上清，沉淀再次用IEF缓冲液离心收集上清，可为后续试验做准备。 2．苯酚（phenol）提取法 花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，添加1ml的phenol（tris 8.8 缓冲液）继续研磨5min,加提取缓冲液（0.1mol/L 8.8 Tr i s –HCl，5mmEDTA,20mmDTT,30%sucrose）。将样本转移至离心管中，4度震荡30min，25000g离心10min，将上层的phenol层转移进另一个试管，将下边的水相层加1ml的phenol（tris 8.8 缓冲液）及提取缓冲液，震荡，离心，将再次收集到的phenol与前边收集的混合，加5倍体积的0.1 M ammonium acetate in 100%methanol，在-20度震荡沉淀蛋白质，必要时过夜，4度 25000g离心10min，将沉淀用0.1 M ammonium acetate in 100%methanol及80% acetone各洗两次, 含10mmDTT的80% acetone再洗一次，在每一步中蛋白沉淀都要完全重悬— -20度震荡30min，4度 25000g离心20min，洗剂完成后，沉淀真空干燥，IEF buffer提取蛋白质，如方法1。3．直接IEF buffer提取蛋白质 直接IEF buffer提取蛋白质，花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，然后加入IEF buffer(8M尿素，20mmDTT,4%CHAPS，5mmEDTA，5mmTris base,2%ampholyte,PH:3-10).如方法1。 4．Tris-HCL缓冲液法 花粉在liquid nitrogen中研磨成粉末，加入Tris-HCL缓冲液（50mm,8.8,Tris-HCL, 5mmEDTA,20mmDTT,100mmKCL,2mmPMSF）,在融化后，混合液在4度放30min, 25000g离心20min,收集上清，对沉淀重新提取一次，将收集到的上清混合，用5倍体积的100%丙酮沉淀蛋白质，-20度孵育2h,离心后，用80%的丙酮洗剂沉淀2次，IEF buffer重悬沉淀，方法如1 5．利用Bradford试剂法估测提取的总蛋白浓度，并调整浓度行蛋白电泳，-80度保存。 本人翻译的，具体方法流程见附件原文。 ·04第三章(蛋白质)习题
植物组织中可溶性蛋白质含量的测定
生物化学第三章蛋白质化学名词解释
第三章植物蛋白质
第三章蛋白质化学
蛋白质组学在植物科学研究中的进展
植物蛋白质提取方法
植物蛋白质组学研究若干重要进展
植物总蛋白提取