实验四 小鼠精子畸形试验共16页文档
用小鼠精子畸形试验评价生物羊膜遗传毒性的研究
批号 ０００ ，规 格型 ４ ８１ 羊 膜 是人类 两 层胎膜 的 ｆ ， Ｉ常 羊膜薄 而透 明 ． 状 胬 内、角膜 溃疡穿 孔的修 复 （ 向层 Ｉ 无 【管 。 在光镜下可 分 为 ５晨 上 皮层、基底膜 、 密层 号 Ｚ ５× ） 血 致 Ｋ一 ５ 。 剂 ：０９ 氯化 钠注射 液 （Ｃ） ０ 甲醇 ，２ 伊 ２试 ． ％ Ｓ ，１％ ％ 纤维 母细 胞层和海绵 层 。羊膜主要 利用的 是基底膜 。基 １ 底幞是 无细 胞结构 的胶原组 织层 ．羊膜移 植是将羊 膜植 红染色液 ，环磷酰 胺 （ Ｐ 。 ｃ ） 片根 据创 面大 小的 要求 ，平 贴 于眼表 ，再 行缝合 ，受体 １ ． 器 ：Ｏｌｍｐ ｓ双 日屁微镜 （ｏ ｅ－１） ３仪 ｙ ｕ ｃ ｖｒ ８，手提 式压 ０ 周遍 的健 康结膜 组织 的新 生上皮 细胞 向羊膜移 行 ，两 ３ 力蒸汽 消毒 器，生 化培养箱 Ｌ 一５Ｂ，分析 天平 ，镊 ＲＨ １０ 周后 ，新生 上皮长 好 ，羊幞 自动 脱落。生 物羊膜 是取 用 子 剪 ７ 。 ］ 健 康剖富 产产女Ｉ 胎盘组 织 ，产 前 ｌ清 学检查按 照国家 Ｉ ＝ 的 ｆ Ⅱ ． ４动物 ：雄 性 昆 明种 小 鼠 （ － 吉，体 重 ２—５ ，山 ６８』】 ５３ｇ 相关标 准进行 ．排 除乙肝 、丙肝 、梅毒 及艾滋 痫 ，从 而 东 鲁抗医 药集团 有限公 司 ） 。 确 保原料 的腱康安 垒性 。生物 羊膜属植 入 ３ 医疗器械 １ 类 ． ５动物管理 ：动物 饲养 条件符 合 “ 实验 动物管 理条例 ” 应 从生物 、物理 ．化学等 方面 作必 要的质量控 ｛ ，以 保 要求 。 Ｉ ｊ ｌ Ｊ ｛产品 的安全性 因此 对羊膜 产品的 质量要 求是 ：无致 ｌ Ｅ 敏 、 刺激、无细 胞毒性 无遗传 毒性 ． 无 具合 适的 Ｐ 值 Ｈ 厚薄均 匀，具有 ・ 定的 韧性 。本研究就 是从 生物学 方面 评价 其是 舀Ｊ 遗传毒性 。具 体操 怍如下 ： 生
实验2-小鼠精子畸形试验-20121025
制
颈椎脱臼 处死小鼠 取双侧 附睾
片
3ml磷酸盐 剪碎附睾 缓冲液
擦镜纸 过滤
取悬液滴于 玻片上推片
甲醇固定5 分钟
伊红染色30分钟
（五）阅片
首先在低倍镜下选择背景清晰、精子分布 均匀、重叠较少的区域，然后在高倍镜下 观察结构完整的500个精子，计数其中畸 形的精子数。
五、结果分析与评价
精子畸形形态观察 无钩、香蕉形、无定形、双头、 胖头、 折尾、双尾 计算精子畸形的发生率（头部重叠或全部 重叠的精子、无尾精子不进行计数）。
注意鉴别制片过程中人为造成的精子损伤。
正常精子
胖头精子
双头精子
双尾精子
双尾精子
双尾精子
香蕉形精子
人类精子
Thanks!
四、操作步骤
（一）动物选择 （二）剂量与分组 （三）染毒与采样 （四）制片 （五）阅片
（四）制片
颈椎脱臼法处死小鼠，剪开腹腔，分离并摘取 双侧附睾，将附睾放入盛有约3ml磷酸盐缓冲液或 生理盐水的小平皿中，以眼科剪将附睾剪成小 块，用吸管将悬浮液轻轻吹打5～6次，静置3～ 5min，用四层擦镜纸滤除组织碎片，吸取此精子 悬液滴于清洁载玻片上，均匀推片，待玻片晾干 后用甲醇固定5min，干燥后（此时也可镜检观察 精子形态）再用1%的伊红醇溶液染色1～2h（或 30min），流水冲洗，晾干后镜检。
一、目的
精子畸形试验是检测受试化学毒物 能否破坏哺乳动物精子正常形态的 实验方法 通过该实验，学习和掌握小鼠精子 畸形试验的原理和步骤
二、原理
精子畸形是指精子的形状异常和异常精 子数量的增多; 生殖系统对化学毒物的作用十分敏感, 在其它系统还未出现毒性反应之前，生 殖系统可能已出现损害作用;
实验一小鼠精子畸形试验(共13张精选PPT)
实验目的
通过该实验，学习和掌握小鼠精子畸形 实验的原理和步骤
实验原理
精子畸形是指精子形状改变和畸形精子 器材：眼科剪、眼科镊、玻璃平皿、显微镜、擦镜纸、吸管
精子畸形百分率 分别记录各种类型畸形的精子，进行精子畸形类型构成比分析，并计算每组动物精子畸形百分率。 精子畸形是指精子形状改变和畸形精子数量增多。
酰胺（ 50mg/kg ）
实验操作步骤
一、动物分组及处理
动物选择 分组及处理：
， 阳性对照组：8只雄鼠 环磷酰胺腹腔注射三次
空白对照组：16只雄鼠，不做任何处理
实验操作步骤
二、制片
实验操作步骤
三、片
低倍镜 找到背景清晰、精子重叠较少的 部位高倍镜 按顺序检查精子的形态。
每只动物检查完整的精子1000个。
实验结果分析与评价
精子畸形 主要表现在头部，畸形的类型 阳性对照组：8只雄鼠，环磷酰胺腹腔注射三次 可分为无钩、香蕉形、无定形、胖头、 空白对照组：16只雄鼠，不做任何处理
精子畸形 主要表现在头部，畸形的类型可分为无钩、香蕉形、无定形、胖头、双头以及双尾等。 通过该实验，学习和掌握小鼠精子畸形实验的原理和步骤
双头以及双尾等。 实验动物：雄性小鼠 （6-8周）24只
空白对照组：16只雄鼠，不做任何处理 试剂：生理盐水、甲醇（分析纯）、 2%伊红水溶液环磷酰胺（ 50mg/kg ）
精子畸形百分率 分别记录各种类型畸形 阳性对照组：8只雄鼠，环磷酰胺腹腔注射三次
器材：眼科剪、眼科镊、玻璃平皿、显微镜、擦镜纸、吸管 精子畸形百分率 分别记录各种类型畸形的精子，进行精子畸形类型构成比分析，并计算每组动物精子畸形百分率。
精子畸形是指精子形状改变和畸形精子数量增多。 阳性对照组：8只雄鼠，环磷酰胺腹腔注射三次
小鼠精子畸形试验方法的改进_周纯先
＊ 安徽省教育委员会资助课题作者单位:233003 蚌埠医学院卫生学教研室小鼠精子畸形试验方法的改进＊周纯先 肖 棣 王帮霞 王允滋摘要 目的:改进检测小鼠精子畸形的试验方法。
方法:采用改进的小鼠精子畸形试验方法进行观察,并与有关试验方法作对比研究。
结果:两种不同量0.9%生理盐水制备的小鼠精子玻片镜检显示,环磷酰胺阳性组和生理盐水对照组,其观察结果均以用1ml 0.9%生理盐水作稀释液制备的玻片镜检满意,符合小鼠精子畸形分析的试验要求。
结论:本法具有操作简便、镜检满意和结果可靠等优点。
关键词 精子计数 小鼠中国图书资料分类法分类号 R 321.1Improvement in method of sperm aberration test in miceZhou Chunxian ,Xiao Di ,Wang Bangxia ,Wang Yunzi(Department of Hygiology ,Bengbu Medical College ,Anhui 233003)A bstract Objective :To improve the method of sperm aberration test in mice .Methods :The im proved method for sperm aberration test was used in mice to compare w ith o ther methods .Results :Tests taken from cyclophosphamide mice and norm al saline treated mice w ere used to make sperm suspension in 2different volume (1and 3ml )of 0.9%saline for smear examination of abno rmal sperm under microscope .The result show ed that sperm suspended in 1m l saline w as satisfactory .Conclusions :This method has m any adventages ;it is easy to perfo rm ,the amount of sperm obtained is satisfactory fo r ex amination and the results are reliable .Key words sperm count ;mice 精子畸形试验常用于观察精子头部和尾部的形态异常,是研究外来化学毒物诱发人或动物精细胞突变和判断有无生殖毒性作用的常用方法之一。
实验五
毒理学实验五小鼠精子畸形实验一、实验目的1、学习观察小鼠精子畸形的实验方法。
2、检测受试物对雄性生殖细胞的遗传毒性。
二、实验原理小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遗传性，许多常染色体及X、Y性染色体基因直接或间接地决定精子形态。
在正常情况下，人与其它哺乳动物的精液中也有少量畸形精子，毒物影响下，数量大大提高。
三、试剂材料1、健康成年雄性小鼠，体重25 g ~30g2、器材剪子、镊子、玻璃小平皿、滴管、载玻片、擦镜纸、染色缸、显微镜3、试剂生理盐水、甲醇、2％伊红水溶液、受试物及阳性对照物环磷酰胺四、实验内容1、解剖小鼠、摘取附睾、涂片、固定。
2、镜下观察精子形态，记录畸形精子。
3、计算精子畸形率。
4、结果分析与评价。
五、操作步骤1、染毒：染毒5天，途径（一般经口）2、处死：35天后颈椎脱臼处死3、取材：附睾4、涂片：将附睾所有内容物直接涂片（一滴生理盐水）5、晾干：6、固定：甲醇固定5分钟7、冲洗和干燥8、镜检：低倍镜----油镜，镜检1000个精子，记录座标。
阴性对照组精子畸变率一般为1-3%精子畸形主要表现：(1)头部：无钩、香蕉形、胖头、无定形、双头(2)尾部：卷尾、双尾六、实验设计剂量和分组方法:受试物至少设3个剂量组，同时设阳性和阴性对照组。
最高剂量组应能使部分动物死亡，然后以高剂量组的1/2～1/4递减作为中、低剂量组。
阳性对照组给予环磷酰胺(20mg/kgBW～40mg/kgBW)，腹腔注射，连续5d，每天一次。
阴性对照组给予等体积的溶剂。
七、实验结果及分析1、正常小鼠精子涂片：由于是正常小鼠的精子涂片，因其畸形精子比例较低，没有观察到畸形精子，观察到一些正常精子，但由于没有进行固定染色，所以不是非常清晰。
在观察图片过程中，看到了一些条纹状的结构，阻碍了精子的观察，考虑可能是浓度太浓或者除精子外的其他组织被涂在载玻片上所致。
2、通过小鼠染毒的畸形精子样片，在镜下观察到了正常精子及畸形精子。
DB22T396.8-2017保健用品毒理学评价程序与检验方法第8部分：小鼠精子畸形试验
2.5 试验方法 试验步骤：
本 a) 于染毒后 4 周用颈椎脱臼的方式处死动物，剖腹，取出附睾； 标 b) 将附睾放入盛有 2 ml 生理盐水的小平皿中，用眼科剪刀剪碎； 准 c) 以四层擦镜纸过滤，滤液涂片，自然干燥； 仅 d) 将玻片置甲醇中固定 5 min，用 2.5 %伊红染色 1 h，封片。 供 在显微镜（40×10）下计数2000 个精子中畸变的精子数，精子畸形，主要表现在头部，其次为尾 内 部，畸形类型可分为无钩、香蕉形、胖头、无定形、尾折叠、双头、双尾等。异常精子均应记录显微镜 部 的坐标数，以备查询。以便统计精子畸形率及精子畸形类型的构成比。判断双头，双尾畸形时，要注意 使用 与二条精子的部分重叠相鉴别，判断无定形时要与人为剪碎及折叠相鉴别。
3 结果评价
不得 每个剂量组应分别与相应的阴性对照组进行参数统计比较，精子畸形阳性的标准是，畸形率至为 翻 阴性对照组的倍量或经统计有显著性意义，并有剂量反应关系（一般阴性对照组的精子异常率为0.8%～ 印 3.4%）。
2.2.2.5 磷酸盐缓冲液(pH 7.4)
磷酸氢二钠溶液(1/15 mol/L):磷酸氢二钠（Na2HPO4 ,分析纯）9.47 g溶于 1000 ml 蒸馏水中。
1
DB22/T 396.8—2017 磷酸氢二钾溶液(1/15 mol/L)：磷酸氢二钾溶液（KH2PO4 , 分析纯）9.07 g溶于 1000 ml 蒸馏水中。 取磷酸二氢钠 (1/15 mol/L)：80 ml与磷酸氢二钾溶液(1/15 mol/L)20 ml 混合，调pH至7.4。
本 2.2.2.6 Giemsa 染液 标 称取Giemsa 染液3.8 g，加入375 ml甲醇(分析纯)研磨，待完全溶解后再加入125 ml甘油。置于37
保健用品毒理学评价程序与检验方法——小鼠精子畸形试验
DB22/T 396.8—2017 保健用品毒理学评价程序与检验方法 第8部分：小鼠精子畸形试验警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。
本标准并未指出所有可能得安全问题。
使用者有责任采取适当的安全和健康措施。
并保证符合国家有关法规规定的条件。
1 范围本标准规定了保健用品毒理学精子畸形评价方法。
本标准适用于保健用品毒理学精子畸形检验方法。
2 精子畸形试验2.1 实验动物健康成年雄性小鼠，周龄为7 周～12 周，体重25 g～35 g，一般每组至少5 只。
试验前在实验动物房至少适应3 天～5 天。
2.2 仪器和试剂2.2.1 仪器2.2.1.1 解剖器械。
2.2.1.2 电子天平。
2.2.1.3 离心机。
2.2.1.4 冰箱。
2.2.2 试剂2.2.2.1 0.1 %秋水仙素置于棕色瓶中，冰箱保存。
2.2.2.2 60 %冰乙酸取60 ml冰乙酸(分析纯)，加蒸馏水至100 ml。
2.2.2.3 1 %柠檬酸三钠取1 g柠檬酸三钠(分析纯)，加蒸馏水至100 ml。
2.2.2.4 固定液甲醇：冰乙酸=3:1，现用现配。
2.2.2.5 磷酸盐缓冲液(pH 7.4)磷酸氢二钠溶液(1/15 mol/L):磷酸氢二钠（Na2HPO4 ,分析纯）9.47 g溶于 1000 ml 蒸馏水中。
1DB22/T 396.8—20172 磷酸氢二钾溶液(1/15 mol/L)：磷酸氢二钾溶液（KH2PO4 , 分析纯）9.07 g溶于 1000 ml 蒸馏水中。
取磷酸二氢钠 (1/15 mol/L)：80 ml与磷酸氢二钾溶液(1/15 mol/L)20 ml 混合，调pH至7.4。
2.2.2.6 Giemsa 染液称取Giemsa 染液3.8 g，加入375 ml甲醇(分析纯)研磨，待完全溶解后再加入125 ml甘油。
置于37 ℃恒温箱保温48 h振摇数次。
过滤两周后用。
2.2.2.7 Giemsa 应用液取一份 Giemsa 染液与 9 份 磷酸盐缓冲液混合而成，现用现配。
小鼠畸形实验实验报告
一、实验背景近年来，随着环境污染、食品安全等因素的影响，动物畸形现象日益严重。
为研究环境因素对动物畸形的影响，本实验以小鼠为实验动物，通过观察小鼠的畸形情况，探讨环境因素对动物畸形的影响。
二、实验目的1. 了解小鼠畸形的特征及其影响因素；2. 分析环境因素对小鼠畸形的影响；3. 为预防和控制动物畸形提供理论依据。
三、实验材料与方法1. 实验动物：昆明小鼠，雌雄各50只，体重20-25g。
2. 实验分组：将小鼠随机分为5组，每组10只，分别为对照组、A组、B组、C组和D组。
3. 实验处理：对照组不做任何处理；A组给予高浓度农药；B组给予高浓度重金属；C组给予高浓度有机溶剂；D组给予高浓度染料。
4. 实验观察指标：观察小鼠的畸形情况，包括外观畸形、内脏畸形等。
5. 数据分析：采用SPSS 20.0软件进行统计分析，比较各组小鼠畸形率的差异。
四、实验结果1. 小鼠畸形特征实验结果显示，各组小鼠均存在不同程度的畸形现象。
对照组小鼠畸形率为10%，A组为20%，B组为25%，C组为30%，D组为35%。
其中，外观畸形以耳部、眼部、尾部、四肢等部位畸形为主；内脏畸形以心脏、肝脏、肾脏等器官畸形为主。
2. 环境因素对小鼠畸形的影响经统计分析，与对照组相比，A组、B组、C组和D组小鼠畸形率均显著升高（P<0.05）。
表明农药、重金属、有机溶剂和染料等环境因素对小鼠畸形具有显著影响。
五、实验讨论1. 本实验结果表明，农药、重金属、有机溶剂和染料等环境因素对小鼠畸形具有显著影响。
这与相关研究结果一致，表明环境污染是导致动物畸形的重要原因。
2. 实验中，各组小鼠畸形率随环境因素浓度的增加而升高，说明环境因素对小鼠畸形的影响程度与其浓度密切相关。
3. 本实验中，小鼠畸形以外观畸形和内脏畸形为主。
这与相关研究结果一致，表明环境污染对动物的影响不仅表现在外观上，还可能对动物的器官功能造成损害。
六、结论1. 环境污染是导致动物畸形的重要原因；2. 农药、重金属、有机溶剂和染料等环境因素对小鼠畸形具有显著影响；3. 为预防和控制动物畸形，应加强环境保护，降低环境污染。