提取大肠杆菌的质粒
大肠杆菌质粒DNA的提取
大肠杆菌质粒DNA的提取一、大肠杆菌质粒DNA的提取质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法:碱裂解法:此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下:1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37?振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1,葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1, SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0?静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70,乙醇0(5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0(05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4?下12000,离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4?下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。
2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。
质粒DNA的提取纯化与电泳检测
法、羧基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放
法、酸酚法等。
1 .碱裂解法提取质粒DNA
1.1原理
共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓
扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线
性的DNA双螺旋结构解开而被变性，共价闭合
接种含pUC-mT质粒的大肠杆菌到1.5ml含有60μg/ml Amp抗生素
的LB 液体培养基
37℃摇培过夜（10~12h）12000rpm,
3min
弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。
加100μl Ⅰ液，涡旋震荡，充分混匀
配制适量的Ⅱ液
加200μl Ⅱ液，迅速轻轻混匀（以颠倒EP管5-10次为宜），
电泳介质相同（电泳液和凝胶）：
• 分子在电场中迁移的速度主要取决于
分子本身的大小和形状。
• 形状相似的分子的迁移速度主要与分
子量相关: 分子量越大，移动越慢。
凝胶板
（二）琼脂糖凝胶电泳介绍
琼脂糖:
是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物
琼脂中提取而来。
琼脂糖凝胶:
琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点
电泳缓冲液的组成。
5.溴化乙锭染料
Biblioteka EB:溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐
Ethidium Bromide，EB），EB能插入DNA分子碱基
对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫
外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的
射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。
离子交换层析法
大肠杆菌质粒提取 碱裂解法
大肠杆菌质粒提取碱裂解法大肠杆菌质粒提取是分子生物学实验中常用的技术之一，它能够从大肠杆菌中提取到质粒DNA，为后续的克隆、测序、转染等实验提供材料基础。
下面将介绍一种常用的大肠杆菌质粒提取方法——碱裂解法。
碱裂解法是一种常用的大肠杆菌质粒提取方法，它能够高效地将细菌细胞壁溶解，并释放出其中的质粒DNA。
下面将详细介绍碱裂解法的步骤。
1.准备实验所需试剂和设备。
包括缓冲液（Tris-EDTA缓冲液）、碱裂解液（含有SDS和NaOH）、中和液（含有醋酸）、平衡液（含有大量的乙酸和等体积的酸化乙醇）等。
此外，还需要离心机、恒温槽、加热器等设备。
2.培养大肠杆菌。
首先，在LB寒天平板上点取克隆菌落，放到含有LB培养基的离心管中，经过过夜培养，培养到适合的生长状态。
3.收获大肠杆菌菌落。
用吸管将培养液吸入离心管中，然后进行高速离心，使大肠杆菌菌落沉淀在离心管底部。
4.溶菌。
将上述步骤中得到的菌落沉淀用缓冲液洗涤，去掉多余培养基；然后加入碱裂解液，充分混匀，孵育在恒温槽中。
5.中和。
将中和液加入上述混匀的细菌液中，充分混匀，使pH值迅速下降，将碱性液体中的DNA中和。
6.离心。
将上述混合液进行高速离心，使细胞碎片和DNA沉淀到离心管底部。
7.除去上清。
将上述沉淀中的上清液去掉，注意不要损伤沉淀。
8.沉淀洗涤。
用平衡液洗涤沉淀，去除杂质和残留的碱性液体。
9.沉淀溶解。
用适量的TE溶解沉淀，使DNA溶解在缓冲液中，用于后续实验。
以上就是碱裂解法的基本步骤。
此外，需要注意的是，大肠杆菌质粒提取过程中需要严格控制实验条件，如温度、时间和离心力度等，以保证提取的质粒DNA质量和纯度。
实验中还需要避免DNA的酶降解，应尽量避免长时间的酶处理等。
总结起来，碱裂解法是一种简单有效的大肠杆菌质粒提取方法，它能够高效地提取到质粒DNA，为后续的实验提供了重要的基础材料。
不过在实验操作过程中需要严格控制条件，以保证提取到的质粒DNA 质量和纯度，从而保证后续实验的可靠性。
大肠杆菌质粒提取 碱裂解法 -回复
大肠杆菌质粒提取碱裂解法-回复大肠杆菌质粒提取是一种常用的实验技术，可以用于分离和纯化重组DNA 质粒。
碱裂解法是其中一种常用的技术，本文将详细介绍大肠杆菌质粒提取碱裂解法的步骤和相关注意事项。
一、材料准备1. 大肠杆菌含质粒的培养物：可以选择含有目标质粒的大肠杆菌菌株。
例如，适用于蓝/白哺乳素筛选的菌株如DH5α。
2. 质粒纯化试剂盒：选择适合自己实验的质粒纯化试剂盒，可以根据需要选择小或大规模的提取试剂盒。
3. 离心管和离心机：用于离心大肠杆菌培养物和纯化DNA溶液。
4. 碱裂解缓冲液：可以通过自制或直接购买管制的缓冲液，如1 MTris-HCl (pH 8.0)、0.5 M EDTA (pH 8.0) 和10 SDS。
二、菌群扩增和收获菌株1. 从培养物中收取大肠杆菌：从10 mL 大肠杆菌培养物中取出适量菌液，可通过离心和倾倒上清液的方式收集菌块。
2. 重悬菌液：用无菌的PBS缓冲液洗涤菌块，再用10 mL 新鲜PBS缓冲液将菌块重悬。
3. 破碎细胞：将重悬的菌液转移至一个离心管中，对菌液进行破碎。
可以通过加入Lysozyme (100 mg/mL)、RNase A (10 mg/mL) 和TritonX-100 (1)来实现。
然后进行轻轻的颠倒以混合试剂。
4. 加入碱裂解缓冲液：向破碎的细胞中加入适量的碱裂解缓冲液。
一般来说，每个培养物使用5 mL缓冲液进行处理。
5. 匀浆与悬浮：用高速离心机对混合液进行离心，以沉淀细胞碎片。
然后将上清液转移到另一个离心管中，进行均匀悬浮。
三、纯化DNA1. 加入异丙醇：向菌液中加入等体积的异丙醇。
使用移液器将试剂静态混合。
2. DNA沉淀：将混合液高速离心，将沉淀的DNA从上清中分离出来。
沉淀的细胞碎片在离心管底部形成一个白色团块，而上清液大部分为透明的液体。
3. 洗涤：使用95 乙醇洗涤DNA沉淀物。
将95 乙醇分别加入到离心管中，并将其高速离心10分钟。
碱裂解法抽提大肠杆菌质粒
移液器及吸头 漩涡混合器
03
实验步骤
菌体培养
菌体培养是碱裂解法抽提大肠杆菌质 粒的第一步，需要将大肠杆菌接种在 适量的培养基中，在适宜的温度下进 行培养，使菌体生长至对数生长期。
培养过程中，需要控制温度、pH和培 养时间，以确保菌体生长良好且无杂 菌污染。
菌体收集
当菌体生长至对数生长期后，需要将 菌体收集起来，以便进行后续的实验 步骤。
碱裂解法抽提大肠杆 菌质粒
目 录
• 实验原理 • 实验材料 • 实验步骤 • 结果与分析 • 结论与讨论
01
实验原理
碱裂解法介绍
碱裂解法是一种常用的质粒抽提 方法，通过改变细胞壁和细胞膜 的性质，使质粒DNA从染色体
DNA中分离出来。
在高pH值条件下，细胞膜和染 色体DNA的双螺旋结构被破坏，
聚丙烯酰胺凝胶电泳
对于较小片段的质粒，可采用聚丙烯 酰胺凝胶电泳进行检测，该方法分辨 率更高。
质粒结构与功能分析
01
质粒电泳图谱分析
通过比较标准质粒和提取质粒的 电泳图谱，分析提取质粒的分子 量大小及可能缺失的片段。
02
限制性内切酶分析
03
基因测序验证
利用限制性内切酶对质粒进行酶 切，通过电泳检测酶切产物，判 断质粒的结构。
形成不可逆的变性，而质粒 DNA则保持稳定。
通过离心分离，染色体DNA和 细胞膜等大分子物质被沉淀，而
质粒DNA则留在上清液中。
大肠杆菌质粒介绍
01
大肠杆菌质粒是一种小型环状DNA分子，可以自主 复制和遗传。
02
质粒携带特定的基因，赋予宿主细胞某些表型特征， 如抗生素抗性或代谢特性。
03
大肠杆菌质粒是基因工程中常用的载体，用于克隆 和表达目的基因。
大肠杆菌生产质粒过程
大肠杆菌生产质粒过程1.引言1.1 概述概述大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的革兰氏阴性杆菌，广泛存在于自然界中，尤其是在人和动物的消化系统中。
由于其较高的生长速度和容易培养的特性，大肠杆菌成为了许多生物学研究和工业生产中的重要模式生物。
质粒是一种小型的环状双链DNA分子，在细菌中经常出现并进行自复制。
质粒可以通过转化或转染等方式在细菌中进行稳定复制，从而传递和保守一些重要的基因信息。
在大肠杆菌中，质粒的产生是其中一个重要的生物过程。
本文旨在探讨大肠杆菌生产质粒的过程，从大肠杆菌的生物特性和质粒的定义与功能入手，详细分析大肠杆菌生产质粒的重要性以及影响其生产过程的关键因素。
通过对大肠杆菌生产质粒过程的研究，我们可以更好地理解质粒的作用机制，为进一步优化和应用质粒在工业生产和基因工程中提供理论指导和实践经验。
在本文的后续章节中，我们将逐步展开对大肠杆菌和质粒的相关讨论，并且重点分析大肠杆菌生产质粒的重要性和影响质粒生产过程的关键因素。
最后，我们将总结得出结论，并对未来可能的研究方向进行展望。
通过本文的研究，我们希望能够更深入地了解大肠杆菌生产质粒的机制，为质粒的开发和应用提供更多的理论和实践支持，进一步推动生物科学和生物工程的发展。
1.2文章结构1.2 文章结构本文将按照以下顺序进行介绍大肠杆菌生产质粒的过程及其相关内容：1. 引言部分将提供对整篇文章的概述，介绍大肠杆菌生产质粒的背景和意义，以及本文的目的和结构。
2. 正文部分将包括两个主要部分：2.1 大肠杆菌的生物特性：这一部分将详细介绍大肠杆菌的特性，包括其生长环境、生理特征以及在科学研究和实际应用中的重要性。
通过对大肠杆菌的深入了解，读者将更好地理解其在质粒生产过程中的应用。
2.2 质粒的定义与功能：质粒是一种在细胞内自主复制的小型环状DNA分子，具有重要的研究和应用价值。
本部分将介绍质粒的定义、结构和功能，重点讨论其在基因工程和生物制药中的应用，以及大肠杆菌在质粒生产中所起的关键作用。
大肠杆菌质粒提取原理
大肠杆菌质粒提取原理
大肠杆菌质粒提取的原理主要包括以下几个步骤：
1. 细胞裂解：将大肠杆菌菌落接种到液体培养基中培养，在适当的培养时间后，将菌液离心沉淀，得到含有大肠杆菌细胞的沉淀物。
细胞裂解是通过物理或化学方法破坏细胞壁，释放细胞的内容物。
2. 质粒提取：将裂解后的细胞加入适当的缓冲液中，经过离心分离得到上清液和沉淀物。
上清液中含有质粒DNA，而细胞碎片和其他细胞器等则在沉淀物中。
3. DNA纯化：使用DNA纯化试剂盒或其他纯化方法将上清液中的质粒DNA分离纯化。
这些方法通常涉及对上清液进行酚/氯仿提取、乙醇沉淀或离心柱纯化等步骤，以去除杂质和纯化质粒DNA。
4. 质粒DNA定量：使用紫外线分光光度计对纯化后的质粒DNA进行定量，以确定得到的DNA的浓度和纯度。
5. 质粒DNA的后续应用：得到纯化的质粒DNA后，可进一步进行测序、限制性酶切、聚合酶链式反应(PCR)等分子生物学实验，以研究质粒DNA所携带的目的基因的功能、构建重组质粒或进行基因克隆等实验。
需要注意的是，在文中不提供标题或重复的文字。
如果需要添加标题，可以根据具体内容进行修改。
大肠杆菌质粒DNA的提取
大肠杆菌质粒DNA的提取实验目的学习和掌握碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的方法实验原理大肠杆菌质粒DNA的提取是从事基因工程工作的一项基本实验技术，碱裂解法是最常用的质粒DNA提取方法之一，其原理是基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离的目的；具体为：溶液Ⅰ使细胞悬浮并且EDTA可以与Ca2+ 和Mg2+ 螯和，抑制DNase的活性，溶液II裂解细菌，变性蛋白质和少量质粒，溶液Ⅲ使大部分蛋白质与细菌基因组DNA一起被共沉淀，质粒DNA复性，通过离心吸附柱分离，进行电泳鉴定。
此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。
实验材料、仪器和试剂材料：大肠杆菌DH5α仪器：1.5ml塑料离心管，微量移液枪，台式高速离心机，恒温摇床试剂：质粒DNA提取试剂盒实验步骤和各步骤相应的注意事项一、培养细菌使质粒扩增将带有质粒DNA的大肠杆菌接种在LB液体培养基中，37℃过夜培养。
注意：培养时间不宜过长，一般12~16小时为宜，否则影响细菌质粒的得率。
二、收集和裂解细菌1. 取1.5ml 细菌培养物于EP管中，4000rpm 离心2分钟，弃上清液，收集菌体，使细菌沉淀尽量干燥；注意：上清为培养基，必须倾倒干净，并在吸水纸上吸干，如有较多的培养基残留可能会影响后续实验。
2. 将细菌沉淀重悬于用冰预冷的250μl溶液I (50 mmol/L)葡萄糖，10mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0) 中，剧烈振荡；注意：为了保证菌体悬浮均匀，必须充分混匀至看不见沉淀物质，可以用移液枪吹打或者混匀器震荡。
3. 加入250μl新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH，1％SDS（m/v）) ，盖紧EP管口，柔和颠倒离心管（2分钟左右），以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液II接触，使溶液变为澄清为止；注意：NaOH溶液最好是新鲜配制，足够的碱性保证其溶解细胞膜的效率；不可剧烈震荡，时间不要过长，否者基因组DNA会断裂。
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感受态细胞
分子生物学最基本的实验操作
提取大肠杆菌和凝胶电泳
碱裂解法提取质粒
质粒是分子生物学中载体
扩增培养细菌便于提取，为客观化，养细胞来获得质粒二倍体增加
培养后收集裂解，裂解物质有很多物质，分离质粒和纯化质粒
质粒提取的方法
2-3ml少量提取方法碱裂解法
两个环，染色体独立复制能从亲代传到子代
质粒DNA是圆环状
目的基因越多，复性有不好影响
需要大量，让宿主细胞扩增
EP2232考量目的基因的作用，个体，看生物学功能发现
可以弥补目的细胞缺陷
沉默基因片段可以质粒
质粒提取与介质有关
控制PH是细胞破裂，染色体基因变性，质粒基因微变性，空间结构稳定，变性小开链缠绕在一起，蛋白质会沉淀，质粒在水相离心抽提纯化
原理核心物质
Ph8左右培养，变性需要12
Sds裂解细胞，染色体核酸变性，环境是碱
抑制杂菌，空气中的菌，培养中其它生长出来的菌
裂解用的试剂SDS和NAOH溶液
提取试剂溶液1，2，3
先配原始浓度，用时工作浓度，使用时变成终浓度
苯酚氯仿异戊醇分层，用苯酚氯仿比重大，易沉，相配现用
充分混匀
TE Buffer专门储存DNA
裂解时加RNA酶，不加，检测有条带，使制剂更纯
溶液123作用尽可能全地写到讨论区
溶液一震荡混匀二是轻柔颠倒混匀3颠倒混匀
涡旋混匀器。