大肠杆菌质粒提取
提取大肠杆菌的质粒
感受态细胞
分子生物学最基本的实验操作
提取大肠杆菌和凝胶电泳
碱裂解法提取质粒
质粒是分子生物学中载体
扩增培养细菌便于提取，为客观化，养细胞来获得质粒二倍体增加
培养后收集裂解，裂解物质有很多物质，分离质粒和纯化质粒
质粒提取的方法
2-3ml少量提取方法碱裂解法
两个环，染色体独立复制能从亲代传到子代
质粒DNA是圆环状
目的基因越多，复性有不好影响
需要大量，让宿主细胞扩增
EP2232考量目的基因的作用，个体，看生物学功能发现
可以弥补目的细胞缺陷
沉默基因片段可以质粒
质粒提取与介质有关
控制PH是细胞破裂，染色体基因变性，质粒基因微变性，空间结构稳定，变性小开链缠绕在一起，蛋白质会沉淀，质粒在水相离心抽提纯化
原理核心物质
Ph8左右培养，变性需要12
Sds裂解细胞，染色体核酸变性，环境是碱
抑制杂菌，空气中的菌，培养中其它生长出来的菌
裂解用的试剂SDS和NAOH溶液
提取试剂溶液1，2，3
先配原始浓度，用时工作浓度，使用时变成终浓度
苯酚氯仿异戊醇分层，用苯酚氯仿比重大，易沉，相配现用
充分混匀
TE Buffer专门储存DNA
裂解时加RNA酶，不加，检测有条带，使制剂更纯
溶液123作用尽可能全地写到讨论区
溶液一震荡混匀二是轻柔颠倒混匀3颠倒混匀
涡旋混匀器。
提取质粒实验报告
提取质粒实验报告提取质粒实验报告引言：质粒提取是分子生物学中常用的实验技术之一，通过提取质粒，可以获得目标基因的DNA序列，进而进行进一步的研究和应用。
本实验旨在通过一系列步骤，从细菌中提取质粒，并对提取的质粒进行分析和鉴定。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 大肠杆菌培养液- 质粒DNA提取试剂盒- 离心管- 离心机- 试剂盒中的缓冲液、溶解液、洗涤液、洗涤缓冲液、洗涤液浓缩液、洗涤缓冲液浓缩液、洗涤缓冲液浓缩液2、洗涤缓冲液浓缩液3、洗涤缓冲液浓缩液4、洗涤缓冲液浓缩液5、洗涤缓冲液浓缩液6、洗涤缓冲液浓缩液7、洗涤缓冲液浓缩液8、洗涤缓冲液浓缩液9、洗涤缓冲液浓缩液10- 水浴锅- 离心管架2. 实验方法：- 步骤一：将大肠杆菌培养液离心，收集菌体沉淀。
- 步骤二：将收集的菌体沉淀加入溶解液中，使其充分溶解。
- 步骤三：加入缓冲液，进行离心分离。
- 步骤四：将上清液转移到新的离心管中，加入洗涤液进行洗涤。
- 步骤五：加入洗涤缓冲液进行洗涤。
- 步骤六：加入洗涤缓冲液浓缩液进行洗涤。
- 步骤七：加入洗涤缓冲液浓缩液2进行洗涤。
- 步骤八：加入洗涤缓冲液浓缩液3进行洗涤。
- 步骤九：加入洗涤缓冲液浓缩液4进行洗涤。
- 步骤十：加入洗涤缓冲液浓缩液5进行洗涤。
- 步骤十一：加入洗涤缓冲液浓缩液6进行洗涤。
- 步骤十二：加入洗涤缓冲液浓缩液7进行洗涤。
- 步骤十三：加入洗涤缓冲液浓缩液8进行洗涤。
- 步骤十四：加入洗涤缓冲液浓缩液9进行洗涤。
- 步骤十五：加入洗涤缓冲液浓缩液10进行洗涤。
- 步骤十六：将洗涤后的质粒DNA溶解于水中。
实验结果与讨论：在本实验中，我们成功地从大肠杆菌中提取到了质粒DNA，并进行了分析与鉴定。
通过对提取的质粒DNA进行电泳分析，我们观察到了明显的DNA条带，表明质粒DNA的提取是成功的。
此外，我们还对提取的质粒DNA进行了鉴定。
通过使用限制性内切酶对质粒DNA进行切割，并进行电泳分析，我们可以确定质粒中是否存在目标基因。
从大肠杆菌中提取质粒DNA
生药0911 黄晶
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实验流程 实验原理 实验前准备 实验步骤 补充事项
实验流程
• 大肠杆菌置于LB培养基培 养使质粒DNA扩增 • 收集和裂解细菌 • 分离和纯化质粒DNA
实验原理
质粒独立于染色体外，且 游离于细胞质内或整合在细 菌染色体中。 SDS是一种阴离子表面活 性剂能使细菌细胞裂解，又 能使一些蛋白质变性，释放 出质粒DNA和染色体DNA。
谢谢
实验前准备
• 实验材料：含有质粒 DNA的大肠杆菌DH５α • 实验仪器：塑料离心管 架；10,100,1000µＬ移 液枪；1.5mＬEP离心管； 低温高速离心机一台； 无菌工作台；高压锅； 玻璃仪器及滴管等。
实验前准备
试剂准备： LB培养基； pH为8.0的GET缓冲溶液； 0.2mol/L的NaOH(含 1%SDS）； pH为4.8的乙酸钾溶液； 异丙醇溶液及75%乙醇溶液； pH为8.0TE缓冲液
实验步骤
• GET缓冲溶液中的EDTA 可除去细胞壁上的钙离子， 使溶菌酶更易与细胞壁接 触。 • 加入200µL新配制的 0.，使之混匀，冰浴 5min。 • SDS可使细胞膜裂解蛋白 质变性。
实验步骤
• 加入150µL冰冷的pH为4.8乙 酸钾溶液，加盖后颠倒数次 混匀，冰浴3~5 min。 • 乙酸钾沉淀SDS和SDS 与蛋 白质的混合物，冰浴是为了 沉淀完全。 • 加入等体积的异丙醇混匀， 室温置5min,12000r/min离心 5min,弃去上清液。
实验原理
在碱性溶液中，双链 DNA氢键断裂，DNA双螺 旋结构破坏而变性，由于 质粒DNA分子量相对较 小，且呈环状超螺旋结构， 在高碱性pH条件下两条 互补链不会充分分离，当 加入中和缓冲液乙酸钾时 变性质粒DNA又恢复到原 来的构型；
大肠杆菌质粒提取 碱裂解法
大肠杆菌质粒提取碱裂解法大肠杆菌质粒提取是分子生物学实验中常用的技术之一，它能够从大肠杆菌中提取到质粒DNA，为后续的克隆、测序、转染等实验提供材料基础。
下面将介绍一种常用的大肠杆菌质粒提取方法——碱裂解法。
碱裂解法是一种常用的大肠杆菌质粒提取方法，它能够高效地将细菌细胞壁溶解，并释放出其中的质粒DNA。
下面将详细介绍碱裂解法的步骤。
1.准备实验所需试剂和设备。
包括缓冲液（Tris-EDTA缓冲液）、碱裂解液（含有SDS和NaOH）、中和液（含有醋酸）、平衡液（含有大量的乙酸和等体积的酸化乙醇）等。
此外，还需要离心机、恒温槽、加热器等设备。
2.培养大肠杆菌。
首先，在LB寒天平板上点取克隆菌落，放到含有LB培养基的离心管中，经过过夜培养，培养到适合的生长状态。
3.收获大肠杆菌菌落。
用吸管将培养液吸入离心管中，然后进行高速离心，使大肠杆菌菌落沉淀在离心管底部。
4.溶菌。
将上述步骤中得到的菌落沉淀用缓冲液洗涤，去掉多余培养基；然后加入碱裂解液，充分混匀，孵育在恒温槽中。
5.中和。
将中和液加入上述混匀的细菌液中，充分混匀，使pH值迅速下降，将碱性液体中的DNA中和。
6.离心。
将上述混合液进行高速离心，使细胞碎片和DNA沉淀到离心管底部。
7.除去上清。
将上述沉淀中的上清液去掉，注意不要损伤沉淀。
8.沉淀洗涤。
用平衡液洗涤沉淀，去除杂质和残留的碱性液体。
9.沉淀溶解。
用适量的TE溶解沉淀，使DNA溶解在缓冲液中，用于后续实验。
以上就是碱裂解法的基本步骤。
此外，需要注意的是，大肠杆菌质粒提取过程中需要严格控制实验条件，如温度、时间和离心力度等，以保证提取的质粒DNA质量和纯度。
实验中还需要避免DNA的酶降解，应尽量避免长时间的酶处理等。
总结起来，碱裂解法是一种简单有效的大肠杆菌质粒提取方法，它能够高效地提取到质粒DNA，为后续的实验提供了重要的基础材料。
不过在实验操作过程中需要严格控制条件，以保证提取到的质粒DNA 质量和纯度，从而保证后续实验的可靠性。
大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化
大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化质粒DNA是细菌细胞中的一种环状DNA，通常大小约为1-200 kb。
质粒DNA在遗传工程研究中起着重要的作用，可以用于插入DNA片段的克隆、质粒表达载体的构建等。
大肠杆菌(Escherichia coli)是常用的质粒DNA提取宿主。
质粒DNA提取的目的是将质粒DNA从大肠杆菌细胞中高效纯化出来。
在实际操作中，优化提取条件可以大大提高质粒DNA的纯度和得率。
以下是一些常见的质粒DNA提取条件的优化策略。
1.细菌培养条件的优化在进行质粒DNA提取之前，首先需要培养大肠杆菌细菌。
细菌培养条件的优化可以提高质粒DNA的产量。
一些常见的优化策略包括：选择适当的培养基，调整培养基的pH值，控制培养温度和培养时间，添加适量的抗生素以阻断非质粒DNA的复制等。
2.质粒DNA提取试剂盒的选择质粒DNA提取试剂盒是一种更为简便和高效的质粒DNA提取方法。
在选择试剂盒时，可以考虑以下因素：纯化步骤的简易程度、纯化时间、纯化效果、质粒DNA得率等。
需根据具体实验要求选择合适的试剂盒。
3.细胞破碎条件的优化细胞破碎是质粒DNA提取的关键步骤之一。
常见的细胞破碎方法包括机械破碎和化学破碎。
机械破碎方法如超声波破碎、高压破碎等；化学破碎方法如利用酶降解细胞壁等。
优化细胞破碎条件可以提高质粒DNA的纯度和产量。
4.酶处理的优化在质粒DNA提取过程中，可以利用不同的酶处理方法去除蛋白质、RNA等杂质。
常见的酶处理方法包括蛋白酶处理和RNase处理。
优化酶处理的时间和浓度可以有效提高质粒DNA的纯度。
5.DNA沉淀条件的优化DNA沉淀是质粒DNA提取过程中的最后一步，也是重要的纯化步骤。
常见的DNA沉淀方法包括利用盐酸乙醇或异丙醇沉淀DNA等。
优化DNA沉淀条件可以提高DNA的得率和纯度。
质粒DNA提取条件的优化可以从培养条件、试剂盒选择、细胞破碎、酶处理以及DNA 沉淀等方面进行考虑。
通过优化提取条件，可以获得高质量的质粒DNA，满足实验需求。
大肠杆菌质粒DNA的提取
③ 向上清液中加入等体积酚-氯仿混合液，震荡 混匀，以10000r/min离心2min,将上清转至新 的离心管中（用酚与氯仿的混合液除去蛋白， 其效果比单独使用酚或氯仿更好)
④ 向上清中加入2倍体积无水乙醇，混匀。室温 放置2min后，离心5min倒去上清乙醇溶液，把 离心管倒置在吸水纸上吸去液体。
⑤ 加入0.5mL 70%乙醇溶液，震荡并离心，倒去 上清，干燥，溶于实验用品均需高温处理，以灭活残余的 DNA酶 • 所有试剂均需用高压灭菌双蒸水配制
• 酚抽提后小心吸取上清液
• 0.2mol/L NaoH溶液（内含1%SDS） • 70%乙醇溶液/无水乙醇
实验过程
1、培养细菌扩增质粒： 将带有质粒DNA的大肠杆菌接种在LB液体培养 基中，37℃过夜培养
2、收集菌体及裂解细菌:
① 取液体培养菌液1.5mL置于EP管中， 10000r/min 离心1min, 去上清。 ② 加入150uL G.E.T 缓冲液，充分混匀，室温放 置10min （溶菌酶在碱性条件下不稳定，必须 在使用时重新配置，使用EDTA是为了除去细胞 壁上的钙离子，使溶菌酶更易与细胞壁接触）
大肠杆菌质粒DNA的提取
实验目的
• 学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法
• 掌握质粒DNA制备的方法和原理
实验原理
质粒DNA的提取分为三个步骤：培养细菌使 质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质 粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十 二万基硫酸钠（SDS）可使细胞壁裂解，经 溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细 菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离 心时易被沉淀出来，而质粒DNA 则留在上清 液中，将上清液用乙醇溶液沉淀洗涤后，可 得到质粒DNA.
③ 加入新配置的0.2mol/L NaoH溶液（内含1%SDS） 加盖，倒置2-3次，使之混匀。冰浴5min（SDS 能使细胞膜裂解，并使蛋白质变性）
细胞生物学实验碱性SDS法提取大肠杆菌源质粒
溶液Ⅱ： 0.2MNaOH， 1%SDS
溶液Ⅲ： 3M乙酸钠 PH 4.8
试剂
4、1：1 Tris饱和酚/氯仿
5、溶解质粒用TE：
10mmol/L Tris-HCI PH 8.0
1mmol/L EDTA
PH 8.0
6、溶解质粒用TER：
每ml TE 中含1mg RNase。
用品
摇床、恒温箱、普通离心机、高速冷冻 离心机、1.5ml离心管、电泳仪等。
断开）
DNA的琼脂糖凝胶电泳分离的原理及装置
琼脂糖（agarose）是从海藻中提取出来的一 种线状高聚物，在溶液中形成一定孔径的凝胶。 具有分子筛作用。可依据分子大小及分子构型 不同分离物质。
琼脂糖凝胶电泳装置：Walter Schaffner发明
的水平板凝胶电泳装置。
电泳步骤
1.配缓冲液：Tris－乙酸缓冲液、Tris－乙酸盐缓冲液、 Tris-硼酸盐缓冲液、Tris－磷酸盐缓冲液
三、裂菌及提取质粒DNA
1、100l预冷的溶液Ⅰ重悬菌液，激烈振荡(涡旋）， 使细胞完全分散，室温放置5min；
2、加入200l新配制的溶液Ⅱ，快速颠倒几次混匀， 置于冰上（此时溶液PH应为12.6）不超过5min ，使细 胞破裂，蛋白和染色体DNA变性；
3、加入150l用冰预冷的溶液Ⅲ，颠倒温和混匀，置 于冰上5min(此时溶液PH应为7.0左右,可使质粒DNA选 择复性；高浓度的盐使蛋白及染色体DNA沉淀)；
Tris-硼酸盐缓冲液 Tris-EDTA缓冲液 巴比妥缓冲液 缓冲液 缓冲液离子强度：0.02-0.05。
琼脂糖凝胶的制备
１.配琼脂糖溶液。用电泳缓冲液配制。 2.封胶板，插梳子。
3.倒胶。熔化液倒入胶模中，放置1530min令其凝固。
大肠杆菌制备胰岛备工艺流程
大肠杆菌制备胰岛备工艺流程
以下是利用大肠杆菌生产胰岛素的工艺流程：
1. 提取目的基因：从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。
2. 提取质粒：使用细胞工程，培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒为环状。
3. 基因重组：取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用DNA连接酶将目的基因与质粒“缝合”，形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。
4. 将质粒送回大肠杆菌：再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质，如CaCl2，这使细胞会吸收外源基因。
此时将重组的质粒也放入培养液中，大
肠杆菌便会将重组质粒吸收。
5. 胰岛素的产生：在再大肠杆菌内，质粒通过表达转录与翻译后，便产生出胰岛素蛋白质。
通过大肠杆菌的大量繁衍，便可大量生产出胰岛素。
以上步骤仅供参考，如果想要了解更多关于大肠杆菌制备胰岛素的工艺流程，建议咨询专业人士获取帮助。
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质粒小提试剂盒
（离心柱型）
使用前在漂洗液PW中加无水乙醇
1.柱平衡：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入平衡液BL，12000rpm、
离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。
（使用当天处理过的柱子）
2.取1-5ml过夜培养的菌液，12000rpm、离心1min（EP管收集3次）尽量吸
除上清
3.向留有沉淀的离心管中加250μl溶液P1（检查是否已加入RNaseA），涡旋
彻底悬浮菌体沉淀（不要留有菌块，会影响裂解）。
4.向离心管中加250μl溶液P2，温和的上下翻转6~8次使菌体充分裂解，室
温放置3~5min（温和翻转，不要剧烈震荡。
此时菌液变得清亮粘稠，时间应不超过5min，以免质粒受破坏）。
5.向离心管中加350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6~8次，充分混匀，此
时出现白色絮状沉淀。
12000rpm、离心10min。
（P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀，如有微小沉淀可再次离心后取上清）。
（此时可做胶，以备检测用）
6.取上清转移到吸附柱CP3中，不要吸出沉淀。
12000rpm、离心1min，倒掉
收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。
7.向吸附柱CP3中加600μl漂洗液PW（检查是否加入无水乙醇），12000rpm、
离心1min，倒掉收集管中的废液，吸附柱放回收集管中。
8.重复操作步骤7。
9.将吸附柱CP3放回收集管中，12000rpm、离心2min，将吸附柱中残余漂洗
液除去（可将吸附柱CP3开盖放置数分钟，以彻底晾干残余漂洗液）。
10.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加100μl
ddH2O/EB，室温放置2min，12000rpm、离心2min，将质粒溶液收集到离心管中，-20℃保存。
注意：使用前检查平衡液BL、溶液P2、溶液P3是否出现浑浊，如有浑浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清
碱裂解法少量提取质粒
1.保存菌种
2.收集菌体到EP管.离心8000rpm，1min,尽可能去上清，重复2-3次
3.沉淀悬于100ul solution Ⅰ,涡旋
4.加200ul solution Ⅱ（现用现配，0.4 M NaOH:2% SDS =1:1），轻轻摇匀
5.加150ul solution Ⅲ，轻轻摇匀
6.加600ul 氯仿，轻轻摇匀
7.离心，11000rpm ,1min
8.取上清于新EP管，加800ul 预冷无水乙醇（-20℃），混匀
9.离心，11000rpm ,1min
10.弃上清，沉淀中加入300ul 70% 乙醇洗
11.烘干
12.加30ul RNase 水，轻弹促溶
13.37℃,30min
14.-20℃保存。