大肠杆菌质粒转化实验
质粒DNA转化感受态大肠杆菌的方法
质粒DNA转化感受态大肠杆菌的方法实验原理利用CaCl2处理感受态体细胞，然后通过热休克处理，即置于42℃高温热激90秒，热休克后，需要使受体细胞在不含有抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够的蛋白，以便能在含有抗生素的平板上生长菌落。
试剂与器材1.LB液体培养基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L，高压灭菌消毒。
2.LB固体培养基LB液体培养基中加1.5%琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。
3.0.1mol/L CaCl2高压灭菌消毒或过滤除菌。
4.氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml溶液，置-20℃保存。
5.质粒6.大肠杆菌DH5α 此为DNA扩增菌7.恒温水浴箱8.超净工作台9.高速冷冻离心机10.恒温摇床11.恒温箱12.消毒离心管13.消毒tips 14.玻璃培养皿直径90mm 15.玻璃涂布器16.95%乙醇17.标记笔实验方法与步骤1、制备含有Amp抗生素的LB平板，终浓度为50ug/ml2、取一个1.5ml离心管，加入100μl感受态细胞悬液，置冰上：加入20ul 质粒T+G(提取的质粒DNA稀释500X)，用移液器轻柔混匀。
冰上静置20min。
3、42℃水浴中热激90秒，然后迅速置冰上3~5min。
整个过程不要振荡菌液。
4、加入1ml LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养(180rpm)1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
5、取100ul菌液，至含有抗生素Amp的LB固体培养基上，涂布均匀。
6、待菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12~16小时，菌落生长良好而又未互相重叠时，取出。
7、计算转化率8、统计每一个培养皿中的菌落数。
9、转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：10、转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积;11、转化频率(转化子数/μg质粒DNA)=转化子总数/质粒DNA加入量(μg)2．DNA重组子的转化大肠杆菌DH-5α：（实验流程如下所示）100ul感受态细胞DH-5α+重组质粒───→轻轻旋转混合───→冰上放置30min───→42 ℃,热激120S───→冰浴2min───→400ulLB培养基───→37℃, 50r/min振摇45min───→取200ul涂布于含Amp琼脂板───→室温放置，使液体吸收───→37℃倒置培养12~16h冻融法质粒DNA转化至大肠杆菌操作步骤1. 取100μl感受态细胞于冰浴上融化。
大肠杆菌的转化、扩增及一些基础的实验前准备
A．大肠杆菌的转化（热击法）1. 从-80℃超低温冰柜中取出一管感受态大肠菌（BL21），立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10 min。
从冰箱中拿出含目标基因片段的质粒一管，也插入冰中，冰浴5~10 min，待融化。
2. 往上述大肠菌中加入5 μl(一般大肠菌50ul,质粒5ul)连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100 ng），轻轻震荡后放置冰上20 min。
同时，将恒温水浴的温度调到42℃。
顺便把质粒管放回原处。
(移液器枪头可能要用贴有白色标的那种).(有时大肠菌为10UL，质粒1~2UL。
比例在10:1左右)3. 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1 min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置5~10 min。
这样质粒就被导入了。
4. 在超净工作台中向上述引入质粒的大肠杆菌管中加入500 μl LB培养液（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床弹簧架上37℃震荡0.5h。
5. 同时将含合适抗菌素（AMP）的固体LB平板培养皿，放入烘箱37℃下烘0.5h。
这样可以防止大肠菌因为较大温差而死亡。
6. 在超净工作台中取上述转化混合液（即导入质粒的大肠菌）150 μl，滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过（防止杂菌）的玻璃涂布棒涂布均匀，注意涂布棒不可烧后直接涂，要降温。
将多余的转化混合液倒入废液缸，管子投入指定地点。
7. 倒置培养基，在培养皿上做上标记，放置在37℃恒温培养箱中培养箱过夜（约12-15小时）。
9. 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，整理。
B．大肠杆菌扩增用的“营养肉汤培养液”的配制酵母提取物，蛋白胨，氯化钠，NaOH溶液等按照实验室写的来，加1L超净水。
配好的培养基灭菌时需要在摇瓶上加透气的塞子，然后120度20分钟灭菌。
写上标签。
有些需要灭菌的器材都可以在此时灭菌。
C1．大肠杆菌扩增（在2*TY培养基上）1.实验前先对双手消毒。
实验时也要注意对器材在火上烧一下如镊子，移液器，试管口，试管盖，使用前后的竹签。
实验四 质粒在大肠杆菌中的转化和鉴定
4、向管中加入0.4ml LB液体培养 基(不含抗生素),混匀后37℃振荡培养1 小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达 质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。 5、将上述菌液摇匀后取100µl 涂 布于含Amp的筛选平板上,正面向上放 置半小时,待菌液完全被培养基吸收后热激以后进行活化培养，这时的培养基中为 什么不加入抗生素？ 2.什么是质粒？根据在细菌中的复制，质粒有几 种类型？用于基因重组的主要用到哪种质粒？
感受态），转化用的质粒(pUC18)，无菌 1.5mL的eppendorf管 四、仪器 恒温摇床，恒温水浴锅， 恒温摇床，恒温水浴锅， 电热恒温培养 超净工作台， 箱，超净工作台， 微量移液枪
五、试剂
LB固体和液体培养基； Amp
五、操作步骤 1、从-70℃冰箱中取50 µL感受态细胞 悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上； 也可用新鲜配制的感受态细胞在4 ℃冰箱 中隔夜以后使用。 2、 加入0.5 µl质粒DNA溶液,轻轻摇 匀,冰上放置30分钟。 3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴 5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
实验五 质粒在大肠杆菌中 的转化和鉴定
一、质粒转化的功用
1. 为实验室获得大量进行基因克隆的质 粒。 2. 使携带有目的基因的重组质粒在大肠 杆菌中进行表达。
二、原理
外源DNA（质粒）粘附在感受态 细胞表面，在42℃短暂热激以后，细 胞会将外源DNA吸收 。
三、材料
E. coli DH5α（或JM105）菌株（已制备
质粒dna的转化实验报告
质粒dna的转化实验报告质粒DNA的转化实验报告引言：质粒DNA转化是分子生物学中常用的实验技术之一，通过将外源DNA导入到细胞内，实现基因的转移和表达。
本实验旨在探究质粒DNA转化的原理、方法以及影响转化效率的因素。
一、实验原理质粒DNA转化是利用细菌细胞膜的渗透性，将外源DNA导入到细胞内。
质粒DNA通常带有抗生素抗性基因，通过筛选培养基中的抗生素对转化细胞进行筛选，从而获得转化成功的细胞。
二、实验材料与方法1. 实验材料：- 大肠杆菌DH5α细胞- 质粒DNA- LB培养基- 抗生素（如氨苄青霉素）2. 实验方法：a) 质粒DNA制备：将目标基因克隆到质粒载体中，通过大肠杆菌的培养和质粒提取技术，获得纯化的质粒DNA。
b) 细胞预处理：取适量的大肠杆菌DH5α细胞，进行预处理，使其处于最佳转化状态。
c) 转化实验：将质粒DNA与细胞混合，并通过热冲击法或电穿孔法使DNA转移到细胞内。
d) 恢复培养：将转化后的细胞在预热的LB培养基中恢复培养，使其恢复生长。
e) 筛选转化细胞：将恢复培养的细胞均匀涂布在含有抗生素的LB平板上，筛选出抗生素抗性的细胞。
三、实验结果与讨论1. 转化效率的影响因素：转化效率受到多种因素的影响，如DNA浓度、细胞状态、转化方法等。
在本实验中，我们通过改变转化体系中DNA和细胞的比例、转化时间等条件，探究了这些因素对转化效率的影响。
结果显示，较高的DNA浓度和适宜的细胞状态有利于提高转化效率。
此外，热冲击法和电穿孔法在不同实验条件下的转化效率也存在差异，需要根据具体实验要求选择合适的转化方法。
2. 质粒DNA的筛选：通过在含有抗生素的LB平板上筛选转化细胞，可以筛选出含有目标基因的细胞。
在本实验中，我们使用了氨苄青霉素作为抗生素，通过对转化后细胞的培养和筛选，成功获得了抗生素抗性的细胞克隆。
3. 转化效率与实验条件的关系：我们分别以不同的DNA浓度、细胞状态和转化时间进行了转化实验，并计算了转化效率。
实验二 质粒DNA转化大肠杆菌
实验二质粒DNA转化大肠杆菌一、实验目的掌握质粒DNA转化大肠杆菌的方法技术二、实验原理转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程，其原理是细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA 形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物，粘附于细胞表面，经42℃短时间热击，促进细胞吸收DNA复合物，将细菌放置在培养箱中保温一段时间，促使在转化过程中获得新的表型得到表达，然后将细菌培养物涂在含有Amp的选择培养基中。
三、实验仪器及药品仪器：超净工作台、恒温摇床、制冰机、恒温培养箱、-70℃冰箱、水浴锅材料：大肠杆菌JM109、pUC19质粒、离心管试剂：LB固体培养基、20mg/mL X-gal、20mg/mL IPTG四、实验内容1、取200μL新制备的感受态细胞，加入DNA 2 μL（50 ng）混匀，冰浴30min，同时用pUC19做两个对照。
1）受体菌对照：200μL感受态细胞+ 2 μL 无菌水2）质粒对照：200μL 0.1mol / L CaCl2溶液+ 2 μL 质粒DNA2、将管放在42℃水浴90s。
3、立即冰浴2 min。
4、每管中加入800μL 的LB液体培养基，培养45min~60min（140rpm）。
5、向两个转化平板中先加入40μL IPTG，再加入40μL X-gal，并用灭过菌的涂布棒将这两样药品涂满平板。
6、然后将适当体积（100μL）转化的感受态细胞涂匀平板。
7、倒置平皿37℃培养12~16 h，出现菌落。
五、实验结果各实验组观察并记录皿内菌落大的生长状况并进行结果分析。
六、思考题如何提高转化率？。
质粒转化大肠杆菌
对阳性克隆进行质粒 DNA提取和检测。
03
实验结果分析
阳性克隆的确认
筛选方法
通过在选择性培养基上培养转 化后的菌落，对可疑阳性克隆
进行初步筛选。
验证方法
对初步筛选出的阳性克隆进行菌落 PCR验证，确保阳性克隆中已成功 导入了外源DNA。
验证指标
通过观察PCR产物电泳图，判断阳 性克隆是否含有目的基因片段。
通过电转化仪进行电转化，将质粒DNA转入大肠杆菌 。
转化实验操作
调整电转化参数至合适值。 将转化后的细胞接种到筛选阳性克隆的培养皿中。
将制备好的感受态细胞与质粒DNA混合，进行电转化实 验。
通过离心和热激法将细胞恢复到正常状态。
筛选阳性克隆
通过菌落PCR或酶切 电泳等方法筛选阳性 克隆。
对质粒进行测序验证 ，确认插入片段的正 确性。
增加离心和洗涤步骤
在制备感受态细胞时，加入离心和洗涤步骤可以去除多余的 钙离子和其他杂质，提高感受态细胞的质量和转化效率。
使用更高效的感受态细胞
选择不同品系的感受态细胞
不同品系的感受态细胞具有不同的转化效率。因此，可以通过试验比较不同品系的感受态细胞的转化 效率，选择更高效的感受态细胞。
通过培养条件优化感受态细胞
通过调整培养基的成分、温度、时间等参数，可以优化感受态细胞的生长和状态，提高其转化效率。
THANKS
感谢观看
在生物安全柜中操作，确保实验过程的安全性。
实验操作规范
使用无菌技术，确保实验过程 的无菌性。
将大肠杆菌和质粒分别转化到 合适的培养基中，并进行培养 。
在转化过程中，需要使用感受 态细胞，以确保质粒能够成功 导入大肠杆菌中。
问题与解决策略
实验11、重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞
实验十一、重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞【实验目的】掌握质粒转化大肠杆菌的方法。
【实验原理】大肠杆菌感受态细胞中加入质粒，则质粒DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞表面，经过42℃短暂的热激处理后，DNA与Ca2+形成的复合物进入大肠杆菌细胞，在不含抗生素的培养基中短暂培养，使转入大肠杆菌质粒上的抗生素抗性基因表达，在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌（含质粒）与未转化细菌分开，转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落，而未转化的细菌则不能。
【器材与试剂】1．实验仪器培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，微孔滤器（含0.22μm滤膜），酒精灯2．实验试剂氯化钠（AR），无水氯化钙（AR），蛋白胨，酵母提取物，1.0 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，琼脂粉，LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，800 mL 蒸馏水溶解后，用NaOH溶液调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min；LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，800 mL蒸馏水溶解后，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，然后加入琼脂粉15 g，121℃高压灭菌20min，分别倒入无菌培养皿。
若配制选择性培养基，当温度降至60℃左右时，加入1 mL氨苄青霉素溶液（100mg/mL），混匀，分别倒入无菌培养皿；CaCl2溶液：准确称取无水氯化钙11.1 g，用双蒸水溶解，并定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min，4℃保存；氨苄青霉素钠溶液：准确称取氨苄青霉素钠0.5 g，用蒸馏水溶解并定容至5 mL，用微孔滤器过滤除菌后，分装于Eppendorf管中，-20℃保存。
3.实验材料E.coli DH5α，pUC18质粒【实验步骤】1、取制备好的存放于超低温冰箱的大肠杆菌DH5α感受态细胞，放置于冰上静止5~10min 待其完全溶解。
大肠杆菌转化实验(热击法)
大肠杆菌转化实验（热击法）大肠杆菌转化可以：（1）将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制，增殖和表达，以获得目的基因；（2）验证大肠杆菌感受态细胞效果；（3）用于分子生物学其他研究。
1原理：质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。
2器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。
3材料和试剂：质粒DNA，重组DNA，培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。
4实验准备：无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。
5操作步骤：（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。
（2）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。
（3）加入10μl连接产物（一般是全部连接产物）（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。
（4）轻轻摇匀后插入42℃水浴中90秒进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5min。
（5）在超净工作台中向上述各管中分别加入900μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡30min到50min（6）在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。
（7）如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
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三大步、七小步、四离心 三溶液及三合一 两注意
大肠杆菌感受态的制备及质粒的转化
2015.06.20
一、什么是感受态细胞（Competent cell）
细胞经过一些特殊方法的处理后, 细胞膜的通透性发生了暂时性改变, 成为能允许外源DNA分子进入的 状态，处于这种状态的细胞称为 Nature state 感受态细胞 。
转化、转染及转导之间的相同及不同 载体（vector) 病毒 质粒 噬菌体
转导 （Transduction)
/~kroberts/Lecture/Chapter%207/horizontal.html
三、如何筛选转化成功的细胞 （发扬个性）
抗性筛选
总结
菌液 CaCl2
含有质粒 的细菌
“四步冷、一步热” （1）在制备感受态细胞时一定要在低温进行（温度的要求） （2）在热休克质粒转化的过程中一定要注意快速 （时间的要求）
重点及思考题 重点：
(1)CaCl2方法制备大肠感受态细胞的原理； (2)质粒转化过程的步骤及关键环节； (3)质粒转化后进行筛选的依据；
CaCl2方法的历史
斯坦利· 柯恩 Stanley Cohen
赫伯特· 波伊尔 Herbert Boyer
1973年实现了质粒DNA转化大 肠杆菌的感受态细胞 。
CaCl2 + 热击法 细菌+质粒 细菌含质粒
感受态制备及质粒转化
E.Coli DH5а （无质粒） p32质粒 （实验五提取得到的质粒）
Competent state
二、什么是转化及与其相似的概念 载体（vector) 病毒 噬菌体
转化 （Transformation)
转染 （Transfection)
质粒
转导 （Transduction)
PEI,脂质体， 磷酸钙等
/users/chagedor/biol_4684/Methods/genes.html
蓝白斑筛选
四、制备感受态细胞的方法
通常制备感受态细胞的方法有两种：电击法和化学法
两种方法比较 电击法（土豪法） 化学法（屌丝法） 转化效率高，但需要昂贵的设备 操作简单无需特殊设备，转化率较高
2
电击法制备感受态及转化的原理
+
-
CaCl2方法的历史
1970年M. Mandel和A. Higa发现经过氯化钙处理 的生长期大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。
思考题：
（1）感受态细胞在生理上与普通细胞有何差异？这种差异 对于转经外源DNA有什么特别作用？
（2）影响转化率的因素有哪些？
（1）实验材料
（2）实验试剂
液体培养基 低渗MgCl2和CaCl2溶液
（1）CaCl2法制备大肠杆菌感受态过程
0.5
(小冷)
(大冷)
（2）质粒转化（Heat shock)
100ul
(0.5ul) 10分钟
100 5
加入200微升含有氨苄青霉素的液体培养基中， 37摄氏度，复苏30min.
（共冷）
（2）低温使得细胞膜的膦脂双分子层的流动性变慢
2、在“大冷”条件下发生了什么改变？
（1）低渗的CaCl2和MgCl2溶液使得细胞发生膨 胀
（2）Ca+2离子与细胞膜上的磷酸根离子结合
（3）低温条件下Ca+2会使细胞膜膦脂双分子层形成液晶结构， 促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域。
（4）Mg+2对于Ca+2具有协同作用
质粒转化的原理
3、感受态细胞和质粒共同冰浴时发生什么改变？
（1）质粒DNA可以围绕在感受态细胞周围 （2）Ca +2 又与质粒DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase） 的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在感受态细胞膜的外表面上
4、在热休克时发生什么改变？
短暂的42℃热脉冲处理，感受态细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，致使 细胞膜的通透性增加，质粒DNA分子便进入细胞内，完成转化。
冰上放置10分钟
100
5
（热激+复苏）
（3）质粒转化后的培养及筛选
氨卞霉素
液培中，将上述液体加到含有氨苄青霉素的固体培养 皿中，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀，放置30分钟。
（个/ug）
(ug/ml)
CaCl2方法制备感受态的原理
1、在“小冷”条件下发生了什么改变？
（1）处于生长对数期的大肠杆菌细胞膜上存在大量的 Adhension zones