大肠杆菌、质粒和噬菌体

细菌质粒性质：
5、质粒对于细菌的生长不是必须的
代表性细菌质粒（1）
F因子（fertility factor）
F因子，又称致育因子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，环状双链DNA，编码94个中 等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。 存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。
★ 菌株基因优化：生物工程用的菌株基因组都被优化过，使之带有不同基因型 （例如β 半乳糖苷酶缺陷型），可用于分子克隆实验。 ★ 操作简便，表达量高：大肠杆菌操作和培养条件简单，适于大规模发酵。表 达的外源基因蛋白量甚至可以达到细菌总蛋白的80%。
大肠杆菌在分子生物学实验中的应用
缺点：
★ 基因结构差异：大多数真核基因含有内含子，细菌中没有除去内含子机制，外源基因 编码区必须是连续的，删除真核基因的内含子和5’非编码区 原核：CDNA 真核：DNA
划线到LB平板上。
质粒概述
质粒（plasmid）是染色体以外能 自主复制的遗传因子
不具有胞外期
对寄主细胞来说是非必需的 符合这三条标准的染色体外DNA或 RNA分子都可以称为质粒。 狭义的质粒：一般是指细菌染色体外的 环状DNA分子。 质粒的命名：一个小写字母p加2-3个 大写字母和数字，如pBV220，pET30 。
大肠杆菌、质粒和噬菌体
郑丽舒
中国疾控中心 病毒病预防控制所
2015.04.15
主要内容
一、大肠杆菌：概述 应用 基本操作 二、质粒：常见质粒 质粒的分离纯化 感受态细胞 质粒转化 三、噬菌体：λ噬菌体及其载体 M13噬菌体及其载体 四、分子克隆
大肠杆菌
大肠杆菌
中文名称： 外文名称： 大肠杆菌 Escherichia coli (Theodor Escherich 1885)
F质粒的整个基因组结构由三个主要区段组成： （1）转移组或通过
转座，F因子可以整合到宿主不同位点上。 由于宿主染色体上IS方向不同，所以整合
的方向也随之不同。
代表性细菌质粒（1）
根据大肠杆菌细胞内有无F质粒及其在细胞内存 在状态可将细胞分为四种类型： ● F+ 菌株： F因子独立存在，细胞表面有性菌毛，为带有F 质粒的雄性细胞
帮助从起始AUG处开始翻译。
大肠杆菌在分子生物学实验中的应用
★ mRNA的分子结构差异：绝大多数真核mRNA分子的3末端有 poly(A)尾巴，在5末端有一个帽结构。真核mRNA不能结合到细菌核 糖上。 ★ 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统：表达的蛋白质不能进行糖基 化、磷酸化修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构想折叠，因而蛋
★ 转录信号不同：真核基因转录的mRNA分子不具有结合细菌核糖体所必须的SD序列 细菌RNA聚合酶不能识别真核生物启动子
SD序列（Shine-Dalgarno sequence）：
细菌mRNA起始密码子AUG上游10个碱基处， 有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌
16SrRNA3’端识别，结合原核生物核糖体，
培养，直至细菌生长到所需密度。
大肠杆菌生长曲线
将一定数量的细菌，接种于适宜的液体培养基中，在适温下培养 ，定时取样测数，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标， 作出的曲线称为生长曲线。 该曲线表明细菌在一定的环境条件下群体生长与繁殖的规律。一 般分为延缓期、对数期、稳定期、衰亡期四个时期，各时期的长 短同菌种本身特征、培养基成分和培养条件不同而异。
肠致病性大肠杆菌（EPEC） 肠产毒性大肠杆菌（ETEC）
肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）
肠出血性大肠杆菌（EHEC） 肠黏附性大肠杆菌（EAEC） 弥散粘附性大肠杆菌（DAEC）
大肠杆菌在分子生物学中的应用
生物工程用菌株：用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞
株系一般称为“工程菌”。大肠杆菌是应用最广泛最成功的首选高效表达 体系；美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。
★ 背景清楚：全基因组测序，共有4405个ORF。遗传背景清楚，并经过一系列 突变筛选，使外源DNA在胞内不易发生重组或修饰，更适于基因操作。
★ 生物安全：生物工程用菌株是在不断筛选后被挑选出的，在自然条件下无法
生长，甚至普通的清洁剂都可以轻易杀灭。即便由于操作不慎导致活菌从 实验室流出，也可避免对自然界造成危害。
质粒概述
质粒DNA的构型：
SC型 OC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） 开环DNA（ocDNA）
L
L型
线性DNA（L DNA）
OC
SC
质粒概述
常见质粒种类： 细菌质粒
真核生物DNA质粒
真核生物RNA质粒
质粒概述
细菌质粒
定义：细菌染色体以外的共价闭合环状DNA分子 ， 立于细胞核进行自主复制。 大小：1-1700 kb之间。携带有数个到数十个甚至上百个基因。 功能：一些基因可产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。 能独
● F- 菌株：
无F因子，无性菌毛，但可以通过接合作用接收 F因子而变成雄性菌株（F+）。 ● Hfr菌株(高频重组菌株)：
F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛
● F′菌株： F质粒从Hfr菌染色体上脱落时，会出现一定概 率的错误，使F质粒带上宿主染色体，这种特殊 的F质粒称为F′质粒。
代表性细菌质粒（2）：
交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在；
细菌质粒性质：
2、质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不同，可把 质
粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种； 严紧型质粒的复制受细胞核控制，与染色体DNA复制相伴随，一般一个寄 主细胞内只有少数几个（1-5）个拷贝； 松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体DNA复制停止的情况下仍可 以进行复制，在细胞内的数量可以达到10-200个或更多。如果用一定的 药物处理抑制寄主蛋白质的合成，会使质粒拷贝数增至几千份。 pBR322即属于松弛型质粒，经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。
严紧型
松弛型
细菌质粒性质：
3、可以通过转化（直接吸收摄入）、转导（噬菌体载体）或接合作用(通 过细胞间紧密接触而实现遗传物质交换)由一个细胞转移到另一个细胞，使 两个细胞都带有质粒；质粒转移时，可以单独转移，也可以携带着染色体
（片段）一起转移，所以可成为基因工程载体。
细菌质粒性质：
4、质粒的不亲合性 定义：在没有选择压力的情况下， 两种亲源关系密切的不同质粒，不 能在同一寄主细胞系中稳定共存。 分子基础:主要是由于复制功能之间 相互干扰造成。有相似的复制子结 构，受到同一拷贝数控制系统的干 扰，使两种质粒最终拷贝数不同， 拷贝数多的质粒在以后的分裂中更 占优势。 ColE1、pMB1; pSC101、F、RP4； p15A,衍生质粒
白质没有足够的生物学活性（缺乏对真核生物蛋白质的复性功能）。
★ 大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，表达的蛋白经 常是不溶的，表达蛋白量超过菌体总蛋白10%时，容易形成包涵体。 ★ 细胞周质中有种类繁多的内毒素很难除去，细菌的蛋白酶可以识别降 解真核生物的蛋白质产物。
应用实例
加拿大人Frederick Banting和Charles Best于1921年首先发现胰岛素 ，1922年开始用于临床，1923年或诺贝尔奖。1965年9月17日，中国科学 家第一个在实验室中人工合成了具有全部生物活力的结晶牛胰岛素。 人的胰岛素基因在大肠杆菌里指挥着大肠杆菌生产出了人的胰岛素。随着 细菌的繁殖，胰岛素基因也一代代传了下去，后代的大肠杆菌也能生产胰岛 素。这种带上了人工给予的新的遗传性状的细菌，被称为基因工程菌。
分类：根据质粒控制的性状，可以把细菌质粒分成抗性质粒、降解质粒 、毒力质粒、共生质粒等类型。
重组：在质粒之间、质粒与染色体之间均可发生 存在范围：如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcus lactis等
细菌质粒性质：
1、可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过
界：
门： 纲： 目：
原核生物界
变形菌门(Bacteria) γ-变形菌纲(Proteobacteria) 肠杆菌目(Enterobacteriales)
科：
属： 种：
肠杆菌科(Enterobacteriaceae)
埃希氏菌属(Escherichia) 大肠杆菌种(E. coli)
大肠杆菌一般特征
◆ 原核生物，G-棒状杆菌(红色) ◆ 有鞭毛，无芽孢，能运动，有的有荚膜 ◆ 长度大约2um，宽0.8um ◆ DNA长度约为体长的1000倍 染色体是长约30kb的环状dsDNA ◆ 兼性厌氧，生长需求非常简单，在仅含碳水化合物 和少量氮源及无机盐的培养基上即可生长 ◆ 主要寄生于大肠内，约占肠道菌1%，正常栖居条件下不致病
大肠杆菌
水分 70% 蛋白质 15% 碳水化合物 3% RNA 6% DNA 1% 矿物离子 1% 其他成分 4%
大肠杆菌
Escherich在1885年发现E.coli，广泛存在于人和温血动物肠道中， 44.5℃发酵乳糖产酸产气。最初认为是非致病菌。20世纪中叶，认识 到一些特殊血清型E.coli对人和动物致病，引起严重腹泻和败血症。 根据不同生物学特性将致病性大肠杆菌分为6类：
● 液体LB培养基：每升含胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，高压 灭菌15磅30分钟。
● 固体LB培养基：基本同上，加琼脂15克/升。高压灭菌后，冷却至50℃左右 ，可根据需要加入适当的抗菌素或其它试剂，混匀后倒入平皿中。
● 半固体LB培养基：基本同上，琼脂浓度为6克/升。高压后室温保存备用。使 用前在水浴或微波炉溶化。
■ 复苏时用接种环蘸取少许带菌琼脂，划线到LB平板上。
菌株的保存与复苏