感受态细胞的制备和质粒的转化
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究
枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究李瑞芳;薛雯雯;黄亮;熊前程;王彬【摘要】为便于枯草芽孢杆菌工业化生产应用,对Spizizen创立的枯草芽孢杆菌DNA转化方法进行改进.用GMI和GMII溶液处理枯草芽孢杆菌野生型菌株BS501a、营养缺陷型突变株DBl342和非营养缺陷型突变株WB800,用改进的方法制备感受态细胞,用7.5kb质粒pSBPTQ进行转化,并研究RNA、酵母粉、水解酪蛋白、培养方法对枯草芽孢杆菌质粒转化的影响.结果表明,该方法适用于不同基因型枯草芽孢杆菌的质粒转化,营养缺陷型突变株DBl342的转化率为750 CFU/μg/DNA,非营养缺陷型突变株WB800转化率为1 070 CFU/xg DNA,野生型菌株BS501a转化率为270 CFU/μg/DNA.根据影响转化效率的因素,推测在该方法中,枯草芽孢杆菌质粒转化原理:一定生物量的枯草芽孢杆菌在外界营养条件和钙、镁离子作用下,细胞壁和细胞膜形成缺陷,使外源DNA转入枯草芽孢杆菌细胞内.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)005【总页数】4页(P227-230)【关键词】枯草芽孢杆菌;感受态细胞;质粒转化方法【作者】李瑞芳;薛雯雯;黄亮;熊前程;王彬【作者单位】河南工业大学生物工程学院,郑州450001;河南工业大学生物工程学院,郑州450001;河南工业大学生物工程学院,郑州450001;河南工业大学生物工程学院,郑州450001;河南工业大学生物工程学院,郑州450001【正文语种】中文枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属中具有应用价值的菌种之一。
建立简便、有效的DNA 转化方法,对枯草芽孢杆菌的基因改造、提高其生产性能具有重要意义。
枯草芽孢杆菌质粒转化方法主要有原生质体转化[1]、电击转化[2]和CaCl2转化[3]。
与电击转化方法相比,原生质体转化条件温和,不需相应的转化设备,但转化效率低;CaCl2转化耗时长,转化效率也不高。
感受态细胞的制备和质粒的转化
感受态细胞的制备
• 实验目的：学习感受态细胞的制备过程 • 实验材料：大肠杆菌菌株DH5或DH10B • 实验原理：电转化法是利用瞬间高压在细胞上打
孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生 长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少 的导电离子。转化效率为109～1010 转化子/µg DNA； • 对于热激法，是利用冰冷的CaCl2/TSS处理对数 生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受 态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～ 107转化子/µg DNA。
击；
• 立即加1ml SOC培养基到转化杯中重悬细胞； • 将细胞转入合适的培养管中37ºC培养1小时； • 吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板； • 37ºC培养过夜，观察结果。
• 附注：
• 利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转 化细胞铺平板的密度要低（90mm平板上不 得超过105个菌落），同时37℃培养不应超 过20小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可 将－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活 菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉 素敏感的卫星菌落的出现。
打匀，使细胞重新悬浮； • 细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）
后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实 验步骤
– 前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇 床培养过夜；
– 取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养 至OD600＝0.6（约2.5-3小时）；
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
质粒的转化及转化子的鉴定
• 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建 的重组子导入细菌的过程。将连接产物转 化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖， 便于后续分子操作。可以采用多种方法筛 选和鉴定目的克隆。
感受态细胞的制备和质粒的转化实验
生物工程大实验学院：生命科学学院专业： 10级生物工程班级：三班姓名：林冬学号：指导教师：肖露老师感受态细胞的制备和质粒的转化实验一．实验目的：1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。
2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。
二．实验原理：细菌吸收外源DNA 的能力最高时的状态被称为感受态细胞。
有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态，如本实验所用的大肠杆菌。
用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。
对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。
这种转化方法称为“化学法”。
三．材料：设备与试剂四．实验方法：①取100mlDH5ɑ培养物置于冰浴中10min，同时将0.1mCacl2和灭菌的50ml离心管4℃中放置10min.②在无菌条件下将培养物移入50ml离心管中（不能超过2/3体积约30ml）平衡后对称放入离心机，在4℃，6000转/min,离心5min,停止离心后，弃上清液（在超净工作上无菌条件下操作）③加入5ml预冷的0.1molCacl2溶液，用涡旋振荡器振荡均匀使DH5ɑ细胞重新悬浮，置于冰水浴中旋转20min后，在4℃6000转/min离心5min,弃上清。
④细胞重复③一次，离心后弃上清，沉淀后用4mlCacl2悬浮，加灭菌甘油至浓度15％左右，混匀后分装于1.5mlEP管中，200ul/管，于80℃冰箱中冻存备用。
转化实验：200ul感受态→加入1ul质粒混匀→42℃水浴90s→迅速拿出置于冰浴2min→加入800ulLB培养基→37℃，220rpm振荡培养1h→取出100ul涂板。
单菌落扩大培养用接种环挑单菌落接入含150ml液体LB培养基锥形瓶中。
37℃，120rpm摇瓶培养，直至透过菌悬液看报纸上的字能够看出形状但不能辨认。
实验5：大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化报告
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态 细胞总数
五、注意事项
1、冰上操作； 2、无菌操作； 3、重悬细胞时操作要轻； 4、实验应设有阳性对照，以估计转化效率；
应设立阴性对照，以消除可能的污染及查 明可能的失败原因。
实验四 大肠杆菌感受
态细胞的制备和质粒 DNA转化
实验目的和要求
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞；
学习用热激法将外源基因导入感受 态细胞。
实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 注意事项
一、实验原理（CaCl2法、热激法）
1、几个概念
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另 一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研 究的基本实验技术。
(一) 纯化及活化菌种（无抗生素的LB ）
单菌落
l mL培养液
冻存菌在新鲜LB
平板上，划线， 37℃培养16~20 h。
挑一单菌落接种到3 mL LB液体培养基 中，37℃培养过夜
取l mL培养液加到 100 mL LB液体培养 基中，37℃摇床培养 2~3 h ，当其OD600 为0.3～0.5时(细胞数 <108/mL)，立即取出， 冰浴10～15 min。
(二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
l、将菌液转移到两个冰冷离心管中，平衡 后于4℃，5000 r/min离心10 min，弃尽上 清(可用加样器将残余液体尽量去净)。— —收集沉淀
2、各加10 mL 0.1 mol/L冰冷的无菌CaCl2溶 液重悬细胞，于冰上放置15 min．于4℃， 5000 r/min离心10min，弃上清。 —— CaCl2洗涤细胞转化效率的因素
25 生物化学实验--大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化【目的】1. 掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验方法和技术。
2. 熟悉大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验原理。
【原理】1. 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化原理细菌的生物学特性由于吸收外源 DNA 发生可遗传的改变叫转化，在基因克隆技术中，转化（ transformation ）特指以质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
转染（ transfection ）是指噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。
未经特殊处理的宿主细胞较难进行转化，细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。
重组 DNA 转化细菌的技术操作关键就是通过一定的方法，人工诱导细菌进入一个敏感的感受态，以便外源 DNA 进入细胞内。
本实验采用氯化钙溶液处理对数生长期的E.coli. DH-5α细胞 , 使E.coli. DH-5α细胞的通透性增加，摄取外来 DNA （本实验中的质粒 DNA 为 pUC-18 ）能力增加，其原理为当细菌处于0 ℃ ， CaCl 2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNAase 的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃ 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。
2. 转化大肠杆菌的筛选由于 pUC-18 （如图）含有 Amp r （氨苄青霉素抗性）基因便具有在含 Amp 培养基上生长的能力，形成单个菌落，而未转入 pUC-18 的E.coli. DH-5α细胞，不具有 Amp r 基因，在含 Amp 的培养基中，生长受到抑制，不能形成肉眼可见的菌落，从而使转化和未转化宿主细胞得以区分开来。
进一步将转化菌涂布在含IPTG 和 X-gal 的 LB 平板上，由于 pUC-18 还带有一段大肠杆菌β- 半乳糖苷酶基因（ lacZ ）的启动子及其编码α- 片段的 DNA 序列，此结构成为lacZ ＇基因，在 lacZ ＇基因中的靠近 5 ＇端有一段多克隆位点（ MCS ），而大肠杆菌含有β- 半乳糖苷酶ω片段的编码基因，尽管载体和宿主编码的这两个片段都没有活性，但两者同时存在时能够融为一体，形成具有酶活性的蛋白质，这样 lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α- 互补。
大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化[荟萃知识]
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行业知识
• CaCl2 法是目前常用的感受态细胞制备方 法，简便易行，且其转化效率完全可以 满足一般实验的要求，制备出的感受态 细胞暂时不用时，可加入占总体积15％ 的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此 CaCl2法使用更广泛。
行业知识
③ 彻底弃去上清液，再加入0.6mL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液缓和悬菌，冰浴10 min ； ④ 4000r／min离心10min； ⑤ 弃去上清液，加入0.2mL冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液缓和悬菌，冰上放置待用。
行业知识
• 质粒DNA的转化
① 分别用2个100µl感受态细胞悬液(如是冷 冻保存液，则需化冻后马上进行下面操 作：
大肠杆菌感受态细胞的制备 与质粒DNA的转化
行业知识
• 实验目的 • 实验原理 • 实验试剂 • 实验步骤 • 注意事项
行业知识
一、实验目的
• 了解转化的概念及其在分子生物学研究 中的意义。
• 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞 的方法。
• 学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并 筛选转化体的方法。
行业知识
四、实验步骤
• 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
①从E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于LB 液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将该菌悬液 以1:30～100接种于LB液体培养基中，37℃ 250r/min活化培养2-3h至OD600=0.2-0.4时停止培 养;
②每人取1个离心管，加入1.5ml菌液，在冰上放置 10min后，于4℃，4000r／min离心2min（从这一 步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而 稳）；
〖医学〗感受态细胞的制备与质粒DNA的转化
一、实验原理
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞, 使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分 子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl) 等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性 的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞 (Competent cells)。将经过转化后的细胞在筛选培养基 中培养,即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源 DNA分子的受体细胞)。
实验结果:下次实验观察并分析筛选结果
四、注意事项
➢ 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因 素: 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接 或储于４℃的培养菌,最好从－70℃或-20℃甘油 保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌 液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可 通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株 的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右 (不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度 过高或不足均会影响转化效率。
四、注意事项
➢ 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是 最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好 分装保存于干燥的冷暗处。
➢ 4. 防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均 应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip 头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试 剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶 或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂 DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要 的麻烦。
五、质粒DNA转化常见问题
大肠杆菌感受态细胞的制备原理步骤以及重组质粒转化
大肠杆菌感受态细胞的制备原理步骤以及重组质粒转化GE GROUP system office room 【GEIHUA16H-GEIHUA GEIHUA8Q8-一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
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• 质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤 • 制备选择性培养基平板：在融化的250ml LA培养基中250 l Amp （100mg/ml），250 l X-gal (20mg/ml)，25 l IPTG (200mg/ml)， 混匀后倒入灭菌培养皿中； • 取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化； • 每管感受态细胞加入1l连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上； • 电转化仪选择1800V作为输出电压； • 将要转化的混合物加入预冷的1 mm的电转化杯中，立即按下按纽电 击； • 立即加1ml SOC培养基到转化杯中重悬细胞； • 将细胞转入合适的培养管中37º C培养1小时； • 吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板； • 37º C培养过夜，观察结果。
电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实 验步骤
– 前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇 床培养过夜； – 取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养 至OD600＝0.6（约2.5-3小时）； – 将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作 – 吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； – 4℃下3000g冷冻离心5分钟； – 弃去上清，加入1500ul冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀， 使细胞重新悬浮； – 4℃下3000g冷冻离心5分钟 – 弃去上清，加入750ul冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使 细胞重新悬浮； – 4℃下3000g冷冻离心5分钟 – 加入20ul冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； – 立即使用或迅速置于-70º C超低温保存。
质粒的转化及转化子的鉴定
• 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建 的重组子导入细菌的过程。将连接产物转 化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖， 便于后续分子操作。可以采用多种方法筛 选和鉴定目的克隆。
• 实验目的：掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细 胞及转化子的鉴定方法。 • 实验材料：外源片段与载体的连接产物；大肠杆菌感受态 细胞。 • 实验原理：（1）热激法：大肠杆菌在0℃ CaCl2低渗溶液 中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗 DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短 时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养 基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化 的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上 可挑选所需的转化子。 • （2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不 稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞， 也有利于孔DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的 极性对于它运输进细胞也是非常重要的。
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤
• 前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃ 摇床培养过夜（约16小时）； • 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡 培养约2.5-3小时（250-300rpm）； • 将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操 作 • 吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； • 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； • 弃去上清，加入100ul预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动 打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟； • 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； • 弃去上清，加入100ul预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动 打匀，使细胞重新悬浮； • 细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油） 后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
热激法转化实验步骤
• 制备选择性培养基平板：在融化的250ml LA培养基中250 ul Amp （100mg/ml），混匀后倒入灭菌培养皿中； • 取出3管制备好的感受态细胞，放在冰上融化； • 每100 ul感受态细胞加入约20ng质粒DNA，3管分别加连接产物、标 准超螺旋质粒DNA（阳性对照）及不加入任何DNA（阴性对照），用 移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30分钟； • 热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管； • 冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟； • 复苏：每管加400 ul LB培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟， 使细菌复苏； • 布皿：取适当体积均匀涂布于含有、抗生素（Amp）的LA平板； • 培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时 即可观察菌落
感受态细胞的制备和质粒的转化
感受态细胞的制备
• 实验目的：学习感受态细胞的制备过程 • 实验材料：大肠杆菌菌株DH5或DH10B • 实验原理：电转化法是利用瞬间高压在细胞上打 孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生 长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少 的导电离子。转化效率为109～1010 转化子/µg DNA； • 对于热激法，是利用冰冷的CaCl2/TSS处理对数 生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受 态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～ 107转化子/µg DNA。
附注
• 影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项： • 细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使 用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5菌株 OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）； • 所有操作均应在无菌条件和冰上进行； • 经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的 推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活 菌数随时间延长而减少造成的）； • 化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子 （如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效 率大大提高（100-1000倍）； • 所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大 大降低细菌的转化效率； • 质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA； • 一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；
• 附注： • 利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转 化细胞铺平板的密度要低（90mm平板上不 得超过105个菌落），同时37℃培养不应超 过20小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可 将－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活 菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉 素敏感的卫星菌落的出现。
Hale Waihona Puke