十七烟草原生质体融合
原生质体融合技术简介
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中国科学院青岛生物能源与过程研究所
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology
原生质体研究的发展
1838 1873 1896 1931 1954 1958 1970 1972 1972 1974 1976 1976 1977 1978 1981 1988 2002 Muller Lugmbuthl Unna Wathin Bnders et al Marston Power et al Carlson Ferenczy et al Michayluk Ferenczy et al Fodor et al Hopwood Gleba et al Menczel Kirimalra et al Stemmer et al 动物病理组织中发现多核细胞 天花病脓胞周围发现多核细胞 水痘侵害过的皮肤中发现多核细胞 麻疹病人扁桃腺中发现多核细胞 组织培养中发现麻疹病毒能诱导细胞用和成多核体 用副流感病毒诱发细胞融合 探索用硝酸钠诱导植物原生质体融合 用NaNO3进行了烟草种间原生质体融合 以白地霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 发现PEG是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 发现 以曲霉 青霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 巨大芽孢杆菌内株间原生质体融合成功 链霉菌原生质融合并获融合重组子 用PEG+高pH-Ca2+研究原生质体融合 高 用高pH-Ca2++9℅DMSO与少量 与少量PEG获得较高的融合率 用高 与少量 获得较高的融合率 原生质体PEG融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 原生质体 一种新的体内分子育种方法——全基因组改组技术 全基因组改组技术 一种新的体内分子育种方法
原生质体融合技术
原生质体融合技术的局限性植物原生质体是指用特殊方法去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生团。
这种裸露细胞在适当的外界条件下，还可形成细胞壁，进行有丝分裂，形成愈伤组织和诱发再生植株，因而仍然具有细胞的全能性。
植物原生质体融合技术是借鉴于动物细胞融合的研究成果，在原生质体分离培养的基础上建立起来的，以植物的原生质体为材料，通过物理、化学等因素的诱导，使两个原生质体融合在一起以致形成融合细胞的技术。
它不是雌雄孢子之间的结合，而是具有完整遗传物质的体细胞之间的融合，是2种原生质体间的杂交。
通过原生质体融合可以把带有不同的基因组的两个细胞结合在一起，与有性杂交相比，无疑可以使“杂交”亲本组合的范围扩大，不但可以利用细胞核内基因资源，还可以利用包含在细胞质中的诸如叶绿体和线粒体DNA的遗传资源。
原生质体培养是细胞杂交的基础，但是直到目前为止，也只有360多个种的原生质体培养再生了完整的植株，大多数重要的植物尤其是木本植物如葡萄、棕榈、橡胶、茶、香蕉、椰子和芒果等的原生质体再生仍然很困难，或者还未进行深入研究。
在原生质体再生的物种中，茄科占了将近1/4，并且用于育种目的的大多数体细胞杂种和细胞质杂种也比较集中于茄属、烟草属、苜蓿属、柑橘属、芸薹属和番茄属等6个属中。
因此，为了有效地进行植物遗传改良，不但要使杂种细胞再生成完整植物，而且还必须提高植株再生的频率，以便有足够的群体进行有效的选择。
但目前存在的一个普遍的问题使许多原生质体再生的程序似乎较低，重复性较差，并且还具有基因型的依赖性。
为了将体细胞杂交技术应用于更多的植物中，还需要更加深入地研究植物细胞的分化、脱分化和再分化等发育机制。
1.技术局限性植物细胞杂交的本质是将两种不同来源的原生质体，在人为的条件下进行诱导融合。
由于植物细胞的全能性，因此融合之后的杂种细胞，可以再生出具有双亲性状的杂种植株。
因此，细胞融合也叫原生质体融合或细胞杂交。
其包括三个主要环节：诱导融合；选择融合体或杂种细胞；杂种植株的再生和鉴定。
植物原生质体融合
植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义，在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。
它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。
原生质体的分离分离原生质体时，首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁的纤维素上去，因此，一般先将材料分离成单细胞，然后分解细胞壁。
采用将酶液减压渗入组织，或将组织切成薄片等方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。
酶处理目前常用的多是“一步法”，即把一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体。
植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。
每克材料用酶液10～30ml不等。
由于不同材料的生理特点不同，在研究游离条件时，必须试验不同渗透压浓度的细胞，找出适宜的渗透浓度。
例如，游离小麦是浮细胞的原生质体的酶液中须加入0．55mol/L甘露醇，游离水稻悬浮细胞的原生质体的酶液中只加0．4～0．45mol／L的甘露醇，两者差别较大。
酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。
去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。
如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。
对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。
酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。
对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。
酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。
但是，时间过长对原生质体有害，所以一般不应超过24h。
酶解温度要从原生质体和酶的活性两方面考虑。
试验十七烟草原生质体融合
学习植物原生质体融合的方法，为进行体细 胞杂交，培育体细胞杂种和胞质杂种打下基础。
三、实验材料和用具
1、材料：烟草BY2愈伤组织，烟草组培苗 2、用具：过滤器，注射筒，不锈钢网筛 （=54m），漏斗，三角瓶，滴管，10ml刻度离 心管，血球记数板。
四、实验步骤
1、配制酶液
各组（2人）配制下列酶液各10ml， 4000rpm离心6min后过滤灭菌于无菌三角瓶中。
（4）溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris.HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0）
（5）溶液III： 60 ml 5mol/L乙酸钾, 11.5 ml 11.5％冰乙酸 水
, 28.5 ml无菌
（6）分别配制0.4 mol/L NaOH和2％SDS溶液（各50ml）
CPW培养基+0.4mol/L甘露醇+2%纤维素酶 +0.5%离析酶
2、BY2愈伤组织和叶肉原生质体分离
2～3周龄愈伤 组织和叶片各 约1g和0.5g，叶 片剪成细条
加入到酶液中、 用镊子分散愈 伤组织
黑暗、 25℃酶
解5~6小时，间 歇轻轻摇动。
3、过滤和离心洗涤原生质体
过 滤
800rpm离 心3min
（4）原生质体融合步骤
取0.2ml混 合原生质 体悬浮液
加入0.2ml 高钙 高pH PEG融合 液
静置 10min
5min内缓慢加
入5ml W5稀释 液，轻轻吸打混
匀
重新悬浮在 0.5ml W5，静 置>10min
800rpm离心 3min，弃上 清夜
静置>30min
（5）融合原生质体的观察
14.4原生质体融合的方法
原生质体融合的方法原生质体融合又叫体细胞杂交，是指将不同来源的植物原生质体进行融合，再经培养获得杂种植株的过程。
一、盐类融合法1909年，Kuster用低渗NaNO溶液引起原3生质体的融合。
融合方法获得1972年，Carlson等用NaNO3了第一株体细胞杂种，即烟草与其野生种间体细胞杂种（粉蓝烟草与郎氏烟草）。
原理：NaNO3、KNO3、Ca(NO3)2、NaCl、CaCl2等。
通过改变细胞膜表面的理化特性，增加细胞的内吞作用，而实现融合。
应用最早的融合法，但由于异核体形成率低，且对细胞有毒害，目前已不太应用。
二、高钙-高pH融合法1973年，Keller和Melchers用强碱性的高浓度钙离子（5mM CaCl2·2H2O，pH10.5）溶液融合烟草叶肉原生质体，获得种内及种间体细胞杂种。
原理：CaCl 2•2H 2O 0.05mol /L ，pH9.5-10.5，可使质膜表面特性发生改变，而发生融合。
异核体形成率有所提高，但对细胞有一定毒害，目前已不太应用。
三、聚乙二醇（PEG）融合法1974年，Kao和Michaylub用聚乙二醇(PEG)作融合剂，明显提高了异核体的形成率，且对细胞的毒性很低。
因此，该方法迅速展开。
1978年，用PEG法，成功获得了西红柿与马铃薯第一个属间体细胞杂种。
薯番茄或番茄薯PEG融合原理：短时间内，细胞质膜粘连，形成分子桥，进行融合。
四、PEG 、高钙-高pH 相结合的融合法PEG 融合液PEG600030%Ca(NO 3)2•4H 2O0.1M 甘露醇0.4-0.6M pH 10.0五、电融合法开发较晚，1979年，Senda发现电融合方法。
由于对细胞无毒害，已广泛应用。
电融合必须有融合仪和融合板。
电融合仪融合板两个电极原生质体电融合的基本程序①细胞膜的接触：两极通以交变电流，使原生质体沿电场方向排列成串珠状；②膜的击穿：再给以瞬间的高强度电脉冲，使原生质体膜局部受损失而导致融合。
原生质体培养与融合
飘浮法
采用比原生质体密度大的高渗溶 液（蔗糖、Percoll、Ficoll）， 使原生质体漂浮在液体表层的纯 化方法。 优点： 可以避免分离的原生质体因震 荡被组织碎片撞击而破损。 所用药品简单，成本低。 缺点及补救措施： 对离心力要求比较严格，掌握不 好，原生质体则不易漂浮。可采 用不同浓度和不同离心速度分次 漂浮的方法。
影响原生质体培养的因素
培养条件
温度，光照
植物材料和基因型
柑桔，葡萄，桃
供体细胞的生长同步性
原生质体再生过程
原生质体再生过程是指分离、纯化的原生质 体在适当的培养方法和良好的培养条件下， 很快恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细 胞团，最后或通过愈伤组织或通过胚状体分 化出完整植株的过程。 细胞壁再生 细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成 植株再生
胡萝卜培养 6d 细胞
8~10d形成细胞 10~ 5~30 团，4周后形成 20 胚状体
矮牵牛愈伤 4d 组织 2~ 油菜叶片 3d
10
马铃薯子叶 48h 46.1 马铃薯花粉 2h
2周后形成20~25 个细胞的细胞团 15d形成细胞团 28d愈伤组织 9~10d形成16个 细胞的细胞团 15d形成细胞团
影响原生质体培养的因素
原生质体的活力
原生质体的起始密度
适宜密度在104~105个／ml左右。在烟草叶原生
质体培养中，密度低于103个／ml时，细胞只能 分裂一、二次，密度在104个／ml以上，植板率 常显著提高。
渗透压稳定剂 培养基营养
原生质体培养经常使用的KM-P培养基就
是以B5培养基为基础；N6培养基则以MS 培养基为基础 改进的。
渗透压稳定剂
细胞融合的基本原理和方法
细胞融合的原理：
微生物的细胞融合，需要先将细胞壁溶解后，由原生质体进行融合。
在微生物中，通过原生质体融合技术的处理可以培育出新的菌种。
细胞融合的方法：
1.病毒诱导助融：细胞融合在自然界是存在的，细胞融合研究第一也是基于自发的细胞融合，1957年，冈田善雄意外发现仙台病毒，能诱导悬液中艾氏腹细胞融合，然后Harris、Kada 等用于诱导种间细胞融合，获得成功。
2.化学助融：1972年，卡尔森第一用硝酸钠进行烟草两个种的细胞原生质体的融合，1974年Kao等第一发现聚乙二醇能诱导植物细胞原生质体融合产生杂交细胞。
3.1975年Pentecorvo，发现聚乙二醇亦能帮助哺乳类动物细胞的融合，1976年Davidson更进一步证实这一结果，并且认为其具有简单快速、高效率等优点。
4.因而，1975年之后聚乙二醇就逐渐取代了仙台病毒.3：电融合法：电融合法是70年代未期和80年代初期发展起来的一种新的细胞融合方法。
5.Senda在1970年第一应用电脉冲，通过微电极在显微镜下使植物细胞融合，奠定电融合技术基础。
6.激光诱导卵细胞融合：激光诱导卵细胞融合是最新的细胞融合方法，该法为张闻迪等人第一应用，他们利用激光微束的单色性、高功率密度、短脉宽和极小的作用范围等特点。
7.对泥鳅受精卵进行融合试验，获得成功，且融合后的细胞可存活发育，经卵裂期、囊胚期、原肠期、孵化期、直至幼鱼。
8.整个过程可通过显微镜观察，还可同时由电视摄象监视器观察和进行照相记录。
烟草种间叶肉原生质体融合方法的研究
烟草种间叶肉原生质体融合方法的研究烟草作为一种重要的经济作物，世界各地都有烟草的种植和加工。
烟草叶肉原生质体是研究烟草发育和分子遗传育种重要组成部分，目前正在快速发展中，它在烟草遗传育种过程中起着重要作用。
现有方法主要是利用烟草的一些特性，如长稻、短稻和水稻的离体叶肉，利用逆熵融合的方法融合不同类烟草原生质体，以获得烟草新的优良性状。
烟草的叶肉原生质体融合是一种重要的技术，其技术有效性决定了育种的成败。
目前，烟草叶肉原生质体融合技术主要包括电解质融合、穿透和渗析融合、逆熵融合和烟草低温冻存原生质体融合等方法，每种方法都有其特定的优势和局限性。
本研究以烟草种间叶肉原生质体融合技术为研究对象，以确定其可行性为目标。
为了实现该目标，首先采用了烟草品种进行烟草叶肉原生质体融合的实验。
其次，本研究在此基础上，采用下列方法对叶肉原生质体进行融合：烟草电解质融合、烟草穿透和渗析融合、烟草逆熵融合以及烟草低温冻存原生质体融合；最后，本文着重研究了融合后的烟草叶片和植株的形态和生理特性。
实验结果表明，烟草叶肉原生质体融合方法均能够有效融合原生质体。
当以电解质方法融合烟草叶肉原生质体时，可以获得持久的融合结果；当以穿透和渗析方法融合烟草叶肉原生质体时，可以获得高效融合结果；当以逆熵融合方法融合烟草叶肉原生质体时，可以获得稳定的融合结果；当以烟草低温冻存原生质体融合方法融合烟草叶肉原生质体时，可以获得更稳定的融合结果。
结合烟草叶肉原生质体融合试验结果，本研究认为，烟草叶肉原生质体融合技术可行，能够利用多种方法融合烟草叶肉原生质体，以提高烟草的质量。
但同时还需要进一步的研究，用以深入了解烟草叶肉原生质体融合过程，以及融合后影响烟草植株形态和生理特性的机理。
综上所述，经过本研究，我们得出结论，烟草种间叶肉原生质体融合技术可以有效的融合烟草叶肉原生质体，为烟草育种提供了有效手段，但仍需要进一步研究以拓展其应用范围。
烟草叶肉原生质体融合技术研究具有重要意义，它可以帮助改良烟草质量，提高烟草的商业价值，为烟草育种提供有效的手段。
原生质体融合技术简介
作者 Xu
Jin
Khattab
酵母
对铬有较高抗性和除铬性 能较高的两种酵母进行融 合
处理低浓度含铬废水时， 卢显妍 去除率和还原率可达100%， 处理高浓度含铬废水 (200mg/L) 时 ， 还 原 率 达 50%
黑 曲 霉 (Aspergillus niger) 与 阿 特 拉 津 降 解 菌 青 霉(Penicillium sp)
(T.atroviride)
进行融合
豌 豆 根 瘤 菌 (Rhrhizbium
leguminosorum) 和 大 豆 根 瘤
菌
(Sinorhizobium
动物病理组织中发现多核细胞 天花病脓胞周围发现多核细胞 水痘侵害过的皮肤中发现多核细胞 麻疹病人扁桃腺中发现多核细胞 组织培养中发现麻疹病毒能诱导细胞用和成多核体 用副流感病毒诱发细胞融合 探索用硝酸钠诱导植物原生质体融合 用NaNO3进行了烟草种间原生质体融合 以白地霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 发现PEG是一种良好的聚合剂用于原生质体融合 以曲霉 青霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成 巨大芽孢杆菌内株间原生质体融合成功 链霉菌原生质融合并获融合重组子 用PEG+高pH-Ca2+研究原生质体融合 用高pH-Ca2++9℅DMSO与少量PEG获得较高的融合率 原生质体PEG融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株 一种新的体内分子育种方法——全基因组改组技术
内容
• 原生质体融合技术及应用发展介绍 • 原生质体融合的具体操作方法
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中国科学院青岛生物能源与过程研究所
原生质体培养及融合
主要方法： 漂浮法、界面法和沉降法等。
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A. 漂浮法：使用的飘浮剂有蔗糖、Percoll（珀可，是由聚乙烯
吡咯烷酮包被的SIO2颗粒的无菌胶体悬液）、Ficoll（菲可，水溶 性聚蔗糖）。
原理：采用比原生质体比重高的渗透溶液，使原生质体漂浮在 溶液表面，具体方法为：
子叶/叶片 下胚轴
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五、原生质体培养
培养密度很重要（原因）：一般以104-105个/ml为宜。 常用的培养方法：液体浅层培养、固体平板培养、 固－液双层培养
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1) 原生质体的培养方法
液体浅层培养
将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进 行培养。
优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养 基和转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现 象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个 细胞的发育情况。
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4、用于细胞器的分离与转移
由于原生质体没有细胞壁的障碍，可以进行亚细胞水平的操作 研究。如叶绿体、线粒体、细胞核、染色体等的摄取。在摄取细胞 器后进行培养，获得再生植株，根据再生植株的表现，即可进行遗 传分析，研究某种细胞器的功能或其所控制的性状。
也可以通过细胞器的转移，使物种获得相应的性状。
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胞质体( cytoplast ) ：不含细胞核，只有细胞质。 微小原生质体(microprotoplast)：只有1条或几条染色体的情况。
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细胞膜
细胞壁
原生质体
植物细胞
细胞核
染色体
微小原生质体 小原生质体 （核质体） 胞质体
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原生质体融合：也称为细胞融合或体细胞杂交。是指将植物的不同 种、属甚至科间的原生质体，通过人工方法诱导融合，然后进行离 体培养，使其再生成为杂种植株的技术。
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（3）50TAE电极缓冲液：称取24.2gTris溶解于适量蒸馏 水中，加入5.7ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)溶 液，定容到100ml。
（4）溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris.HCl （pH8.0），10 mmml 混合原 生质体 悬浮液
加入0.2ml 高钙高pH PEG融合液
静置 10min
重新悬浮 在0.5ml W5，静置 >10min
800rpm离 心3min， 弃上清夜
5min内缓慢 加入5ml W5 稀释液，轻 轻吸打混匀
静置 >30min
（5）融合原生质体的观察
吸1滴融合的原生质体悬浮液于血球计数 板上，在显微镜下融合的原生质体，统计融 合率。 融合原生质体的特征： A：异源融合；B：同源融合 融合率=融合的原生质体数/观察的原生质体数
准备下次实验的试剂（各100ml）：
（1）2×CTAB提取缓冲液：100mM Tris-HCl（pH8.0）， 2％（w/v）CTAB，1.4M NaCl，40mM -巯基乙醇， 20mM EDTA
CPW培养基+0.4mol/L甘露醇+2%纤维素酶 +0.5%离析酶
2、BY2愈伤组织和叶肉原生质体分离
2～3周龄愈 伤组织和叶 片各约1g和 0.5g，叶片 剪成细条
加入到酶 液中、用 镊子分散 愈伤组织
黑暗、 25℃
酶解5~6小时， 间歇轻轻摇 动。
3、过滤和离心洗涤原生质体
过 滤
800rpm离 心3min
弃上 清液
弃上清 液,重新 悬浮在
0.5ml CPW溶 液中
800rpm离 心3min
加入3ml CPW 培养基，用滴 管重新悬浮原 生质体
4、原生质体融合
（1）调整密度：用血球板计数后，将原生质体 的密度调整为106个原生质体/ml。 （2）配置PEG融合液（无菌下） PEG溶液：甘氨酸缓冲液：DMSO=8：1：1 （3）将愈伤组织原生质体和叶肉原生质体等体 积混合。
（5）溶液III： 60 ml 5mol/L乙酸钾, 11.5 ml 11.5％冰乙酸 , 28.5 ml无菌水
（6）分别配制0.4 mol/L NaOH和2％SDS溶液（各50ml）
实验十七
（2）烟草原生质体融合
一、原理
PEG带微弱极性的负电荷，能与水、蛋白质和碳 水化合物等具有正电荷基团的分子形成氢键。在邻近 原生质体表面之间起着分子桥的作用，加上PEG渗透 吸水的作用，使原生质体相互接触在一起。
在洗涤过程中，直接或间接与质膜结合的PEG分 子从原生质体表面洗脱，并随着pH的降低，导致膜电 荷的不平衡和发生重新分布；在原生质体 吸水过程中， 发生原生质体融合。
二、实验目的
学习植物原生质体融合的方法，为进行体细 胞杂交，培育体细胞杂种和胞质杂种打下基础。
三、实验材料和用具
1、材料：烟草BY2愈伤组织，烟草组培苗 2、用具：过滤器，注射筒，不锈钢网筛 （=54m），漏斗，三角瓶，滴管，10ml刻度离 心管，血球记数板。
四、实验步骤
1、配制酶液
各组（2人）配制下列酶液各10ml， 4000rpm离心6min后过滤灭菌于无菌三角瓶中。