实验三 荧光显微镜化学测定和细胞活性测定
细胞活力检测方法
细胞活力检测方法
1. 代谢活性检测法：测定细胞内代谢产物的含量或分泌物的释放量，如MTT法、SRB法、LDH脱氢酶活性测定法等。
2. 流式细胞术：利用染色或荧光标记的抗体与特定的细胞表面分子结合，通过流式细胞术检测细胞状态。
3. 荧光显微镜：利用荧光探针或染色剂染色，通过显微镜观察细胞内部结构、代谢活性等。
4. 内源性酶活性测定法：测定细胞内特定酶的活性，如蛋白酶、酸性磷酸酶等。
5. 表型分析：通过观察细胞外形、大小、颜色等特征，评估细胞的生长状态。
6. 细胞周期分析：通过检测细胞的DNA含量，确定细胞的周期阶段。
7. 活细胞成像技术：如实时荧光成像技术，能够非侵入性地记录细胞活力变化的动态过程。
总之，细胞活力检测方法有多种，可以根据具体需要选择合适的方法。
细胞活性的检测方法比较
细胞活性的检测方法比较简介：细胞活性是进行细胞生物学实验的一项重要指标，是评价细胞培养、细胞毒性及生理研究的基础。
一些基于细胞的下游分析实验，需要前期有好的细胞，才能保证下游的实验结果的可信度以及实验的可重复性，因此，细胞活性的实验具有广泛的应用。
目前关于细胞活性的检测方法多种多样，如基于台盼蓝染色的细胞计数，以及在此基础上的图像分析型的计数设备，或者是基于荧光染料标记的流式细胞术的分析等。
本文将一种新的检测方法与传统的检测方法进行比较，考察不同方法之间数据的差异性与方法学本身的操作性和成本进行比较。
细胞活性的定义具有多样性，通过对关键的细胞生理指标进行标记来进行检测，如细胞代谢的活性（酯酶的功能，MTT法）、凋亡标记物（Annexin V）、细胞氧化还原电位、膜电位、增值率（DNA含量）、线粒体功能和膜的完整性等。
虽然有如此多的指标参数，但是基于对细胞膜的完整性和相关的染料排斥发检测，已经被广泛的认为是作为细胞活性检测的标准。
应用最广泛的细胞膜完整性的检测方法是台盼蓝染色法，该法最早是基于显微镜下观测并且手工计数，过程费事费力，并且计数的系统误差较大。
为了排除人工计数的误差，增加计数过程的准确性，出现了基于仪器放大、拍照计数的方法。
这样提高了计数过程的自动化程度，但是依旧无法摆脱由于计数时焦平面的选择、颗粒识别的准确性问题，并且容易高估细胞活性。
为了解决这些问题，一些荧光染料被发明进行使用。
该法能够较台盼蓝染色提高100倍或者更高的检测准确性与灵敏度。
这类型的荧光染料中，碘化丙啶（Propidium Iodidi，PI）是应用最广泛的一种标准染料。
与其他基于荧光染料标记的实验一样，该法的缺点就是需要使用荧光显微镜或者是流式细胞仪。
前者要求配置一套荧光显微镜，相对应的激发光源以及滤光片，并且操作过程依旧是手工操作，人工计算实验结果，过程耗时还无法避免人为的主观因素。
而流式细胞仪能够准确的计数，并且进行统计学分析，但是设备昂贵，需要有经验的实验人员进行专门操作，以及需要一定的设备维护等问题。
检测细胞凋亡、细胞活性测定
检测细胞凋亡、细胞活性测定一、概述细胞凋亡（apoptosis,Apo）是细胞增殖的反面，探讨的是细胞死亡的方式与机制。
凋亡一词来源于希腊语。
原指花瓣、叶片的脱落。
自1972年Kerr首次提出细胞凋亡的概念以来，随着细胞生物学、免疫学和肿瘤学的研究发展，最近几年人们对细胞凋亡的重大理论意义和实际意义有了更深的理解。
细胞凋亡是指在一定的生理和病理情况下，机体为维护内环境的稳定，通过基因调控而使细胞自动消亡的过程。
不同类型的细胞，在发生凋亡时的动力学过程也不一致，存在着一定的形态学和生物化学的差异，但若干基本变化是大同小异的。
其特征为：整个胞体呈浓缩状，有特异性胞浆大泡，胞质、核质深染，核碎裂后被细胞膜包裹而形成凋亡小体（apoptosis body）。
它有别于细胞死亡（necrosis,Nec）。
在琼脂糖凝胶电泳上显示出特殊的DNA梯状图谱。
它的出现主要是由于一种钙-镁依赖性核酸内切酶激活后，裂解染色质核小体（nucleosome）之间的连接DNA，将核小体切割成180bp～200bp或其倍数的片段所致。
Apo是不可逆的过程，散在分布于组织中，形成的凋亡小体，除核裂解外，外有膜包绕，内有完整的细胞器，凋亡小体在组织中很快被邻近组织细胞吞噬，并在溶酶体中被降解。
因此，Apo不引起周围组织炎症及损伤。
Apo是机体自己启动，由细胞本身主动控制，由基因指导的细胞自我消亡过程。
因此，又称程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）。
光镜下，Apo的典型形态学特征是核染色质广泛凝聚，细胞体积缩小，胞质浓缩，有凋亡小体存在，细胞表面特化结构如微绒毛等丢失及细胞表面明显的迂曲。
体内细胞凋亡过程发展非常迅速，细胞常在数小时内完成Apo并降解，凋亡细胞仅出现数分钟就消失，故不适宜应用形态学方法（普通光学显微镜检测法、荧光显微镜检测法、凋亡小体的电镜观察及凋亡指数和细胞活力的定量测定）来检测。
在生物化学方面，利用电泳技术证明核体断片的“DNA梯状图谱”作为检测群体细胞发生凋亡的一个指标。
细胞活性测定
细胞活性测定方法细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。
核酸染料有多种，如 EB 带有单个自由正电荷，能通过完整细胞膜。
而PI，TO—PRO—1， TO-PRO-3等等带一个有四铵基团和两个或两个以上正电荷的染料是不能通过完整细胞膜进入细胞内的。
因而吸收了这些多电荷染料的细胞被认为是非活性的。
另外，一些酸性染料，如上面提到的台盼兰，曙红等都是膜非通透性。
代谢活性是另一重要指标，它通过细胞内的酶的活性来判定。
使用细胞某种酶的底物，它能通过（或是不能通过）完整细胞膜，在细胞内被酶切而产生荧光性，膜不通透性产物，能在细胞膜完好的细胞内存留，在细胞膜不完整的细胞内散失很快。
通过检测荧光强度就可知细胞代谢活性。
FDA（fluorescein diacetate）和 CTC （ 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride ）是常用的两种底物。
前者虽然透过细胞膜的速度较慢，但它的产物基本不往外通透。
后者经细胞内脱氢酶催化而具有荧光性，能提供细胞呼吸代谢系统活性和细胞膜完整性信息。
正常细胞的细胞膜两侧维持着一个胞内为负的膜电位为梯度，带正电的亲脂性染料，如Cyanines 类能因电梯度而通过细胞的脂双层膜聚积在活细胞内，带负电的亲脂性染料如 oxonols 会被排除在外。
不再维持着膜电位梯度的细胞里，则会吸收更多 Oxonols 类染料。
用流式细胞仪测量的方法优点是，灵敏，荧光强度精确定量，快速高通量的检测逐个细胞，可同时检测细胞的多个活性指标，提高可信度，结果具有统计意义。
缺点是，实验较 MTT 等复杂，费用较高。
常用的细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H 放射性同位素掺入法、MTT 法等。
其中 MTT 法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。
但 MTT 法形成的 Formazan 为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formaza n,故有时重复性略差。
细胞活力检测方法
细胞活力检测方法细胞活力是指细胞内外环境稳定，细胞结构完整，代谢活跃，功能正常的状态。
细胞活力的高低直接影响着生物体的生长、发育、免疫功能等多个方面。
因此，准确、快速地检测细胞活力对于生物学研究和临床诊断具有重要意义。
下面将介绍几种常见的细胞活力检测方法。
一、MTT法。
MTT法是一种常用的细胞活力检测方法。
其原理是将MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物）加入培养基中，MTT会被细胞内的还原酶还原为可溶性的紫色产物，然后用溶剂将产物溶解，最后用酶标仪测定其吸光值。
吸光值越高，代表细胞内还原酶活性越高，细胞活力越强。
二、CCK-8法。
CCK-8法是一种新型的细胞活力检测方法，其原理是将CCK-8（Cell Counting Kit-8）溶液加入培养基中，CCK-8会被细胞内的还原酶还原为橙黄色的产物。
然后用酶标仪测定其吸光值，吸光值越高，代表细胞内还原酶活性越高，细胞活力越强。
相比MTT法，CCK-8法更为灵敏和稳定。
三、荧光染料法。
荧光染料法是一种常用的细胞活力检测方法，其原理是利用荧光染料（如FDA、PI等）染色活细胞和死细胞，然后观察染色情况来判断细胞的活力。
活细胞呈绿色荧光，而死细胞呈红色荧光。
通过计数活细胞和死细胞的比例，可以间接反映细胞的活力情况。
四、细胞代谢物测定法。
细胞代谢物测定法是一种直接反映细胞活力的方法。
通过测定细胞产生的代谢产物（如乳酸、ATP等）的含量，可以客观地评价细胞的活力情况。
这种方法不仅可以用于细胞培养液的检测，也可以用于组织样本的检测。
综上所述，细胞活力的检测方法有多种多样，每种方法都有其独特的优势和适用范围。
在实际应用中，我们可以根据具体情况选择合适的方法来检测细胞活力，以便更好地开展生物学研究和临床诊断工作。
希望本文介绍的内容对您有所帮助。
细胞生物学实验材料
实验一荧光显微镜的原理和使用实验二叶绿体的分离与荧光观察实验三线粒体的活体染色与观察实验四细胞膜的通透性实验五 DNA的细胞化学——Feulgen反应实验六植物染色体标本的制备和观察实验七细胞计数实验八植物细胞骨架的光学显微镜观察实验九植物原生质体的分离和活性鉴定实验十环境因素诱变染色体改组的观察实验一荧光显微镜的原理和使用一、实验目的了解荧光显微镜的构造及其维护方法；掌握荧光显微镜的使用方法和使用中的注意事项。
二、实验原理荧光显微镜是选择由高压汞灯或类似光源发出一定波长的激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，观察细胞某种特异成分的分布状态的显微镜。
与普通光学显微镜一样，荧光显微镜也有物镜、目镜、调焦装置、光源、聚光器、载物台、镜身等组成部分。
所不同的是，荧光显微镜增加了激发光源和滤片系统，它投射到样品上的是特定波长的激发光而不是普通的可见光。
在激发光的作用下，样品中的荧光物质产生图1荧光显微镜发射光（即荧光）。
因此，荧光显微镜观察到的是样品中能产生荧光的部分所呈现的荧光映象，普通光学显微镜则是整个样品的可见光透射和折射影像。
某些物质在—定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荧光。
若停止供能荧光现象立即停止。
有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），如叶绿素的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。
有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。
利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。
因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。
三、实验用品荧光显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、解剖刀、0.01%吖啶橙染色液（acridine orange）、蒸馏水、水葫芦叶片四、实验内容与方法（一）荧光显微镜的构造1、基本装置荧光显微镜的基本装置是由普通光学显微镜加上一些附件（如荧光光源、激发滤片、二向色镜和阻断滤片等）的基础上组成的。
实验三 荧光细胞化学测定及细胞活力的测定
一.实验目的
1.学习荧光显微镜的使用 2.了解荧光显微镜的技术原理和 方法 3学习并了解荧光技术在细胞化学 及细胞活力测定方面的应用
二.实验原理
是利用短波光照射被射物质， 以激发其发射荧光而在荧光显 微镜下可以监视的方法。 而荧光是指某些物质经波长 较短光线照射后，分子被激活 吸收能量后呈激发态，而较大 一部分则以波长较长的光能形 式辐射出来，这种可见光为荧 光。 荧光显微镜是以紫外线或蓝 紫光照射某些物质，可激发其 产生荧光的原理设计的。
over。 It's over。 谢谢。 谢谢。
㈡用品：
荧光显微镜，载玻片，镊子， 烧杯，盖玻片，牙签等
㈢试剂：0.01%吖啶橙生理盐水溶液
0.01%异硫氰酯荧光素生理盐水溶液 0.01%罗丹明生理盐水溶液 荧光增白剂溶液 二丙酸酯荧光素溶液
四、实验方法
㈠ 利用荧光增白剂观察植物细胞壁 ㈡ DNA分布观察 ㈢ 蛋白质分布观察 ㈣ 线粒体观察 ㈤ 细胞二丙酸酯荧光素分解酶的活性 及细胞活力的测定 ㈥ 吖啶橙鉴定细胞死活
⑶相差显微镜
相差显微镜是以光的干涉现象 为基础设计的。它用装有环状 光栏的聚光器造成的空心光线 柱，使直射光和衍射光发生干 涉，从而把我们肉眼不能看见 的相位差变为可见的振幅差， 同时相位板上装有吸收膜，吸 收部分直射光以增加反差 相差显微镜一般用于观察活的 细胞的细微结构
三、实验用品
㈠材料：
洋葱，新鲜紫鸭跖草花粉或蚕 豆原生质体悬液，人口腔上皮细胞
荧光可分为自发荧光和次生 荧光。 自发荧光是指有些生物体 受到短ห้องสมุดไป่ตู้光照后直接发出的荧 光；
如：经紫外光照射后，叶绿 体发粗的红色荧光；木质素发出的 黄色荧光等。
细胞活性检测方法
细胞活性检测方法
细胞活性检测是观察和分析细胞在不同环境条件下生长和活动状态的常用方法，是细
胞生物学研究的重要工具。
下文重点讨论细胞活性检测方法。
细胞活性检测主要分为细胞增殖检测和细胞毒性检测两类。
细胞增殖检测是用于检测细胞增殖水平的一种常见方法，其方法可以分为物质检测法
和荧光检测法。
其中，物质检测包括以下几种方法：1. 细胞计数法：使用酶标仪或显微
镜统计细胞的数量和亚群分布；2.发光检测法：用苯乙烯（MTT）或朴素假单胞菌（XTT）
等试剂测定细胞代谢活力；3.生物量测定：用铜铋还原定氮法或硝酸还原法测定细胞原材
料和产物含量。
荧光检测包括以下几种：活性染色法：如酶原发光染色（ELISA）；假单
胞菌（xTT）荧光定量法等。
细胞毒性检测是研究细胞在有毒物质存在下的活性情况。
常见的细胞毒性检测方式有：
1.细胞实验系统和荧光染色：检测细胞内毒性物质产生变化前后细胞形态和蛋白组成等；
2.细胞能量测定法：检测细胞受有毒物质影响后ATP含量及其他代谢产物及表观遗传学变化；
3.细胞凋亡检测：通过检测细胞凋亡标志物TUNEL法以及流式细胞仪中染色体减数等
来检测细胞凋亡的发生。
细胞活性检测是生物学研究的重要工具，它不仅可以帮助我们更好地理解细胞在不同
环境条件下的活动，而且还可以用于预测细胞对外界刺激和毒素等的反应，进而帮助提高
细胞培养和药物研究的准确性和效率。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
思考
一．实验目的 二．实验原理 三．实验用品 四．实验方法
Back
实验目的
• 学习荧光显微镜的使用 • 了解荧光显微技术原理和方法 • 荧光技术在细胞化学学习方面的应用
• 掌握细胞活力测定的方法 • 学习辨别细胞的死活
Back
实验六
实验原理
• 荧光显微镜是用于检测显微镜尺度下 荧光信号的显微镜。活性物质受到光 照或其他形式的能量后释放出其中一 部分以光为形式的能量的现象被称为 荧光现象这样的活性物质称为荧光物 质 • 荧光可以分为自发荧光和次生荧光。 有些生物体受到短波光照射时直接发 出荧光。
Back
物镜
• 由于激发标本和收集荧光都是由同一物镜 来实现的，所以物镜是能透过紫外光的特 制物镜，荧光效率与所用的物镜的数值孔 径的4次方成正比，所以用数值孔径较大的 浸液物镜的效果更好。
Back
目镜
• 荧光亮度与目镜放大倍数的平方成反比。
Back
荧光技术是生命科学研究的重要手段。 1. 荧光显微镜对细胞凋亡的形态学观察 2. 流式细胞术检验细胞特性 3. 荧光技术在微丝骨架研究中的应用 4. 荧光原位杂交的应用 5. 绿色荧光蛋白在动物细胞分子生物学中的 应用 6. 免疫荧光抗体的制备
可与核酸亲和的荧光活体染料。荧光显微镜 下核呈绿色，细胞质呈黄色。 与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发 出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光， 与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料 具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA 染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透 过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧 光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大 小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上 致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而 坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。
Back
荧光显微镜
光源
高压汞灯或是氙灯是常用的荧光激发光 源。汞灯在366nm、405nm、436nm、 546nm、577nm处有很强的发射线，氙灯 也在紫外区可见区有较强的发射线。
Back
激发滤片
• 放置于光源和物镜之间，其作用是选择适 宜于激发欲观察荧光物质的波长范围。
Back
双色反射镜
（二）吖啶橙鉴定细胞死活
用牙签取少许口腔粘膜上皮细胞，涂在 载玻片上，滴加1—2滴0.01%吖啶橙生理盐 水溶液，加盖玻片，待染色5分钟后于萤光 显微镜下观察，注意细胞核所呈萤光颜色。
Back
注意事项
1、把握染色时间，使实验观察 效果更好 2、实验过程随时记录，并分别 描述DNA，蛋白质及线粒体在 细胞内的分布与颜色
Back
思考
• 荧光显微技术应用的方面 • 不同荧光所对应的不同组织细胞的原因 • 如果用Hochest.33342 和罗丹明123同时标 记一个细胞将出现什么图像。
吖啶橙
Back
实验用品
（一）材料： 新鲜紫鸭跖草花粉或蚕豆原生质体悬液 （二）用品：
荧光显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，烧杯，牙签
（三）试剂：பைடு நூலகம்1、二丙酸酯萤光溶液 2、0.01%吖啶橙的生理盐水溶液
Back
实验方法
（一）细胞二丙酸酯荧光素分解酶 的活性及细 胞活力的测定步骤：
1、取少许新鲜紫鸭趾草花粉或蚕豆表皮放在玻 片上，加二丙酸酯荧光素溶液一滴。5—10分 钟后，在荧光显微镜下观察。 2、若是悬浮细胞，可将上诉染色液数滴直接加 入细胞培养液5分钟后，可离心收集。再用无 细胞和无染料的培养液洗两次，即可观察。
Back
一．实验目的 二．实验原理 三．实验用品 四．实验方法
注意事项
1、在荧光显微镜下观察新鲜的紫 鸭趾草花粉和蚕豆表皮切片时， 时间不宜太长，以免细胞逐渐死 亡，影响效果。 2、仔细观察，说明你所检查细胞 的活力状况。
Back
实验原理
• 利用荧光技术观察实验细胞的活力。将 二丙酸酯等荧光素滴加到所观测的细胞 进行荧光反应。由于不同生理活性的细 胞发射的荧光或次生荧光的能力有很大 差别，不同组分对荧光染料反应产生的 效果也不同，利用这点特性，通过荧光 显微镜可以测定细胞的生理活性。
实验用品
① 材料：洋葱 ② 用品：荧光显微镜，载玻片，镊子，烧杯。 ③ 试剂： 0.01%吖啶橙生理盐水 0.02%异硫氰酯荧光素生理盐水 0.01%罗丹明生理盐水 荧光增白剂溶液，将荧光增白剂溶液溶于 0.4M的山梨醇溶液，使溶液达到0.1%。
Back
实验方法
（一）利用荧光增白剂观察植物细胞壁 具体步骤： 1、取洋葱表皮细胞置于载玻片，以荧光增白剂染 色5分钟，加盖玻片，荧光显微镜下观察其细 胞壁。 2、取以酶液游离出来的原生质体1滴于载玻片上 ，加荧光增白剂一滴，染色5分钟，加盖玻片 ，在荧光显微镜下观察原生质体脱壁是否完全 ，蓝紫光激发观察。
• 双色反射镜放置方向与激发光的方向是45 。具有一个特征波长值m，波长>m光波透射。 波长<m光波反射。它是分开激发光（短波） 和发射荧光（长波）的重要组件。
。
Back
阻断滤片
• 采用长波通滤片，即能使长于某波长的通 过，短于某波长的光不能通过，阻断滤片 的作用是近一步使荧光与激发光分离，以 获得更纯的荧光，内阻滤片已固定在内部， 外阻断滤片金额根据需要装入或卸下。
（二）DNA分布的观察具体步骤： 取洋葱内表皮细胞置于载玻片，以0.01%吖 啶橙染色5分钟，生理盐水冲洗一次，加盖玻片 ，荧光显微镜下蓝光激发观察。 （三）蛋白质分布的观察具体步骤： 取洋葱内表皮细胞置于载玻片，以0.02%异 硫氰酯萤光素染色5—10分钟，生理盐水冲洗一 次，加盖玻片，荧光显微镜下蓝光激发观察。 （四）线粒体观察具体步骤： 取洋葱内表皮细胞置于载玻片，以0.01%罗 丹明染色5分钟生理盐水冲洗一次，加盖玻片， 荧光显微镜下绿光激发观察。
Back
罗丹明
中文名称： 罗丹明 英文名称： rhodamine 定义： 可用作生物荧光染色剂的一种由三苯甲烷 衍生的染料。如与鬼笔环肽结合用于显示肌动蛋 白微丝。
Back
异硫氰酯荧光素
标记蛋白质：在碱性条件下FITC的 —NCS能与蛋白质分子中的游离的氨基经 碳酯化形成硫碳键两种分子结合为荧光标 记蛋白。利用荧光标记的蛋白质与标本中 的相应的抗原反应在荧光显微镜下可反映 抗原在组织中的分布和定位。