玉米中SOD的分离提取及性质研究
SOD提取纯化
动物血中超氧化物歧化酶的提取与纯化动物血中超氧化物歧化酶的提取[原理]l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。
自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。
迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。
藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。
为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。
目前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯SOD。
从动物血液材料中制备Cu Zn-SOD纯化工艺分为三个主要步骤：（1）原材料的预处理；（2）粗酶液的制备；（3）离子交换柱层析精制。
国内多采用Mccord和Fridovich法，其主要工艺过程为：第一步，乙醇-氯仿除去血红蛋白；第二步，有机溶剂和硫酸铵分级沉淀；第三步，离子交换柱层析精制。
[试剂和器材]1、试剂（1）3.8%（质量分数）柠檬酸三钠（2）0.9%（质量分数）氯化钠（3）95%（体积分数）乙醇（4）氯仿（5）丙酮（6）pH7.6、2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液（7）DEAE-Sephadex A-502、器材（1）猪血（2）恒温水浴（3）离心机（4）布氏漏斗、抽滤瓶（5）烧杯、量筒、搅棒（6）透析袋[方法和步骤]1、从猪血中提取SOD（1）分离血球取新鲜猪血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心20min，收集红血球。
（2）除血红蛋白红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入1～1.1倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后4000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。
实验三超氧化物歧化酶(SOD)的提取及活性测定
3.3 结果计算 总酶活力=酶液总体积X稀释倍数/抑制 50%的酶液量X样品重
五、本实验教学内容的重点和难点
重点：粗提液的获得玉米SOD的提取 难点：提取条件的控制
六、本实验教学内的深化和拓展
通过本实验的学习，使学生明确实验的意义，联 系实际，使学生了解本实验的应用。明确植物 SOD与动物SOD的区别，了解植物SOD的优势。
七、思考题，完成实验报告
1 什么是分段盐析，为什么要分段盐析？ 2 SOD有哪些用途？
4、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积 的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心 15min，得SOD沉淀。将SOD沉淀溶于 0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，于5560℃热处理15min，得到SOD酶液。
3.2 SOD活性测定 试剂（mL） 空白对照管 样品管 碳酸缓冲液 5.0 5.0 EDTA溶液 0.5 0.5 蒸馏水 0.5 — 样品液 — 0.5 混合均匀，在30℃水浴中预热5min，测定 OD480
四、操作步骤
4.1 SOD粗提液的制备
1、组织细胞破碎：称取5g大蒜蒜瓣或玉米 种子，置于研钵中研磨。 2、SOD的提取：破碎后的组织中加入2-3 倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）， 继续研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲液 中，然后在5000rpm下离心15min，取上清 液。 3、除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心 15min，得到的上清液为粗酶液。
三、材料与试剂
1. 材料
l/L磷酸缓冲液（pH7.8）,500mL 2、氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:5 3、丙酮：用前需预冷至4-10℃ 4、0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.2） 5、0.1mol/LEDTA溶液
SOD酶活力测定实验
摘要：通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。
跟踪提纯过程活性的分布，并评价提取过程各步骤的效率。
实验结果证实随着不断的分离提纯，总活力以及总蛋白不断减小，比活力不断上升，最终得到的结果为总纯化倍数为0.68，活性得率为5.24%。
一、前言：超氧化物歧化酶简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶。
分布很广，几乎从哺乳动物到细菌，以及植物中均存在。
在微生物中主存于需氧菌。
SOD是催化超氧阴离子（O2-）歧化反应的酶类，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2.H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O 和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。
它的存在与生物体内的解毒作用有关，也发现与机体的衰老、肿瘤及免疫性疾病等有关。
自1968 年发现SOD 后，立刻引起科学界的高度重视，近40 年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD 也有了产品.国外从牛红细胞中制得的超氧化物歧化酶，其商品名为Orgotein.不少人研究Orgotein的药理性质，证明它无毒，无抗原性，能抗发炎、抗超氧离子、抗病毒感染。
二十世纪80 年代后期，我国关于SOD 的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。
SOD作为治因而受到医药界的关注。
目前中国国内已进入临床试验阶段。
本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。
二、实验材料与方法：<一>材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用.<二>试剂:葡聚糖（sephadexG-100）, NaCl（AP）, 磷酸氢二钠（AP）, 磷酸二氢钠（AP）, 三羟甲基氨基甲烷（Tris）, 盐酸（浓盐酸），硫酸铵（AP）, PEG6000 ，考马斯亮蓝G250 , 磷酸，乙醇（95%），牛血清蛋白BSA , 连苯三酚(焦性没食子酸), EDTA(钠盐) , 超氧化物歧化酶（sigma公司）。
玉米超氧化物歧化酶(SOD)的提取及活性测定
- · O2 -· O 2 + + 2H + H 2O 2 + O 2 SOD 玉米超氧化物歧化酶（SOD ）的提取及活性测定一、目的1．通过对玉米超氧化物歧化酶（SOD ）的提取及活性测定，掌握硫酸铵盐析沉淀蛋白质和超滤浓缩的方法和原理。
2．掌握测定超氧化物歧化酶（SOD ）的活力和比活力的方法。
3．掌握分级盐析沉淀的方法和原理，以及透析的方法和原理。
二、原理超氧化物歧化酶（superoxide dismutase ，简称SOD ），它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为3种：Cu,Zn-SOD ，Mn-SOD ，Fe-SOD 。
SOD 催化如下反应：在生物体内，它是一种重要的自由基清除剂，能治疗人类多种病症，如炎症、脑外伤、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老等，对生物体有保护作用。
在玉米中，SOD 主要存在于胚芽中，当将萌发的玉米籽粒打浆破碎后，以中性盐沉降其蛋白质部分，SOD 就存在于沉淀中，但其中有许多杂蛋白，因此在盐析时先用40%（NH 4）2SO 4去除杂蛋白部分，再用90%（NH 4）2SO 4饱和上清液，经过一定时间后，再将盐析液离心，取其沉淀进行透析，一定时间后，则其中的SOD 成分即被浓缩分离。
超滤也是一种蛋白质浓缩方法，其工作原理是运用液压迫使溶质透过膜，并按溶质分子量、形状、大小的差异，把大溶质分子阻留在膜的一侧，而小分子溶质则随溶剂透过膜到另一侧，使大小溶质分子得到分离。
利用此原理只要选择适当的超滤膜即可将玉米浆中SOD 与其它小分子杂蛋白、可溶性糖等分离，并去除水份，得到SOD 浓缩液。
SOD 活性的测定：采用NBT 光还原法。
其原理为核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O 2-，当加入NBT 后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），既而还原成二甲月替（呈兰色）。
该产物在560nm 下有最大吸收峰。
当加入SOD 时，可以使超氧自由基与H +结合生成H 2O 2+O 2，从而抑制了NBT 光还原的进行，使兰色二甲月替 生成速度减慢。
SOD的研究进展综述
超氧化物歧化酶的研究进展学生：杨青青生命科学院10级研究生摘要：超氧化物歧化酶是一种广泛存在于生物体内各个组织中的重要金属酶，是一种能够特异性清除机体代谢过程中产生的自由基的抗氧化酶，近年来成为化学、生物学、医学、日用化工、食品科学和畜牧兽医学等多个学科领域研究的热点。
深入研究SOD及其与机体内铜、锌、铁、锰等元素代谢的关系，不仅有着重要的理论意义，而且具有重要的实用价值。
本文将从其来源、种类和分布、结构和理化特性、作用机理及生理功能、SOD基因的克隆和表达、分离纯化、制备开发应用等方面进行综述，并探讨和分析了目前存在的问题及应用前景，旨在为超氧化物歧化酶的研究、开发、应用提供参考。
关键词：超氧化物歧化酶；基因克隆；蛋白表达；分离；纯化；应用Research Advances in Superoxide DismutaseStudent: Yang Qing-Qing10 graduate student, School of life science, Shanghai University Abstract:Superoxide dismutase is an importance metal enzyme of widely various tissues in vivo, which is an antioxidant enzymes can specifically remove free radicals produced during metabolism and has been an inquiring hot spots in many fields such as chemistry, biology, medicine, daily chemical industry, food science and animal husbandry and veterinary science and so on in recent years. It not only has an important theoretical significance but is of an important practical value to study the relationship between SOD and the elementary metabolism of cup rum (Cu), zine (Zn), ferrum (Fe) and manganese (Mn). This article will not only summarize from its source, type and distribution, structure and physicochemical properties, function mechanisms and physiology functions, SOD gene cloning and expression, purification development applications but also analyze and discuss the problems and prospects of the future aiming at providing reference for the research, development and application of SOD.Key words: Superoxide dismutase; Gene cloning; Protein expression; Isolation; Purification; Application前言氧的某些代谢产物及其衍生的含氧物质都是直接或间接由氧转化而成的。
植物中sod的分离提取及性质
SOD是生物体内重要的抗氧化酶，能够催化超氧阴离子自由基歧化为 氧气和过氧化氢，从而保护细胞免受过氧化应激损伤。
抗衰老作用
SOD能够清除自由基，减少细胞损伤，延缓生物体衰老过程。
抗炎症作用
研究表明，SOD具有抗炎作用，能够抑制炎症反应和减轻炎症症状。
抗癌作用
SOD通过抗氧化和抗炎作用，能够抑制肿瘤细胞的生长和扩散，对预 防和治疗癌症具有一定的作用。
SOD的物理性质
分子量
SOD的分子量通常在30-40 kDa之间，具体取决 于所使用的植物种类和分离方法。
结构特征
SOD的蛋白质结构由两个相同的亚基组成，每个 亚基包含一个金属离子结合位点和活性中心。
等电点
SOD的等电点通常在6-8之间，这取决于所含金属 离子的种类和蛋白质表面的电荷分布。
SOD的生物学活性
功能性食品添加剂
SOD作为一种天然的抗氧化剂，可以 添加到功能性食品中，提高食品的营 养价值和保健功能。
在医疗保健上的应用
抗氧化保健
SOD具有强大的抗氧化作用，可以清除体内的自由基，对预防和延缓衰老于一些氧化应激引起的疾病，如糖尿病、心血管疾病等具有一定的辅 助治疗效果。
03
植物中SOD的性质
SOD的化学性质
金属离子依赖性
SOD是一种金属蛋白酶，其活性 依赖于铜离子或锰离子。
活性中心
SOD的活性中心由一个或多个金属 离子和周围的氨基酸组成，负责催 化超氧阴离子自由基歧化反应。
酶动力学特性
SOD具有特定的酶动力学特性，如 米氏常数和催化常数等，这些参数 反映了酶与底物之间的相互作用。
植物中sod的分离提取及性质
汇报人： 2024-01-08
SOD的性质
SOD的性质超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase)是广泛存在于各种生物体内中, 人们发现靠氧呼吸的所有生物中都存在SOD，如微生物、植物和动物体[2]。
其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位其SOD的种类和含量也有很大差别。
SOD属于金属酶,根据所含金属不同,分为Cu-Zn SOD, Mn-SOD和Fe-SOD三种,三种酶都可催化O-2歧化为H2O2和O2,但其性质有所不同[3] 。
同时SOD是目前为止所发现的唯一的以O2-为底物的酶,能催化细胞内超氧化物阴离子(O2-)的歧化反应,使O2-转化为H2O2和O2[4]。
从植物中提取SOD已有不少报道,但从苹果中提取SOD尚未见报道，本实验以苹果为原料，探究SOD的提取工艺。
目前植物中提取SOD采用的方法主要包括磷酸缓冲液提取法、Tris-HCl和热变性法,磷酸缓冲液法用的较多，本实验也采用这种方法，但相鉴于一些学者的研究得出热变性法是提取工艺中一种较为廉价的方法,可以降低生产成本,并且简单易行。
热变性法不引入其他杂质,对提取工艺非常有利[5]。
由于SOD是一种热稳定性较好的酶,并且大部分杂蛋白在55℃时就可变性[6]。
因此本实验利用SOD和杂蛋白变性温度的差异来加强初步分离的效果。
粗取得到的SOD粗酶液必须进一步的纯化，离子交换柱层析方法是纯化蛋白质中比较常用的方法，它是依据化合物与离子交换剂的结合力的不同而进行分离纯化的。
离子交换柱层析的固定相是离子交换剂，也液体为流动相。
离子交换剂是一种不溶于水的惰性高分子聚合物基质，通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成。
酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。
植物中SOD的分离提取及性质
详细描述
首先，将植物中的SOD进行分离和纯化，然 后使用凝胶色谱法进行分子量测定。这种方 法利用分子大小不同的蛋白质在凝胶色谱柱 中的扩散速度不同，从而分离出不同大小的 蛋白质分子。最后，通过与标准分子量的比
较，可以测定出植物中SOD的分子量。
植物中SOD的等电点测定
要中SOD的等电点 。
在环保领域的应用
空气净化
SOD具有清除活性氧和自由基的功能，可以用于空气净化。将SOD添加到空气净化器或空调系统中，可以有效地 去除空气中的有害物质，保护人体健康。
水质净化
SOD同样可以用于水质净化。将SOD添加到水处理系统中，可以有效地去除水中的有害物质，提高水质。同时， SOD的抗氧化作用还能够抑制水体中有机物和重金属的氧化反应，减少水体污染。
在农业领域的应用
植物育种
SOD在植物育种中具有重要的作用。它能够提高植物 的抗逆性，使植物在不良环境下仍能正常生长。通过 转基因技术将SOD基因导入植物中，可以培育出具有 更强抗逆性的新品种。
农药与肥料
SOD在农药和肥料中也有重要的应用价值。将SOD与 其他物质结合制成的新型农药和肥料，能够更有效地 提高植物的抗逆性和产量，同时减少对环境的污染。
植物中sod的分离提取及性质
汇报人：文小库
2023-11-13
CONTENTS
• 引言 • SOD概述 • 植物中SOD的分离提取方法 • 植物中SOD的性质研究 • 植物中SOD的应用研究 • 研究展望与挑战 • 参考文献
01
引言
研究背景和意义
植物中SOD（超氧化物歧化酶）的分离提取及性质研究具有重要的理论和实践意义。
要点二
详细描述
等电聚焦电泳法是一种根据蛋白质等电点进行分离的 方法。在电场的作用下，不同等电点的蛋白质会聚焦 在不同的pH值区域，从而可以根据聚焦位置确定蛋白 质的等电点。通过这种方法，可以测定出植物中SOD 的等电点。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
玉米中SOD的分离提取及性质研究学生姓名王旭学号 2013213827专业班级生物工程13-01班指导教师钱鑫华樊婷婷院系名称生物与食品工程学院组员王旭，崔洪源，戴琦泽，范立峰一，前言SOD广泛存在生物界，是防御氧毒害的关键酶。
SOD主要有CuZn-,Mn-,Fe-SOD 三种类型的同工酶，它们的共同的生物学作用是专一的清除氧化中产生的超氧阴离子自由基（对细胞组分及细胞器，尤其是生物膜有严重的损坏作用），具有抗衰老，抗辐射，抗癌等生理作用。
在医药中，SOD可用于治疗辐射病，自身免疫性疾病，炎症等；在食品中，可用于保健食品添加剂；在化妆品中，可防止皮肤衰老，抗炎，防晒等作用。
植物中大蒜的SOD含量丰富，所以，本实验研究大蒜中SOD的性质，并且确定SOD同工酶的类型。
根据SOD的性质，我们采用邻苯三酚自氧化法判断同工酶的最适温度，最适PH，以及双氧水对酶的活力抑制。
并采用改进的自氧化法测酶的活力.1，SOD性质超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)简称SOD，是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。
SOD金属蛋白酶，对pH、热和蛋白酶水解等反应比一般酶稳定。
它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为3种：铜锌超氧化物歧化酶(Cu·Zn—SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn—SOD)和铁超氧化物歧化酶(Fe—SOD)2、邻苯三酚自氧化法根据国际酶学委员会规定，酶的比活性（specific activity）用每mg蛋白质具有的酶活性单位（U∕mg蛋白）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：每mL样品中的蛋白质mg数（mg∕mL）;每ml样品中的酶活性单位数（U∕mL）。
酶的纯度越高酶的活性也就越高。
SOD酶活性测定方法很多，如邻苯三酚自氧化法、肾上腺素自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法等。
在一般情况下，SOD酶活性只能应用间接活性测定法，本实验采用邻苯三酚自氧化法测定。
利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。
反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。
加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm处测定溶液的吸光度。
酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。
邻苯三酚自氧化速率随其浓度的升高而增加3、不连续电泳不连续电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳。
由于浓缩胶的堆积作用，可使样品（即使是稀样品）在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度）的凝胶上进行分离。
由于不同孔径凝胶的分子筛作用，使不连续电泳的分辨率大大高于连续电泳。
虽然不连续电泳在缓冲系统的选择和制胶（特别是梯度胶）的操作方面比较繁杂，但它可以得到电泳分离最重要的指标--高分辨，因而是目前应用最广泛的技术。
二，实验试剂玉米，氯仿-乙醇混合液、维生素、冷丙酮、邻苯三酚、浓盐酸、蒸馏水、双氧水、TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺。
）、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、溴酚蓝、5.0mol/L PH7.8 磷酸钠、10 mmol/LHCl、Tris（三羟甲基氨基甲烷; 氨基丁三醇）、甘氨酸。
1． 2.45mol/LNBT溶液：称取200mgNBT溶于蒸馏水中并定容至100ml置棕色试剂瓶中，避光贮存。
2. 3.60mol/L PH7.8磷酸缓冲液（内含2.8mol/L TEMED和2.8 维生素）：在100ml 3.60mol/L PH7.8 磷酸钠缓冲液中加0.42mlTEMED及1.32mg维生素，置棕色瓶中贮存。
3．PH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris6.0g,甘氨酸28.8g，加水至1000ml,用是加水稀释10倍。
4. PH8.9 1.5mol/L Tris-HCl 缓冲液：称取18.2g三羟甲基氨基甲烷（Tris）加24ml 1mol/L盐酸，加水至100ml.5. PH6.8 0.5mol/L Tris-HCl 缓冲液:称取Tris6.0g,加48ml 1.0mol/L 盐酸溶液100ml 。
6. 以及不同浓度的磷酸缓冲液。
0.05mol/L，PH如下5.86.57.0 7.3 7.6 7.8 7.98.3三，实验仪器移液管、离心机5000r/min,量筒、烧杯、研钵、玻璃棒、微量移液器、试管、分光光度计、1cm比色皿、恒温水浴槽、电泳槽、电泳仪、培养皿、4*108日光灯、容量瓶、烧杯、冰箱等。
四，实验内容玉米粗酶液的提取1、提取：称15g左右的玉米粒至于研钵（事先冷藏）中，使细胞破碎，再加入5ml 0.05mol/l PH7.8的磷酸盐缓冲溶液（事先冷藏），继续淹没搅拌15min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后10000r/min,离心10min，弃去沉淀，得蒜的提取液。
2、取出杂蛋白：玉米粒提取物加入2倍体积的氯仿-无水乙醇混合溶剂，搅拌15min，10000r/min离心10min,取出杂蛋白，得粗酶液。
3、沉淀SOD：将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min,使SOD凝聚，10000r/min离心10min，得SOD沉淀溶于2ml PH7.8的磷酸盐缓冲溶液中。
SOD性质的研究表一邻苯三氛自氧化法测定SOD的酶活性：1、邻苯三氛自氧化速率的测定：取两支试管按表1加入25℃预热过的缓冲液，然后加入预热过的邻苯三氛（空白管用10mmol/l HCL代替邻苯三氛），迅速摇匀，立即倾入1cm比色皿中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化，得出每分钟的自氧化速率。
（可增减邻苯三氛自的加入量以控制光吸收值）表一2、SOD 样液活性的测定样品管取代自氧化管（表2）。
样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三氛。
其余步骤同邻苯三氛自氧化速率的测定。
表二酶活性的计算：酶活性=((自氧化速率-样液速率)/自氧化速率)*(100%)/(50%)*反应液总体积*样液稀释倍数/样液体积 根据上述SOD 酶活性的测定方法测定在不同PH 下、不同温度下、激活剂和抑制剂下求出酶活性。
做出酶活性和不同PH 曲线、酶活性与温度曲线、以及在抑制剂条件下酶活力的大小。
①不同PH 对酶活力的影响：首先按下表（表三）加入PH 分别为7.1的25℃预热过的缓冲液，注意加入预热过的邻苯三氛，迅速摇匀，立即倾入1cm 比色皿中，在325nm 波长处测定光吸收值，每 隔30s 读数一次，测定4min 内每分钟光吸收值的变化，记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。
改变PH 分别为7.7,8.2,8.6,9.0，记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。
表三试剂 空白管/ml自氧化管/mlPH 8.2 50mmol/l Tris-HCL 3 3 10mmol/l HCL 0.015 0.01 50mmol/l 邻苯三酚--0．005试剂 空白管/ml自氧化管/mlPH 8.2 50mmol/l Tris-HCL 3 3 10mmol/l HCL 0．015 -- SOD 样液 -- 0．01 50mmol/l 邻苯三酚--0．005试剂 空白管/ml自氧化管/ml 样品管/mlPH 7.1 50mmol/l Tris-HCL 3 3 3 10mmol/l HCL 0．015 0.01 -- SOD 样液 -- -- 0．01 50mmol/l 邻苯三酚--0．0050．005②不同温度对酶活力的影响:首先取试管按下表加入0℃的缓冲液，然后加入相同温度下的邻苯三氛，迅速摇匀，立即倾入1cm 比色皿中，在325nm 波长处测定光吸收值，每隔30s 读数一次，测定4min 内每分钟光吸收值的变化。
记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。
改变温度分别为25℃,50℃,75℃,100℃。
记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。
表四③抑制剂的影响：按下表25℃预热过的液体，最后加入预热过的邻苯三氛，迅速摇匀，立即倾入1cm 比色皿中，在325nm 波长处测定光吸收值，每隔30s 读数一次，测定4min 内每分钟光吸收值的变化，记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。
与不加抑制剂的相比较得出结论。
表五PAGE 定位染色法鉴定同工酶的类型按配方（表七）在模具中灌注分离胶后，小心的在分离胶的表面加一层水（或水饱和的异丙醇或正丁醇），封住胶面，以促使聚合并使凝胶表面垂直。
凝胶在30-40℃放置约40分钟-1小时后，可以看到一个界面，表示凝胶聚合。
吸水（或水饱和的异丙醇或正丁醇），用浓缩胶缓冲液贮液淋洗凝胶，然后灌注浓缩胶。
并插入与模具大小相同，与凝胶厚度相当的梳子。
为防止气泡陷入，梳子应倾斜插入。
然后让模具再静止放置在30-40℃，聚合约40分钟-1小时（注意在分离胶和浓缩胶聚合时，应用日光灯照射以促使凝胶凝聚） 2、加样：按下表（表八）加入试剂，充分振荡，使醇液与变性剂均匀混合。
（Mn-SOD 的活性受氯仿—— 乙醇的影响，Cu —Zn —SOD 和Fe-SOD 这两种同工酶均对H2O2酶感，Cu ——SOD 对KCN 酶感，Mn —SOD 不受CN 的影响） 3、表七试剂空白管/ml自氧化管/ml样品管/mlPH 8.2 50mmol/l Tris-HCL3 3 3 10mmol/l HCL 0．015 0.01 -- SOD 样液----0．0150mmol/l 邻苯三酚 -- 0．005 0．005试剂空白管/ml自氧化管/ml样品管/mlPH 8.2 50mmol/l Tris-HCL3 3 3 10mmol/l HCL 0．015 0.01 -- SOD 样液 -- -- 0．01 50mmol/l 邻苯三酚-- 0．005 0．005 30%H 2O 25滴5滴5滴待各管溶液配置好后，分别取10ul 加入凝胶的3个齿上。
3、电泳：SOD 同工酶的分离采用不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳。
连接电源，调节电流至15mA ，待样品由浓缩胶进入分离胶时，再将电流调至20-30mA ，当染料前言距离凝胶边缘1-2cm 时，关闭电源，电泳结束。
4、SOD 活性染色：取凝胶板，采用SOD 负染色方法，按以下次序浸泡于培养皿中染色：①在2.45×10– 3mol/l 氮蓝四唑(NBT)黑暗下浸泡20分钟；②在3.6×10-2mol/l PH7.8磷酸钠缓冲溶液（内含2.8×10-2mol/l 四甲基乙二胺(TEMED)、2·8×10-5mol/l 核黄素）中，在黑暗条件下浸泡15min ；③5×10-2mol/L pH7.8磷酸钠缓冲溶液。