鸭源新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及与不同分离株的反应性_杨少华
一种新城疫病毒伪型病毒的制备方法和用途[发明专利]
![一种新城疫病毒伪型病毒的制备方法和用途[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/6265a3d483c4bb4cf6ecd1b6.png)
专利名称：一种新城疫病毒伪型病毒的制备方法和用途专利类型：发明专利
发明人：刘恒贵,王斌,刘培欣
申请号：CN201310369421.7
申请日：20130822
公开号：CN103451159A
公开日：
20131218
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种新城疫病毒伪型病毒的制备方法以及伪型病毒的用途，制备方法包括（1）携带F、HN基因的重组质粒的构建；（2）整合有新城疫病毒囊膜蛋白的伪型病毒NDV-PP的制备。
其中，扩增F基因和HN基因的两对引物分别为F-sense与F-antisense、HN-sense与HN-antisense，引物序列分别为SEQ ID No.1与SEQ ID No.2、SEQ ID No.3与SEQ ID No.4。
本发明拟建立一种敏感、快速、适合大批样本检测的新城疫病毒中和抗体检测方法，以期替代传统的中和抗体检测手段，为疫病的快速诊断、疫苗效果评价等提供有益工具。
申请人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
地址：150001 黑龙江省哈尔滨市南岗区马端街427号
国籍：CN
代理机构：北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司
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不同禽源和不同毒力新城疫病毒对鸭的感染性
摘
要 ：为探 讨 不 同禽 源和 不 同毒 力 的新 城 疫病 毒 （ Ｄ ） Ｎ Ｖ 株对 鸭 的 感 染性 、 致病 性 以及 鸭在 家禽 新城 疫（ Ｄ Ｎ ）
流行 中的意 义 ，本研 究选 用 ７个 ＮＤＶ株 进行 了雏 野 鸭 的人 工 感染 试验 ，对 感 染鸭 的 临床 症状 、增 重 、抗 体 反应 、
鸡 源 强毒 株 Ｊ Ｃ ８ ４ Ｓ ０ ０ 、鹅 源强 毒株 Ｊ Ｇ０ １ Ｓ ２ ０以及 疫 苗毒 株 Ｍｕ ｔｓ ｋｅｗａ和 Ｌ ｏａ对鸭 不 具 有 致病 性 ，感 染鸭 未 出现 ａＳ ｔ
临床 症状 ，生长 发 育也 未 受到 影 响 。它们 在 鸭体 内存在 时 间也较 短 。 所有 感 染鸭 均 有排 毒 现 象 ，排 毒 时 间和排 毒 途 径 因病 毒株 毒 力 不 同而异 。结 果表 明 Ｎ Ｖ在 进化 过 程 中对鸭 的 致病 性 有逐 渐增 强 的趋 势 。 Ｄ
ｐ ｔｏ ｅ ｉ ｔ ｆｓｖ ｎ Ｎ ｗ ａｔ ｉ ａｅ ｖ ｕ Ｎ Ｖ）ｓ ａ ｓ ｆ ｍ ｄｆ ｒｎ ｖ ｎ ｏ ｉｉ ｅｅ ｉｖ ｓ ｇ ｔｄ ｂ ｘ ｅ ｍｅ ｔ ａ ｇ ｎｃ ｏ ｅ ｅ ｅ ｃ ｓ ｅ ｄｓ ｓ ｉ ｓ（ Ｄ ｈ ｉ ｙ ｌ ｅ ｒ ｔ ｉ ｒ ｉ ｅｅ ｔａ ｉ ｒ ｎ ｗ ｒ ｎ ｅｔ ａｅ ｙ ｅ ｐ ｒ ｎａ ｒｎ ｏ ｆ ａ ｇ ｓ ｉ ｉ ｌ
ｄ ｉ １ ．９ ９ ． ｓ ．０ ８０ ８ ．０ ００ ．２ ｏ： ０３ ６ ￣ｉ ｎ １０ －５ ９２ １ ．８０ ｓ
不 同禽源和 不 同毒 力新城 疫病 毒对 鸭 的感染性
刘 梅 ，程 旭 ，戴 亚斌 焦新 安
ｆ． ｅＮ ￣ １ ０ｌ ａ － 家禽研 究所 ，江苏 扬 州 ２ ５ ０ ；２ 扬州 大学 生物科 学与 技术学 院 ，江苏 扬州 ２ ５ ０ ） ｌ Ｅ ２０３ ． ２０９
新城疫病毒山东分离株F和HN基因克隆与进化分析
１ ３个半胱氨酸残基且位置保 守。与 ＩＳ ｔ ．ｏ ， ａ的氨基酸 同源性为 ８ ． ａ ７ ２％ 一 ８ ８％ ， ８个 山东 ＮＤ ８． 与 Ｖ流行株 的 同源性 为 ８ ． ９ ８％ ～
２１ ０ １年 ２ ４卷 ４期
．
西
南
农
业
学
报 １４ ５７
Ｖ０ ４ Ｌ２
Ｎｏ ４ ．
Ｓ ｕｈ ｅｔ ｈｎ ｏ ｒａ ｆ ｃ ｌ ｒｌ ｃ ｎ ｅ ｏ ｔｗ ｓ Ｃ ｉａＪｕｎ ｌ ｏ Ａ ｕｔ ａ Ｓ ｉ ｃｓ ｕ ｅ
文章 编 号 ：０ １— ８９ ２ １ ） ４—１４ ０ １０ ４ ２ （０ １０ ５７— ５
因裂解位 点的氨基酸序列特征。对 Ｆ基 因４ ￣ ２ ｔ ７ ４０ｎ 序列进行 比对 ， 发现 ４ 株鸡源毒株 基因型为 Ⅶｄ另一鸽源毒株基 因型为Ⅵ。 ，
５ 个分 离株 间 Ｆ基 因核苷酸和氨基酸序列 同源性分别为 ８ ． ８ ８％ ～ ９ ７％和 ９ ９． ４％ 一 ９ ３％ ， ＬＳ ｔ Ｃ ｎ ０ Ｆ ８ ９的氨基 酸 ９． 与 ａｏ 、 ｌ ｅ 、 ４ Ｅ ａ ｏ３
（ ．ｎｔｕｅｏ ｉａ ｉｎｅａｄＶ ｔｒ ａｙＭｅ ｉｎ ，ｈｎ ｏｇＡｃｄ ｍ ｆ ｃｌ ｒ ｉ ｃ ；． ｈｎ ｏｇＫ ｙＬ ｂｏ ｎｍ ｉ １Ｉｓｔｔ ｆ ｍ ｌ ｅｃ ｎ ｅ ｉ ｒ ｄｃ ｅＳ ａｄ ｎ ａｅ ｙｏ ｉ Ａｎ ｃ Ｓ ｅｎ ｉ Ａ ｕｔ ａ Ｓ ｅ ｅ ２ Ｓａ ｄｎ ｅ ａ ｆ ｉａ Ｄｓ ｕｌ ｃ ｎｓ Ａ ｌ —
第十六次全国动物遗传育种学术讨论会系列学术报告会
报告人及报告名称
5月15日14:00-18:15
猪抗病及肉质相关基因的研究（姜运良山东农业大学）
Toll样受体基因在仔猪泻痢中的作用（谢新民湖南农业大学）
猪CFL2基因及荷包猪肉质相关基因发育表达的研究（苏玉虹辽宁医学院）
Lit1/KCNQ1OT1基因与克隆猪异常表型的相关性研究（李长春华中农业大学）
IGF-Ⅰ基因在不同发育时期鹅肌肉组织中表达规律的研究（郝哲吉林农业大学）
转录因子TEAD1正调控Mrpl21基因的转录活性（王凤丽华中农业大学）
高通量测序筛选F18大肠杆菌抵抗和敏感型仔猪十二指肠差异miRNA（叶兰扬州大学）
FABP在鸡脂类代谢中的功能研究（王启贵东北农业大学）
用δ差异显示法筛选鹅脂肪沉积性状阳性EST的研究（曲湘勇湖南农业大学）
001215肌肉生长抑制素mst滩因敲除猪的研究进展潘登科中国农业科学院北京畜牧兽医研究所犊牛体外胚胎生产技术的研究北京奶牛中心慢病毒载体在畜禽转基因中的应用研究浙江省农业科学院眼外肌卫星细胞的肌肉再生优越性研究沈清武西北农林科技大学转基因动物简便快速可视化核酸检测方法的建立华中农业大学从全基因组表达水平挖掘与奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎相关的基因何阳花中国农业大学精原干细胞体内介导制备抗病转基因鸡的研究扬州大学lxra激活剂影响奶山羊乳腺上皮细胞的基因表达西北农林科技大学鸡foxola因5?调控区rs13973515位点的pgl3promoter载体构建及其定点突变王思兵华南农业大学使用手工克隆技术制备侏儒症转基因猪模型杜玉涛深圳华大基因研究院山羊pthrp基因干扰重组腺的制备与鉴定西北农林科技大学姜曲海猪内源性反车寻病毒的相关研究猪脂肪组织发育相关mirna定及表达分析李国喜西北农林科技大学枇猪前体脂肪细胞的原代和传代培养及诱导分化的研究胡艳霞山东农业大primir1031重组腺的构建及山羊原代乳腺上皮细胞中的表达滋西北农林科技大学piggybac转座子在绒山羊基因组中的整合位点及其特征分析白丁平西北农林科技大学猪osbpl基因在骨骼肌中的印记鉴定及与部分性状关联性分析王猛山东农业大学不问长度原始转录本对小鼠mir195过表达效果影响的比较华中农业大学地点
株番鸭源新城疫病毒的分离鉴定及其部分生物学特性分析
反转 录酶 Ｒ ｅ ｖ ｅ ｒ ｓ ｅ Ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｃ ｒ ｉ ｐ ｔ ａ ｓ ｅ Ｘ Ｌ （ Ａ Ｍ Ｖ） 、 Ｅ Ｘ Ｔ ａ ｑ聚 合 酶 、 随 机 引 物
Ｒａ ｎ ｄ ｏ ｍ ｐ ｉｍｅ ｒ ｒ ｓ 、 ｄ ＮＴ Ｐ ｓ （ ｅ ａ ｃ ｈ ２ ． ５ ｍｍｏ ｌ ／ Ｉ ｘ Ｌ） 、 ＤＮＡ Ｍａ ｒ ｋ ｅ ｒ ＤＬ ２ ０ ０ ０、
脏 、 肾脏肿大 、 坏 死 。但 各 个 攻 毒 组 之 间 的病 变 存 在 差 异 。
Ｄ ｕ ｃ ｋ — ｏ ｒ ｉ ｇ ｉ ｎ ） ，是 由鸭 副 粘 病 毒 （ Ｄ ｕ ｃ ｋ Ｐ ａ ｒ ａ ｍ ｙ ｘ ｏ Ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ） 引 起 的 鸭 的 一 种 急
性、 高 度 接 触性 传 染 病 。 鸭 副 粘 病 毒 为 禽 Ｉ型副 粘 病 毒 ，与 鸡 新 城 疫 病 毒 同
学院）
得轻微。 对 照 组鸡 上 述 器 官 未 见 明 显 病 理
组织学变化。
中 图分 类 号 ： ￥ ８ ５ ８ ． ３ ２ 文 献标 识 码 ： Ａ
文章 编 号 ： １ ０ ０ ８ － ０ ４ １ ４ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ４ — ０ ０ ２ ０ — ０ ３
摘 要 从 广东地 区某养鸭场的患病雏番鸭群 中分 离到１ 株病毒 ， 该病毒能凝 ３ 讨 论
大量坏死 ． 接 种后 １ ２ ０ ｈ． 上 述 变 化 变
１ 株番鸭源新城疫病毒的分离鉴定 及其部分生物学特性分析
黄 兴 国 王 俊 峰ｚ 蔡 丽 丽。 王政 富 黄 淑 坚
（ １ ． 佛 山科 学 技 术 学 院 生命 科 学 学 院 ， 广东 佛山 ５ ２ ８ ２ ３ １ ； ２ ． 华 南农 业 大 学 兽 医
鸭瘟病毒北京株UL6和UL7基因的克隆及序列测定
鸭瘟病毒北京株UL6和UL7基因的克隆及序列测定郭霄峰;廖明;辛朝安【期刊名称】《畜牧兽医学报》【年(卷),期】2002(033)006【摘要】依据文献报道的鸭瘟病毒(DPV)的核苷酸序列,设计和合成了二对引物,分别为SP1和SP2,LP1和LP2.北京株鸭瘟病毒于鸭胚中增殖,差速离心和蔗糖密度梯度离心纯化,按酚-氯仿法抽提DNA.然后以DPV DNA为模板进行PCR,分别扩散增出与理论相符的421bp和1209bp的二个DNA片段,并将它们克隆于质粒pGEM-T Easy中.经酶切和质粒PCR,筛选含有目的基因的重组质粒.重组质粒以步移法从双方向测序,获1586bp的核苷酸序列.研究发现这1586bp的核苷酸序列与文献报道的UL6和UL7基因序列的同源性为99%,仅有一个碱基的差异.进一步作氨基酸分析,发现这个碱基所引起的变异为无意义突变(CCT→CCC).结果表明,鸭瘟病毒的UL6和UL7基因在不同的毒株中高度保守.【总页数】4页(P615-618)【作者】郭霄峰;廖明;辛朝安【作者单位】华南农业大学动物医学系,广州,510642;华南农业大学动物医学系,广州,510642;华南农业大学动物医学系,广州,510642【正文语种】中文【中图分类】S855.3【相关文献】1.鸭瘟病毒UL6基因的原核表达及多克隆抗体的制备 [J], 吴双;马丽丽;朱善元;陆辉2.鸭瘟病毒强、弱毒株TK基因的克隆与序列测定 [J], 谢秀兰;杨发龙;李阳友;岳华3.伪狂犬病病毒Ea株UL6基因的克隆、序列分析及表达 [J], 薛念波;肖少波;江云波;梅小伟;刘曼莉;赵骞;罗锐;陈焕春;方六荣4.传染性喉气管炎病毒北京E2株gC基因的克隆及其部分序列测定 [J], 吴红专; 陈义为5.猪瘟病毒(HCV)石门株部分p23和p14基因的克隆、序列测定及与其他HCV株的比较 [J], 李红卫;涂长春;吕宗吉;孙明;金扩世;余兴龙;殷震因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
211240638_一株鸭腺病毒3型的分离、鉴定及致病性分析
畜牧兽医学报 2023,54(5):2050-2061A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.05.026开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析曹秀芸1,刘吉文1,汤智辉1,郑紫怡1,闫丽萍1,2*,宋素泉1*(1.南京农业大学动物医学院动物健康与食品安全实验室,南京210000;2.南京农业大学免疫研究所,南京210000)摘 要:从现地分离一株3型鸭腺病毒(d u c k a d e n o v i r u s 3,D A d V -3)并命名为D A d V -3Y N 株,分析该毒株的基因特征与致病特性,本研究选用L MH 细胞进行病毒分离与纯化,并对Y N 株的h e x o n ㊁p e n t o n b a s e ㊁f i b e r 1和f i b e r 2基因进行测序分析㊂通过腿部肌肉注射病毒感染7日龄番鸭,观察番鸭精神状态,记录体重变化㊁脏器剖检特征㊁组织病理学变化㊁计算脏器载毒量㊁泄殖腔拭子排毒量以及血清生化等数据,同时测定法氏囊与脾内凋亡相关基因转录水平以探究Y N 株对宿主免疫功能的影响㊂结果显示,番鸭感染Y N 株后体重增长受到显著抑制(P <0.01;P <0.0001);体内各脏器均出现不同程度病变,攻毒组鸭的肝组织与肾组织脏器系数均大于对照组且在攻毒后第7天差异极显著(P <0.01);攻毒组番鸭血清内丙氨酸氨基转移酶㊁天冬氨酸氨基转移酶和尿素氮含量均显著高于对照组(P <0.001,P <0.0001);同时,法氏囊与脾内细胞凋亡相关基因m R N A 水平显著上升(P <0.01;P <0.001)㊂以上结果提示,Y N 株感染7日龄番鸭后,可以导致肝和肾等脏器损伤,同时可以诱导法氏囊与脾内细胞凋亡从而影响番鸭免疫功能㊂关键词:鸭腺病毒3型;基因特征;致病力;免疫功能中图分类号:S 858.32 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)05-2050-12收稿日期:2022-05-18基金项目:禽腺病毒亚单位疫苗平台的构建及应用项目(J B G S 202103)作者简介:曹秀芸(1997-),女,浙江绍兴人,硕士生,主要从事病毒分离工作,E -m a i l :1677588114@q q.c o m *通信作者:闫丽萍,主要从事动物传染病学研究,E -m a i l :y a n l i p i n g @n j a u .e d u .c n ;宋素泉,主要从事临床兽医相关研究,E -m a i l :s u q u a n .s o n g@n ja u .e d u .c n I s o l a t i o n ,I d e n t i f i c a t i o n a n d P a t h o g e n i c i t y A n a l y s i s o f a D u c k A d e n o v i r u s T y pe 3C A O X i u y u n 1,L I U J i w e n 1,T A N G Z h i h u i 1,Z H E N G Z i y i 1,Y A N L i p i n g 1,2*,S O N G S u qu a n 1*(1.A n i m a l H e a l t h a n d F o o d S a f e t y L a b o r a t o r y ,C o l l e g e o f V e t e r i n a r y Me d i c i n e ,N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210000,C h i n a ;2.N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y I n s t i t u t e of I mm u n o l og y ,N a n j i n g 210000,C h i n a )A b s t r a c t :T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y wa s t o i s o l a t e a n o v e l D u c k a d e n o v i r u s 3(D A d V -3)Y N s t r a i n a n d e l u c i d a t e i t s g e n e t i c c h a r a c t e r i s t i c s a n d p a t h o g e n i c i t y.L MH c e l l s w e r e s e l e c t e d f o r v i -r u s i s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n ,a n d t h e n t h e v i r u s g e n e s ,i n c l u d i n g h e x o n ,pe n t o n b a s e ,f i b e r 1,a n d f i b e r 2w e r e s e q u e n c e d a n d a n a l y z e d .S e v e n -d a y s -o l d M u s c o v y d u c k s w e r e i n f e c t e d b y i n t r a -m u s c u l a r i n j e c t i o n i n t h e l eg s ,a n d th e m e n t a l s t a t e o f t h e d u c k s w a s o b s e r v e d .B e si d e s ,t h e b o d yw e i g h t c h a n g e s ,n e c r o p s y c h a r a c t e r i s t i c s o f o r g a n s ,h i s t o p a t h o l o g i c a l c h a n ge s ,v i r a l l o a d of o r -g a n s ,c l o a c a s w a b d e t o x i f i c a t i o n ,a n d s e r u m b i o ch e mi s t r y w e r e r e c o r d e d a n d a n a l y z e d .F u r t h e r -m o r e ,t h e t r a n s c r i p t i o n l e v e l s o f a p o p t o s i s -r e l a t e d g e n e s i n t h e b u r s a a n d t h e s pl e e n w e r e m e a s -u r e d t o e x p l o r e t h e e f f e c t o f Y N s t r a i n o n i mm u n e f u n c t i o n .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e w e i gh t g a i n o f i n f e c t e d d u c k s w a s s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e d (P <0.01,P <0.0001),a n d d i f f e r e n t d e gr e e s o f l e s i o n s a p p e a r e d i n v a r i o u s o r g a n s .T h e c o e f f i c i e n t s o f l i v e r s a n d k i d n e y s o f t h e e x pe r i m e n t a l5期曹秀芸等:一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析g r o u p w e r e l a r g e r t h a n t h o s e o f t h e c o n t r o l g r o u p,a n d t h e d i f f e r e n c e w a s e x t r e m e l y s i g n i f i c a n t o n t h e7t h d a y a f t e r t h e c h a l l e n g e.A l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e,a s p a r t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e,a n d u r e a n i t r o g e n i n t h e s e r u m o f t h e M u s c o v y d u c k s i n t h e c h a l l e n g e g r o u p w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h o s e i n t h e c o n t r o l g r o u p(P<0.001,P<0.0001).A t t h e s a m e t i m e,t h e m R N A l e v e l s o f a p-o p t o s i s-r e l a t e d g e n e s i n t h e b u r s a a n d t h e s p l e e n i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y(P<0.01,P<0.001).(C o n c l u s i o n)T h e a b o v e r e s u l t s s u g g e s t t h a t D A d V-3Y N s t r a i n c a n d a m a g e l i v e r s a n d k i d n e y s w h e n c h a l l e n g i n g t h e7-d a y s-o l d M u s c o v y d u c k s,s i m u l t a n e o u s l y,i t c a n a f f e c t t h e i mm u n e f u n c-t i o n o f M u s c o v y d u c k s b y c a u s i n g a p o p t o s i s o f c e l l s i n t h e b u r s a a n d t h e s p l e e n.K e y w o r d s:d u c k a d e n o v i r u s3;g e n e t i c c h a r a c t e r i s t i c s;p a t h o g e n i c i t y;i mm u n e f u n c t i o n*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r s:Y A N L i p i n g,E-m a i l:y a n l i p i n g@n j a u.e d u.c n;S O N G S u q u a n,E-m a i l: s u q u a n.s o n g@n j a u.e d u.c n鸭腺病毒(d u c k a d e n o v i r u s,D A d V)被发现最早可以追溯到1977年法国番鸭场中爆发的一场大规模疾病之中,在疫病中被感染的番鸭体重下降,站立不稳,直到1982年,B o u q u e t等[1]通过中和试验,确认该病毒不同于之前所知的禽腺病毒属成员,是一种新型腺病毒㊂2011年,H a r r a c h等[2]提议将这种病毒命名为2型鸭腺病毒(d u c k a d e n o v i r u s2, D A d V-2),但是因为缺乏全株基因序列,该提议并没有被国际病毒委员会(T h e I n t e r n a t i o n a l C o m-m i t t e e o n T a x o n o m y o f V i r u s e s,I C T V)所采纳㊂2014年,奥地利科学家M a r e k等[3]成功获得D A d V-2全基因组序列㊂同年在我国广东,部分番鸭养殖场也出现了类似D A d V-2感染的症状,对所分离毒株进行全基因组测序发现,分离株不同于先前的D A d V-2G R株,被认为是3型鸭腺病毒(d u c k a d e n o v i r u s3,D A d V-3)的候选毒株[4-5]㊂根据I C-T V最新分类,D A d V-2和D A d V-3均属于禽腺病毒属成员㊂目前,国内多地流行的鸭腺病毒仍以D A d V-3为主[6],被感染番鸭主要表现为肝㊁肾肿胀出血和轻微心包积液㊂发病率在40%~55%之间,死亡率可达35%~43%,给各地养殖场带来极大的经济损失[6]㊂2021年7月,云南某番鸭养殖场内7日龄雏鸭纷纷发病,呈现典型D A d V-3的感染症状,本实验室在此批病料中分离获得1株D A d V-3,命名为D A d V-3Y N株㊂本研究拟通过分析毒株的4段主要结构蛋白基因,并感染7日龄番鸭观察分析其临床症状㊁脏器变化㊁脏器载毒量以及法氏囊内细胞凋亡相关基因转录水平,对D A d V-3的遗传特性和致病特征做出全面系统描述,以期为临床对D A d V-3的科学防控提供理论支持㊂1材料与方法1.1试剂材料T r e l i e f T M A n i m a l G e n o m i c D N A K i t购自擎科生物有限公司,2ˑH i e f f P C R M a s t e r M i x㊁H i f a i r Ⅱ1s t S t r a n d c D N A S y n t h e s i s K i t㊁H i e f f U N I C O N q P C R S Y B R G r e e n M a s t e r M i x购自翌胜生物, R N A i s o l a t e r T o t a l R N A E x t r a c t i o n R e a g e n t购自诺唯赞生物公司;D L600D N A M a r k e r㊁D L2000 D N A M a r k e r㊁p M D T M18-T V e c t o r C l o n i n g K i t购自T a k a R a宝日医生物公司㊂1.2样品处理与病原检测2021年7月,云南某番鸭养殖场内7日龄番鸭广泛发病,主要临床病变为肝肾肿胀出血㊂无菌采集番鸭肝组织冷藏运送至实验室进行检测㊂取适量肝组织置于E P管内,充分研磨后取组织悬液上清,按照说明书提取组织D N A和R N A㊂使用常见鸭源病毒引物进行检测,P C R阳性产物连接T载体后送往擎科生物有限公司进行测序验证,每样质粒送3份样品㊂1.3病毒扩增与纯化选取雄性莱昂鸡肝癌(L e g h o r n m a l e h e p a t o-m a,L MH)细胞按照文献中内容进行病毒扩增,当80%以上细胞出现病变后收取培养上清[7]㊂采取有限稀释法进行病毒纯化,3轮有限稀释法后用P C R 方法检测无外源病毒,随后使用蚀斑试验进一步纯化病毒株㊂1.4病毒T C I D50测定L MH细胞接种于96孔板,根据文献中方法接毒[8-9],采用R e e d-M u e n c h两氏法计算T C I D50为107.8㊃m L-1㊂收集细胞培养上清用于后续试验㊂1502畜牧兽医学报54卷1.5Y N株主要结构蛋白基因序列分析参照N C B I上已有D A d V-3G D MM10株(MH777398)的h e x o n㊁p e n t o n b a s e㊁f i b e r1和f i-b e r2基因序列,设计5对引物进行序列扩增,引物由擎科生物有限公司合成,相关信息见下表㊂按照各自退火温度进行P C R扩增,在1%琼脂糖凝胶上电泳,切下明亮条带连接T载体后送往擎科生物有限公司进行测序㊂所得测序结果使用D N AMA N 软件进行序列拼接并使用M E G A7进行序列比对分析㊂表1测序引物信息表T a b l e1T h e i n f o r m a t i o n o f s e q u e n c i n g p r i m e r s引物名称P r i m e r n a m e 引物序列(5'ң3')S e q u e n c e(5'ң3')片段长度/b pP r o d u c t l e n g t h退火温度/ħA n n e a l i n g T e m p e r a t u r eD-h e x o n-A F:A T C G C G T A G A C G A A T GR:T G G C A G G T A A T C A G C A 140660D-h e x o n-B F:T A A T A T C C C G G C T T C T AR:G C T G A C T G T C G G T G G T T 156460D-p e n t o n F:T A G C C A A T A A C T T A C C G CR:A T C C T A G A G C A C G A C C T T 168162D-f i b e r1F:A A G G C A G G A T T C A G A G GR:C A G A A C G G A T A T G T T A G G T C 151357D-f i b e r2F:C G T A C C T A G C G A A G A T T GR:T G C C A T G C G A G T A C A T T 160053F.上游引物序列;R.下游引物序列㊂下同F.F o r w a r d p r i m e r s e q u e n c e.R.R e v e r s e p r i m e r s e q u e n c e.T h e s a m e a s b e l o w1.6D A d V-3Y N株动物致病性试验1.6.1试验动物分组与攻毒设计1日龄番鸭(购自南京特给力种植有限公司)适应性饲养至7日龄,随机分为攻毒组与对照组㊂对照组包含12只番鸭,攻毒组分为观察组与剖检组,每组各10只㊂攻毒组番鸭腿部肌肉注射0.3m L病毒液(3ˑ106.8㊃m L-1 T C I D50),对照组相同部位注射0.3m L P B S㊂攻毒组与对照组番鸭在不同房间饲养,并由不同人员管理,其余条件相同,连续观察14d,记录观察组番鸭临床变化,攻毒后每间隔2d称量番鸭体重并采集泄殖腔拭子㊂剖检组与对照组番鸭在攻毒后第3与第7天随机剖检3只㊂攻毒后14d安乐死剩余攻毒组与对照组番鸭并进行剖检㊂1.6.2剖检观察与切片制作番鸭静脉采血后处死㊂对番鸭进行解剖,观察有无脏器病变㊂称取心㊁肝㊁肾重量并计算脏器系数,脏器系数的计算公式为:脏器重量(g)/体重(g)*100%㊂采集脏器保存于-80ħ冰箱准备后续检测病毒,固定攻毒后第7天番鸭相应脏器,送往武汉皮诺飞生物公司制作切片㊂1.6.3血清生化检测攻毒后第3㊁7和14天分别采集攻毒组与对照组血清,使用南京建成生物工程研究所检测试剂盒检测番鸭血清内丙氨酸氨基转移酶(a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e,A L T)㊁天冬氨酸氨基转移酶(a s p a r t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e,A S T)和尿素氮(u r e a n i t r o g e n,B U N)三种酶含量,每个样本重复检测3次㊂参照说明书计算分析酶活性㊂1.6.4番鸭排毒量与脏器病毒载量测定攻毒后第3㊁7和14天分别采集攻毒组与对照组番鸭脏器,攻毒后每隔2d采集泄殖腔拭子㊂依照说明书步骤提取病毒D N A㊂以D A d V-3Y N株h e x o n基因序列为模板,使用P r i m e r5软件设计引物,引物信息见表2,引物由擎科生物有限公司合成㊂以实验室所构建T-h e x o n质粒为阳性模板,按照文献方法[10],10倍比稀释制作荧光定量标准曲线㊂q P C R检测脏器与泄殖腔拭子所含病毒,将攻毒组C t值数据带入标准曲线公式内计算拷贝数㊂每个样品重复3次㊂根据10c o p i e s病毒量为界限, 3个重复孔C t值大于35的判定为阴性,反之则判断为阳性㊂1.6.5法氏囊与脾凋亡基因m R N A转录水平测定 T R I z o l法提取法氏囊和脾总R N A并反转录成c D N A,S Y B R G r e e n q P C R进行检测,所得数据基于2-әәC t的方式进行计算,获得促凋亡基因25025期曹秀芸等:一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析B a x,B a k-1,c a s p a s e-3和c a s p a s e-9以及抑凋亡基因B c l-2的转录水平㊂引物参考现有文献内序列,相关信息见表3,由擎科生物有限公司合成㊂表2D A d V-3病毒定量P C R引物信息T a b l e2P r i m e r i n f o r m a t i o n o f q u a n t i t a t i v e P C R d e t e c t i o n f o r D A d V-3引物名称P r i m e r n a m e 引物序列(5'ң3')S e q u e n c e(5'ң3')片段长度/b pP r o d u c t l e n g t hD A d V-3-F G T C T G C T C A G G T A C G C T T A A T T CD A d V-3-R T C T A C T G C C T G A T T C C A T A G T G C149表3引物信息表T a b l e3P r i m e r i n f o r m a t i o n引物名称P r i m e r n a m e 引物序列(5'ң3')S e q u e n c e(5'ң3')片段长度/b pP r o d u c t l e n g t hB a x[11]F:A A AC C A A G C G G C T C A G C G A G TR:G G C C C C A G T T G A A G G C T C C G T C C 162B a k-1[12]F:G G T G A GC C A G C G T T A G A A A GR:G C T C C T G T C A C C A T G T T C C T 135B c l-2[12]F:G G A G G GC T G A A A G A A A A A GR:T A T G A T G C G G C A C G A C T G 213c a s p a s e-3[12]F:C G G A C T G T C A T C T C G T T C A G G C A CR:G T C C T T C A T C G C C A T G G C T T A G C 200c a s p a s e-9[11]F:A T C C T G T C C C A C G G C T G T C AR:T C G G G T G A A T C G C A A T C C A C T 212β-a c t i n[12]F:A T G T C G C C C T G G A T T T C GR:C A C A G G A C T C C A T A C C C A A G A A1651.7数据分析本研究中使用G r a p h P a d P r i s m整理试验数据并绘图,数据均表示为 平均值ʃ标准误差(m e a nʃS E M) ,通过双因素方差分析(T w o-w a y A N O V A)对不同组数据之间的差异性进行统计学检验㊂*Pɤ0.05被认为具有显著性差异㊂2结果2.1病毒的分离番鸭样品经过检测发现禽流感病毒㊁减蛋综合征病毒㊁4型禽腺病毒等常见病原均为阴性,但D A d V-3呈强阳性,同时伴随着鸭瘟病毒(d u c k e n-t e r i t i s v i r u s,D E V)和番鸭细小病毒(M u s c o v y d u c k p a r v o v i r u s,M D P V)感染㊂P C R产物经过测序比对确认无误㊂选择L MH细胞进行病毒分离,病毒接种于L MH细胞24h后,细胞出现典型的细胞病变(图1A):细胞皱缩呈现葡萄串状,大量死细胞脱落漂浮于培养上清中,与腺病毒接毒后病变相似[13]㊂病毒在细胞上多次传代均可见一致的细胞病变㊂收取细胞培养上清,P C R结果显示培养上清中可扩增得到633b p的特异性条带(图1B)㊂2.2Y N株基因进化分析鸭腺病毒主要依据h e x o n与f i b e r等基因序列的同源性进行种属分类[6,14]㊂序列比对结果显示(图2),Y N株h e x o n,p e n t o n b a s e和f i b e r1基因与D A d V-3G D MM10株以及C H-G D-12-2014株高度同源(100%);f i b e r2在第1338个碱基处存在突变,由腺嘌呤(A)突变为胞嘧啶(C),翻译的氨基酸由异亮氨酸变为谷氨酰胺,与G D MM10等毒株相同源性99.93%㊂与禽腺病毒的一些血清型相比,Y N 株与G o o s e a d e n o v i r u s-4同源性更高,相比之下禽腺病毒虽然也能感染鸭,但与Y N株同源性相对较低㊂3502畜 牧 兽 医 学 报54卷A.接毒后L MH 细胞产生病变;B .D A d V -3P C R 后电泳结果:M.D L 2000D N A M a r k e r ;1.阳性对照;2.细胞培养上清;3.阴性对照A.C y t o p a t h i c e f f e c t (C P E )w a s p r o d u c e d i n L MH c e l l s p o s t -i n f e c t i o n o f t h e v i r a l i s o l a t e ;B .E l e c t r o ph o r e s i s r e s u l t s o f D A d V -3a f t e r P C R :M.D L 2000D N A M a r k e r ;1.P o s i t i v e ;2.C e l l c u l t u r e s u p e r n a t a n t ;3.N e ga t i v e c o n t r o l 图1 Y N 株接毒后细胞病变与P C R 检测F i g .1 C y t o pa t h i c e f f e c t d e t e c t e d i n L M H c e l l a n d P C R d e t e c t i o n o f Y N s t r a in A.h e x o n 基因进化树;B .p e n t o n b a s e 基因进化树;C .f i b e r 1基因进化树;D.f i b e r 2基因进化树㊂方框内为本研究中Y N 株A.G e n e t i c e v o l u t i o n a r y t r e e o f h e x o n g e n e ;B .G e n e t i c e v o l u t i o n a r y t r e e o f p e n t o n b a s e g e n e ;C .G e n e t i c e v o l u t i o n a r y tr e e o f f i b e r 1g e n e ;D.G e n e t i c e v o l u t i o n a r y t r e e o f f i b e r 2g e n e .T h e Y N s t r a i n w a s s h o w e d b y a bo x 图2 D A d V -3Y N 株基因进化树F i g .2 G e n e t i c e v o l u t i o n a r yt r e e o f D A d V -3Y N s t r a i n 2.3 攻毒后番鸭临床症状7日龄番鸭攻毒后出现精神沉郁,蹲卧好静等情况,未见死亡病例㊂对照组番鸭精神状态良好,生长发育正常㊂每隔2d 对番鸭进行称重(图3),结果显示,攻毒组番鸭体重在第7与第9天显著低于对照组(P <0.0001),攻毒后第11天攻毒组仍显著低于对照组(P <0.05)㊂直至攻毒后第13天,两组番鸭体重差异不显著㊂结果表明,7日龄番鸭攻毒后体重增长受到一定抑制㊂2.4 攻毒后番鸭脏器病变2.4.1 脏器解剖学病变 雏鸭通过腿部肌肉注射感染病毒后,在感染后第3㊁7和第14天进行剖检,发现攻毒组番鸭出现轻微心包积液(图4A ),心表观未见明显变化㊂在第3㊁7天肝组织略显肿大并45025期曹秀芸等:一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析*.P <0.05;**.P <0.01;***.P <0.001;****.P <0.0001,下同*.P <0.05;**.P <0.01;***.P <0.001;****.P <0.0001.T h e s a m e a s b e l o w图3 攻毒后番鸭体重(n =5)F i g .3 B o d y w e i g h t o f M u s c o v y du c k s a f t e r i n f e c t i o n (n =5)存在出血点,第14天肝充血肿胀,边缘略显钝圆,存在明显出血点(图4B )㊂此外,攻毒组番鸭肾组织存在不同程度的肿胀,颜色加深(图4C )㊂脾淤血肿胀,边缘钝圆,颜色暗红(图4D )㊂2.4.2 脏器组织病理学变化 固定脏器相应部位后制作切片,显微镜观察未发现心肌细胞出现明显变化㊂攻毒组番鸭肝细胞变性,染色不均,肝细胞排列混乱,肝索结构消失㊂脾淤血,大量红细胞分布于脾细胞间㊂攻毒后番鸭肾组织内肾小球萎缩,与小囊间间隙增大且肾小囊内血细胞增多,肾小管上皮细胞变性㊁肿大突入管腔内导致管腔狭窄,小管结构不清(图5)㊂A.番鸭出现心包积液;B .番鸭肝组织病变;C .攻毒后番鸭肾组织病变;D.番鸭脾组织病变㊂心包内积液由黑色箭头指出,肝组织出血点由白色箭头指出㊂d pi 表示攻毒后天数A.P e r i c a r d i a l e f f u s i o n a f t e r i n f e c t i o n ;B .P a t h o l o g i c a l c h a n g e s o f l i v e r s ;C .P a t h o l o g i c a l c h a n g e s o f k i d n e y s ;D.P a t h o l o gi -c a l c h a n g e s o f s p l e e n s .P e r i c a r d i a l e f f u s i o n w a s s h o w e d b y b l a c k a r r o w s a n d b l e e d i n g p o i n t i n l i v e r s w a s s h o w e d b y w h i t e a r -r o w s .d p i m e a n s d a ys p o s t i n f e c t i o n 图4 攻毒后番鸭脏器病变F i g .4 O r g a n s p a t h o l o g i c a l c h a n g e s o f M u s c o v y du c k s a f t e r i n f e c t i o n 2.4.3 脏器系数变化 通过计算脏器系数,发现攻毒组与对照组番鸭心脏系数无明显差异,攻毒组番鸭的肝脏与肾脏系数在攻毒后均大于对照组,在攻毒后第7天存在显著差异(图6A ,P <0.01),提示攻毒后肝㊁肾存在一定肿胀㊂2.4.4 血清生化指标变化 检测血清A L T ,A S T 以及B U N 三种酶的含量㊂结果显示,血清内B U N 含量在攻毒后第3㊁7㊁14天都显著高于对照组(P <0.001)㊂A L T 在攻毒后第3㊁7与14天差异极显著(P <0.01,P <0.001)㊂攻毒组血清A S T5502畜 牧 兽 医 学 报54卷图5 不同脏器病理切片(400ˑ)F i g .5 P a t h o l o g i c a l s e c t i o n o f d i f f e r e n t o r ga n s (400ˑ)A.心脏系数;B .肝脏系数;C .肾脏系数;D.血清B U N 含量;E .血清A L T 含量;F .血清A S T 含量A.C a r d i a c c o e f f i c i e n t ;B .L i v e r c o e f f i c i e n t ;C .K i d n e y co e f f i c i e n t ;D.L e v e l o f B U N ;E .L e v e l o f A L T ;F .L e v e l o f A S T 图6 脏器系数与血清生化指标(n =3)F i g .6 O r ga n c o e f f i c i e n t a n d s e r u mb i oc h e m i c a l i nde x (n =3)含量在攻毒后第3天(P <0.01),第7天(P <0.001)和第14天(P <0.01)与对照组相比差异极显著(图6B )㊂结果提示攻毒后番鸭肝与肾均存在一定损伤㊂2.5 攻毒后番鸭排毒量与脏器载毒量使用荧光定量P C R 对所采集泄殖腔拭子以及不同组织脏器进行检测,结果显示,攻毒后番鸭排毒量持续在102~103c o pi e s ㊃m L -1,攻毒后第1天排毒量最高,直至试验结束仍可向环境中持续排毒(图7A )㊂攻毒后番鸭肝与心载毒量较高,在攻毒后第7和14天分别达105和104c o p i e s ㊃g -1,攻毒后第7与14天,肝载毒量逐渐升高,与其他脏器差异显著(P <0.01,P <0.001,P <0.0001)㊂攻毒后脾脏载毒量较其他脏器略低,约103~104c o p i e s ㊃g -1㊂试验过程中对照组番鸭的泄殖腔拭子与脏器载毒量检测均呈阴性㊂2.6 法氏囊与脾凋亡相关基因转录水平由结果可知(图8㊁9),攻毒后番鸭法氏囊与脾65027502 5期曹秀芸等:一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析A.攻毒后试验组番鸭泄殖腔排毒情况;B.攻毒后3d脏器载毒量;C:攻毒后7d脏器载毒量;D.攻毒后14d脏器载毒量㊂数据分析采用双因素方差分析(n=3)㊂相同字母表示两组数据无显著差异,不同字母表示两组数据存在显著差异,肝与其他脏器差异性用*表示A.E x p e l l i n g o f t o x i n i n c l o a c a o f e x p e r i m e n t d u c k s a f t e r i n f e c t i o n;B.O r g a n v i r u s l o a d i n3d a y s p o s t-c h a l l e n g e;C.O r g a n v i r u s l o a d i n7d a y s p o s t-c h a l l e n g e;D.O r g a n v i r u s l o a d i n14d a y s p o s t-c h a l l e n g e.D a t a w e r e a n a l y z e d u s i n g t w o-w a y A N O-V A(n=3).T h e s a m e l e t t e r i n d i c a t e s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o g r o u p s a n d t h e d i f f e r e n t l e t t e r s i n d i c a t e s i g-n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e t w o g r o u p s o f d a t a,t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e l i v e r a n d o t h e r o r g a n s i s i n d i c a t e d b y*图7攻毒后试验组番鸭泄殖腔排毒量与脏器组织病毒载量F i g.7V i r a l l o a d o f c l o a c a l s w a b a n d v i s c e r a i n e x p e r i m e n t d u c k s a f t e r i n f e c t i o n图8法氏囊凋亡相关基因转录水平(n=3)F i g.8T r a n s c r i p t i o n l e v e l o f a p o p t o s i s-r e l a t e d g e n e s i n b u r s a(n=3)畜 牧 兽 医 学 报54卷图9 脾凋亡相关基因转录水平(n =3)F i g .9 T r a n s c r i p t i o n l e v e l o f a p o p t o s i s -r e l a t e d g e n e s i n s pl e e n (n =3)促凋亡基因转录水平出现不同程度升高㊂攻毒组番鸭在攻毒后第7天法氏囊内4种促凋亡基因B a x ㊁B a k -1㊁c a s p a s e -3和c a s pa s e -9转录水平显著高于对照组(P <0.0001),攻毒后第14天B a x (P <0.01)㊁B c l -2(P <0.001)㊁c a s pa s e -3(P <0.0001)和c a s pa s e -9(P <0.0001)也显著高于对照组㊂抑凋亡基因B c l -2则在攻毒后第7天(P <0.0001)和第14天(P <0.01)显著下降,B c l -2/B a x 比值也在攻毒后显著下降(P <0.001,P <0.0001)㊂结果表明攻毒后番鸭法氏囊内细胞凋亡水平上升㊂攻毒后第7天番鸭脾内凋亡相关基因转录水平均显著高于对照组(P <0.0001),抑凋亡基因转录水平显著下降(P <0.01,P <0.0001);攻毒后第14天B a x (P <0.01)㊁B a k -1(P <0.001)和c a s p a s e -3㊁c a s pa s e -9(P <0.0001)也显著升高㊂B c l -2/B a x 比值也在攻毒后第7与14天显著下降,以上数据提示攻毒后番鸭脾内细胞凋亡水平上升㊂3 讨 论2014年从广东番鸭体内分离到第一株D A d V -3后[15],国内报告D A d V -3临床感染的情况越来越多㊂2018年,S h i 等[14]自福建㊁浙江㊁安徽和广东分离得到4株鸭腺病毒㊂2016 2019年间,S h i 等[6]分离得到7株D A d V -3,全基因组测序发现O R F 67存在缺失,可能是新的突变株㊂2018 2020年间,广东㊁福建与广西三省番鸭养殖场发生多起D A d V -3感染病例,Y i n 等[16]从病料中分离获得12株D A d V -3㊂本实验室从来自云南的病料中分离得到1株D A d V -3Y N 株,序列比对后发现该毒株与目前在国内流行的C H -G D -12-2014株以及G D MM 10株等相应片段相似度为99.93%~100%㊂不同于现有突变株存在的O R F 67截断突变,Y N 株f i b e r 2蛋白长短未改变,也未见对盲肠存在明显致病效果[6]㊂目前对禽腺病毒的研究发现,毒株的致病能力强弱主要由h e x o n ,f i b e r 2蛋白决定[17-18],有研究表明,f i -b e r 2作为保护性抗原可针对病原感染提供免疫保护[19-20],也有学者认为,f i b e r 1在病毒侵染宿主过程中起到主要作用[21]㊂因此,研究4段主要结构蛋白的基因序列对预测分离株的毒力有一定的指导意义㊂之前的研究报道中,鸭腺病毒可以抑制受感染番鸭的生长发育[1,4],同属的禽腺病毒也存在相同的抑制作用[22]㊂本研究中感染番鸭精神状态不佳,体重增长受到显著抑制,与之前研究相一致㊂对攻毒后番鸭脏器进行检测发现各脏器均存在病毒扩增,在肝组织中拷贝量最高㊂番鸭感染D A d V -3后可向环境中持续排毒,这可能对同群番鸭造成感染风险㊂这也与之前对禽腺病毒的研究相符合:禽腺病毒可以通过口-粪传播途径造成水平传播[23]㊂85025期曹秀芸等:一株鸭腺病毒3型的分离㊁鉴定及致病性分析剖检结果显示,番鸭感染Y N株后肝㊁肾等脏器均出现一定病变,与之前C H-G D-12-2014株感染后病变相似[4]㊂相应脏器固定后切片染色,可观察到相对应的组织学病变,同之前S h i等[6]与Y i n等[16]所观察的D A d V-3导致的组织病理学变化相似㊂A L T㊁A S T和B U N分别在肝与肾细胞受到损伤时逸出到血液中[24],因此,本研究攻毒组番鸭血清A L T㊁A S T和B U N含量升高也从侧面证明了番鸭的肝与肾受损㊂B a x与B a k-1作为同一促凋亡家族蛋白,两者之间可形成二聚体激活c a s p a s e[11,25];c a s p a s e-9为凋亡初始阶段发生作用蛋白,c a s p a s e-3则为凋亡的 执行者 ,一旦被激活则使细胞发生不可逆的凋亡[26]㊂本研究中,攻毒组番鸭在感染后法氏囊与脾内B a x等促凋亡基因的表达量均显著上升,B c l-2/ B a x则在攻毒后显著降低,提示法氏囊与脾功能可能受到损害㊂法氏囊是禽类主要免疫器官,在体液免疫中起到重要作用,与宿主抵抗病毒时抗体水平息息相关[27]㊂一些疾病如传染性法氏囊损伤法氏囊后,宿主的免疫功能受到影响[28]㊂研究发现,当传染性法氏囊与禽腺病毒共同感染鸡时,可以导致宿主免疫反应降低以及死亡率增加[29]㊂脾是全身免疫的重要器官,与禽类的先天性免疫息息相关[30],在病毒侵入机体时积极响应[31]㊂已有研究发现,当一些病原感染机体后通过使脾坏死从而削弱宿主的免疫能力[32]㊂本研究中番鸭中枢免疫与外周免疫器官均受到一定影响,势必会增加其他病原的共感染风险㊂流行病学调查发现禽类养殖场内常存在腺病毒与其他病原混合感染的情况[33-35],亦有报道称D A d V-3与其他病原混合感染后可能会导致D A d V-3临床症状加剧[14,16]㊂本研究检测发现,D A d V-3Y N株存在与D E V㊁M D P V混合感染的情况,番鸭免疫机能受到影响,可能导致养殖场内番鸭在混合感染的情况下D A d V-3的临床症状加剧或者其他病原在番鸭体内致病能力增强,这也从侧面解释了实验室感染D A d V-3Y N株后致病能力弱于当地番鸭的临床感染㊂4结论本研究自云南番鸭养殖场分离得到1株鸭腺病毒,通过对分离株的主要基因序列进行分析证实该病毒为D A d V-3㊂致病性试验证实该病毒以较为温和的方式在番鸭群体中流行,感染番鸭后影响其生长性能,损害多个脏器,且导致番鸭持续向环境中排毒,还可以影响番鸭的免疫功能㊂因此,本研究对D A d V-3的分离鉴定和早期防控都具有重要意义㊂参考文献(R e 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鸭源新城疫病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备
２ ０ １ ３年 ８ 月
中 国 预 防 兽
医 学 报
Ｖｏ１ ．３ ５． Ｎ Ｏ． ８
Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｊ ｏ ｕ ｎａ ｒ ｌ ｏ ｆ Ｐ ｒ ｅ ｖ ｅ ｎ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｖｅ ｔ ｅ ｉ ｒ ｎ ａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ
病 机 理 的研 究 奠 定基 础 。
关键词 ：鸭源新城疫病毒 ；核衣 壳蛋白；单克隆抗体
中图 分 类 号 ：￥ ８ ５ ２ ． ６ ５ 文 献标 识 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１ ０ ０ ８ ． ０ ５ ８ ９ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ８ ． ０ ６ ６ ６ ． ０ ３
Ｐｒ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｙ ａ ｇ ａ ｉ ｎ ｓ ｔ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｏ ｃ ａ ｐ ｓ ｉ ｄ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｏ ｆ ｄ ｕ ｃ ｋ — ｏｒ ｉ ｇｉ ｎ Ｎｅ ｗｃ ａ ｓ ｔ ｌ ｅ ｄ ｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ
（ Ｃｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ａ ｎ ｉ ｍａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ ， Ｓ ｈ ａ ｎ ｄ ｏ ｎ ｇ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｔ ａ ｉ ’ ａ ｎ ２ ７ １ ０ １ ８ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
Ｃ ＨＥ ＮＧ Ｙ ａ ｎ － ｌ ｉ ， Ｄ Ｉ ＡＯ Ｙｏ ｕ — ｘ ｉ ａ ｎ ｇ ， Ｏ Ｕ Ｑ ｕ ａ ｎ — ｂ ｉ ｎ ， ＹＡ Ｎ Ｇ Ｊ ｉ ａ ｎ － ｐ ｅ ｎ ｇ ， Ｚ Ｈ Ａ ＮＧ Ｋ ｕ ｎ ， Ｇ Ｕ Ｏ Ｊ ｉ － ｌ ｅ ｉ ， Ｘ Ｉ ＡＯ Ｐ ｏ
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山东农业科学2017，49（1）：121 125Shandong Agricultural SciencesDOI ：10．14083/j．issn．1001－4942．2017．1．026收稿日期：2016－06－23基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201003012，201303033）；现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CAＲS －42－Z12）作者简介：杨少华（1978－），女，山东烟台人，硕士，助理研究员，主要从事禽病综合防控技术研究。
E －mail ：ysh7865@163．com 通讯作者：张秀美（1956－），女，江苏徐州人，研究员，主要从事禽病综合防控技术研究。
E －mail ：zxm820410@163．com 鸭源新城疫病毒HN 蛋白单克隆抗体的制备及与不同分离株的反应性杨少华，黄艳艳，黄庆华，许传田，张琳，张秀美（山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南250100）摘要：为了制备鸭源新城疫病毒基因Ⅶ型毒株HN 蛋白的单克隆抗体，将构建的原核表达载体pET28（a ）－HN 转化BL21（DE3）进行原核表达，纯化HN 重组蛋白，并免疫6周龄BALB /c 小鼠，分离脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合，克隆培养并筛选杂交瘤细胞株，制备单克隆抗体，并对其生物学特性进行了鉴定。
结果显示，表达纯化的重组HN 蛋白分子质量约为49ku ，用ELISA 方法成功筛选出4株针对新城疫Ⅶ型毒株HN 蛋白的单克隆抗体，其中2H7抗体抗原谱较广，具有中和活性，为进一步研究HN 蛋白功能和临床诊断奠定了基础。
关键词：新城疫病毒；单克隆抗体；HN 蛋白中图分类号：S852．65+7文献标识号：A 文章编号：1001－4942（2017）01－0121－05Preparation of Monoclonal Antibodies against HN Protein of NDV Isolated from Duck and their Ｒeactions with Different NDV StrainsYang Shaohua ，Huang Yanyan ，Huang Qinghua ，Xu Chuantian ，Zhang Lin ，Zhang Xiumei（1．Institute of Animal Science and Veterinary Medicine ，Shandong Academy of Agricultural Sciences /Shandong Key Lab of Animal Disease Control and Breeding ，Jinan 250100，China ）Abstract The recombinant plasmid pET28（a ）－HN was transformed into BL21（DE3）to purify the re-combinant HN protein．The 6－week －old BALB /c mice were immunized by the protein．The spleen lympho-cytes were separated and conducted the cell fusion with SP2/0cells at 3days after the last immunization．The hybridoma cell lines were obtained by clone culture and indirect ELISA assay．Then the monoclonal antibodies against HN protein of newcastle disease virus （NDV ）were preparated．Their biologic properties were identi-fied．The results showed that the molecular mass of purified recombinant HN protein was about 49ku．Four monoclonal antibodies were screened．In which ，the antibody 2H7had broad antigen spectrum and neutraliza-tion activity．This study provided a basis for further research on the HN protein function and clinical diagnosis．KeywordsNewcastle disease virus ；Monoclonal antibody ；HN protein新城疫（Newcastle disease ，ND ）是由新城疫病毒引起的多种禽类的一种急性、高度接触性传染病，是危害世界养禽业的重要传染病之一，给各国养禽业造成了严重的经济损失。
新城疫病毒属于副粘病毒科（Paramyxoviridae ）副粘病毒亚科（Paramyxovirus ）腮腺炎病毒属（Ｒubulavirus ）成员，其宿主范围广泛，迄今已知能自然或人工感染的鸟类超过250种。
自1926年从印度尼西亚爪哇首次分离到NDV 以来，世界上已发生了4次ND 大流行。
虽然NDV 只有一个血清型，但是每次ND流行都会有新的基因型出现，且具有一定地域性［1］。
NDV分子流行病学研究表明：自20世纪90年代中期以来，我国流行的NDV病毒，在鸽上主要为Ⅵb亚型［2］，其他家禽90%以上为基因Ⅶ型。
基因Ⅶ型病毒与我国使用最广泛的基因Ⅱ型疫苗病毒（LaSota）之间存在明显的遗传差异和抗原差异［3］。
本研究以原核表达纯化的鸭NDV强毒株SD03的HN蛋白为免疫原，研制了4株能分泌抗NDV HN蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并鉴定其与实验室不同基因型分离株的反应性，为新城疫快速诊断方法的建立奠定一定基础。
1材料与方法1．1病毒、细胞与实验动物鸭源基因Ⅶ型新城疫强毒Duck/China/ SD03/2009（SD03），由本实验室分离并保存［4］，GenBank登录号JN400895；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0和鸡胚成纤维细胞DF1，由本实验室保存，均以含10%胎牛血清的DMEM培养基培养；BALB/c小鼠，购自山东大学实验动物中心。
1．2载体和试剂pET28（a）－HN重组质粒，由本实验室构建并保存，其中HN基因克隆自鸭源新城疫强毒SD03；Qiagen Ni－NTA Agarose和SBA单克隆抗体分型试剂盒，购自济南赛恩斯生物技术公司；荧光素（FITC）标记的山羊抗鼠IgG和辣根过氧化物酶（HＲP）标记的山羊抗鼠IgG，均购自Santa-Cruz公司；ECL发光试剂盒、预染蛋白质、Marker，均购自Clontech公司；显影、定影试剂盒，均购自山东赛恩斯公司。
1．3SD03强毒株HN重组蛋白的表达将构建好的pET28（a）－HN载体转化BL21（DE3）感受态细胞于含卡那霉素的固体培养基上培养，鉴定阳性菌，挑阳性单菌落接种于含Kan （终浓度为50μg/mL）的500mL LB液体培养基中，37ħ振荡（200r/min），培养至OD600为0．6，加入IPTG至终浓度为0．6mmol/L，37ħ继续培养6 h，收集菌液，12000ˑg、4ħ、20min离心后收集菌体，以20mL PBS重悬，超声波破碎后离心，收集沉淀，然后按照Qiagen Ni－NTA Agrose试剂盒说明书的实验步骤对获得的包涵体进行纯化。
SDS－PAGE分析蛋白纯化结果，用考马斯亮蓝法（Bradford）法测定纯化蛋白浓度，分装，－80ħ保存备用。
1．4单克隆抗体的制备1．4．1免疫BALB/c小鼠以上述提纯的HN 融合蛋白免疫6周龄BALB/c雌性小鼠，每次每只免疫剂量50μg，免疫方法为腹腔注射，共免疫4次。
每次免疫的间隔期为2周，首免用弗氏完全佐剂按体积比1ʒ1乳化蛋白，二免至四免用弗氏不完全佐剂按体积比1ʒ1乳化蛋白。
三免一周后，小鼠眼眶采血，测血清抗体效价。
四免两周后，选择效价最高的小鼠，以不加佐剂的蛋白腹腔注射加强免疫一次，3d后取小鼠脾脏淋巴细胞与SP2/0细胞融合。
1．4．2细胞融合取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法进行细胞融合，于5%CO2细胞培养箱中37ħ培养，当SP2/0细胞和脾细胞全部死亡时，用新鲜配制的HT培养基全部置换HAT培养基。
逐日观察，待融合的杂交瘤细胞生长至孔底十分之一，取上清检测。
1．4．3阳性杂交瘤细胞的筛选与建株阳性杂交瘤细胞的筛选采用ELISA方法进行，具体参照文献［5］，阳性细胞株扩大培养并进行有限稀释法克隆3 5次，筛选出能稳定分泌特异性单抗的杂交瘤，并制备单抗腹水，测定其ELISA效价。
1．5单克隆抗体生物学特性的鉴定1．5．1ELISA效价测定包被酶标板，加入单抗腹水，并进行倍比稀释，间接ELISA方法检测。
1．5．2特异性测定以SPF鸡胚尿囊液、禽流感病毒、禽传染性支气管炎病毒等包被96孔酶标板，间接ELISA鉴定各株单抗反应特异性。
1．5．3细胞中和活性测定采用细胞中和试验鉴定单抗中和活性，具体参见文献［6］。
1．5．4间接免疫荧光测定将200TCID50的SD03毒株接种CEF细胞单层，37ħ作用2h，更换含1%胎牛血清的DMEM，3d后做IFA检测，具体步骤参照文献［7］。
1．5．5Western－blot检测取1mL诱导表达的菌液，12000r/min离心2min，弃上清，加100μL 灭菌双蒸水，悬浮沉淀，加100μL上样缓冲液，煮沸5 10min。
取20μL/孔加样，进行SDS－221山东农业科学第49卷PAGE 电泳和电转印。
转印的膜经5%脱脂乳封闭后，加入1ʒ5000稀释的单抗腹水，37ħ轻摇作用1h ，洗涤后加入1ʒ4000稀释的HＲP 标记羊抗鼠IgG ，室温轻摇作用1h ，于暗室中加入ECL 发光液作用1min ，再转至暗盒中曝光5min 后进行显影与定影［7］。
1．5．6单抗亚型的鉴定用单克隆抗体分型试剂盒对4株杂交瘤细胞培养上清进行亚型鉴定，具体步骤参见试剂盒说明书，加入终止液终止反应后在450nm 处测定OD 值。
1．6单抗排谱试验挑选的24株NDV 分离株，测定血凝抑制价，配制相应的4单位病毒后与筛选出的有HI 活性的单克隆抗体分别进行HI 试验，以AIV 、IBV 、IB-DV 和EDSV 作为阴性对照［8］。