HLA-B27高分辨基因分型的临床解析
hla高分辨基因分型6位点
hla高分辨基因分型6位点
一般情况下，HLA高分辨基因分型通常包含多个位点，不仅
限于6位点。
HLA基因是一组高度多态性的基因，具有多个
位点，每个位点可以有多个等位基因。
在研究或临床实践中，通常会选择一系列位点进行HLA基因
的高分辨基因分型。
常见的HLA基因位点包括HLA-A、
HLA-B、HLA-C、HLA-DPB1、HLA-DRB1等。
高分辨基因
分型通常会采用各种分子生物学技术或测序技术来确定具体的等位基因。
例如，常见的技术包括聚合酶链反应（PCR）、序列特定引物扩增（SSP）、序列特定探针扩增（SSO）、序列
分析等。
需要注意的是，具体选择哪些位点和技术进行高分辨基因分型，可能因研究目的、实验条件和经济因素等而有所不同。
因此，HLA的高分辨基因分型通常是一个复杂且个性化的过程。
HLA-B27 PCR-SSP基因分型结果分析
HLA-B27 PCR-SSP基因分型结果分析
佚名
【期刊名称】《中国输血杂志》
【年(卷),期】2001(0)S1
【总页数】1页(P100-100)
【关键词】基因分型;结果分析;PCR;SSP
【正文语种】中文
【中图分类】R446.9
【相关文献】
1.CDMA和PCR-SSP方法对HLA-B27分型的探讨 [J], 王连友;李丹慧;曹红荣;孟现军;潘亚军
2.HLA-Ⅰ、Ⅱ类PCR-SSP基因分型与血清学抗原分型在移植配型中的比较应用[J], 吴晓冬;杨绍娟;崔亚南;卜丽莎
3.HLA-I类PCR-SSP基因分型在异基因造血干细胞移植中的应用 [J], 孙玉英;孔繁华;奚永志;刘楠;屠敏;金荔;陈兴国
4.HLA-B27 PCR-SSP基因分型及血清学结果比较 [J], 张祖文;兰炯采;郑世荣;孙启俊;柯苑;袁红
5.PCR-SSP基因分型技术检出HLA-B新等位基因B＊5516一例 [J], 陈强;王憬惺;孙水仙;邹海;徐晓红;陈宪辉;米新玉;陈雪黎;曾洁;赵桐茂
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HLA-B27检测及其临床应用详解
银屑病性关节炎
Reiter’s综合症 反应性关节炎 沙门氏菌感染 志贺氏菌感染
55
37 29.7 20.7
耶尔森氏菌感染
淋病双球菌感染 正常人群
17.6
14.0 2～7
3
血清阴性脊柱关节病（脊柱关节炎）
这是一组慢性炎症性风湿性疾病，具有特定的病理生理、临床、放射
学和遗传特征，炎性腰背痛伴或不伴外周关节炎，加之一定特征的关
节外表现是这类疾病特有的症状和体征。这一类疾病包括：强直性脊 柱炎(ankylosing spondylitis，AS)，反应性关节炎(reactive arthritis，ReA)，
银屑病关节炎(psoriatic arthritis，PsA)，炎症性肠病性关节炎(arthropathy
与革兰氏阴性杆菌有一定相关性：
5
血清阴性脊柱关节病共同特点
临床上有很多共同或重叠之处：
眼炎，尿道炎，前列腺炎， 口腔、肠道和生殖器溃疡 结节性红斑，银屑病样皮疹 坏死性脓皮病，血栓性静脉炎
基本病理变化以肌腱端周围和韧带附着于骨的部位为主(附着端炎)而
非滑膜，也可发生在眼、主动脉瓣、肺实质和皮肤，而不同于以滑膜 病变为主的类风湿性关节炎，而且无类风湿皮下结节。
强直性脊柱炎 地区分布 性别分布 种族差异大 男＞女 类风湿性关节炎 世界性 女＞男
年龄
家族史 类风湿因子
20-30
明显 （－）
30-50
不明显 （）
7
HLA-B27与AS
HLA-B27阴性的AS
约5-10%的AS患者为HLA-B27阴性 AS患者的HLA-B27阳性率达90-95% 我国汉族人群HLA-B27阳性率2-7%（3千万-1亿），AS患病 率为0.3%（＞4百万），大部分HLA-B27阳性者并不发生AS。
流式细胞仪检测HLA-B27及其临床意义
流式细胞仪检测HLA-B27及其临床意义目的通过流式细胞术对人体外周血HLA-B27的检测，来评价HLA-B27辅助临床诊断强直性脊柱炎（AS）的应用价值。
方法56例强直性脊柱炎患者和51例健康体检者，用荧光标记的抗HLA-B27/CD3单克隆抗体与其外周血（以EDTA-K2抗凝）特异性结合,用流式细胞仪检测其荧光强度来反映细胞表面HLA-B27抗原的表达。
结果从流式细胞术检测显示，56例AS患者中，HLA-B27阳性51例，阳性率为91.1%；51例健康体检者中，HLA-B27阳性3例，阳性率为5.9%。
两者存在显著性差异，P＜0.01。
结论AS患者HLA-B27阳性率明显高于正常人，所以检测HLA-B27对强直性脊柱炎的诊断与鉴别诊断有着重要的意义。
标签：流式细胞仪；强直性脊柱炎；HLA-B27B27是HLA-B27位点上的一个重要的等位基因，其与许多疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎；而且这种相关是迄今为止已知的HLA与疾病的关联中最强和最典型的。
目前，检测HLA-B27的主要方法有补体依赖性微量淋巴细胞毒试验、玫瑰花法、ELISA法、流式细胞术、PCR法等。
其中以标准的NIH微量细胞毒法最为常用，这种方法操作简便且准确性尚可，但是受细胞纯度、补体差异、单抗效价及HLA高度多态性的影响，易出现漏诊或假阳性(错判、误判)[1]。
现在我们用荧光标记的单克隆抗体与人类白细胞表面抗原HLA-B27结合，用流式细胞仪来检测其细胞表面的HLA-B27表达，现报告如下：1资料与方法1.1 一般资料1.1.1标本来源107例该院骨科门诊及住院确诊为AS的患者和健康体检者。
其中经临床检查和影像学检查符合AS的患者56例，男38例，女18例，年龄18~77岁。
健康体检者51例，男27例，女24例，年龄23~82岁。
取上述人员静脉血2ml，EDTA-K2抗凝。
1.1.2 试剂美国Becton Dickinson公司HLA-B27 kit: HLA-B27-FITC (Clone GS145.2，IgG1 kappa)；CD3-PE(CloneSK7，IgG1 kappa)；HLA-B27 Calibration Bead；溶血剂(Lysing solution．1ys S) 批号为340183，洗涤液及鞘液用Coulter Isoton II血细胞稀释液批号为8546733。
HLAB27检测及其临床应用详解
AS患病率 0.3% 1％ 很低
6～12％
AS患者B27阳性率 90～95% 80～100% 22% 57% 80～100%
8
HLA-B27检测方法及评价
➢ 抗原水平
微量细胞毒法 ELISA IMS-ELISA 流式细胞术法
➢ 基因水平
PCR-SSP
9
微量细胞毒法（microlymphocytotoxic test，MLCT）
4
血清阴性脊柱关节病共同特点
➢ 临床上有很多共同或重叠之处：
眼炎，尿道炎，前列腺炎， 口腔、肠道和生殖器溃疡 结节性红斑，银屑病样皮疹 坏死性脓皮病，血栓性静脉炎
➢ 基本病理变化以肌腱端周围和韧带附着于骨的部位为主(附着端炎)而
非滑膜，也可发生在眼、主动脉瓣、肺实质和皮肤，而不同于以滑膜 病变为主的类风湿性关节炎，而且无类风湿皮下结节。
5
HLA-B27相关疾病：强直性脊柱炎
Ankylosing Spondylitis，AS
➢ 患病率：0.3%，20-30岁，男女比例 10:1，有家族倾向； ➢ 主要侵犯：中轴关节（骶髂关节、脊柱骨突、脊柱旁软组织）
可伴发外周关节及关节外表现，严重者发生脊柱畸形和关节强直
➢ B27检测可作为有相关症状或高危人群AS早期的筛选方法！ ➢ AS不是RA的一种特殊类型！
12
流式细胞术法
➢ 利用荧光标记的HLA-B27单克隆抗体，与细胞表面的B27抗原结合，使
结合后的淋巴细胞具有一定的荧光强度，这种荧光强度可由流式细胞 仪测得的通道值来反映，以其值的高低判断HLA-B27抗原表达百分比 ，从而判断HLA-B27是否阳性。
➢ 优点：全自动仪器检测，减少了人为因素的影响，重复性高，结果判
HLA的分子生物学检测的临床分析
HLA的分子生物学检测的临床分析个体HLA遗传学差异的本质在于编码其抗原产物的基因上，所以分析个体HLA的基因型无疑是对HLA型别分析的最准确的方法，其准确性远高于血清学与细胞学分型。
自1996年第12届国际组织相容性研讨会后，以DNA为基础的HLA基因分型技术日趋成熟，并逐渐取代血清学方法。
DNA分型方法需要的血样少，样本可长期保存，相应的分型试剂可大量制备，来源不受限制。
特别重要的是DNA分型精确可靠，重复性好，其分型错误率远低于血清学方法。
DNA分型技术已在实际工作中得到了广泛的应用。
HLA基因分型中，一般将检测到“*”后第2位称为低分辨分型或抗原分解物水平分型。
检测到“*”后第4到第8位，叫高分辨分型或等位基因水平分型。
介于高低之间的为中间分辨分型。
HLA的DNA分型方法目前有多种，基本上可分为两种类型：一类是以鉴别HLA基因序列不同为基础的HLA分型技术，另一类基于不同HLA等位基因在聚丙烯酰胺凝胶电泳中具有不同的构象而设计的[1]。
2. HLA的分子生物学检测方法2.1 PCR指纹技术1991年召开的国际组织相容性专题研讨会上，PCR指纹技术被正式列为HLA基因型别鉴定方法之一。
这一技术是基于在特异性扩增DNA最后一个循环阶段的退火期，其单链DNA 除形成同一个体的完全互补的同质双链外，某些单链DNA还可以与不同个体的单链DNA形成不完全的互补异质双链，不同个体有不同分子构象，在非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈现特异的电泳图谱，这些电泳图谱称为PCR指纹。
PCR指纹技术可以像混合淋巴细胞培养方法一样，无需知道供受体确切型别或等位基因特异性，即可通过PCR扩增后，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中直接判断供受体相应基因相容性。
耗时较短，也无需使用探针、限制性核酸内切酶、同位素等，具有快速、简便、经济、直接等优点。
本方法无法确切指定HLA的等位基因型别，目前仅作为器官移植配型的补充技术[2]。
2.2 PCR单链构象多态性该方法是指在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，单链DNA形成一定的空间结构，具有一定的构象。
HLA-B27高分辨基因分型的临床
HLA-B27与JRA致病机制的研究 与 致病机制的研究
以各种感染性微生物作为外来抗原（HLA-B27分子与其结构 有相似性），激活免疫细胞，通过损伤或分泌细胞因子触 发异常的免疫反应，引起自身组织的损害和变性。 特别是细菌、病毒的特殊成分作为超抗原，其结构与人类 MHC抗原有同源性，不需抗原呈递细胞加工处理，即可直接 与T细胞受体直接结合（HLA-B27充当细胞表面受体），激 活T细胞。
HLA I类分子是在内质网成熟的，新合成的HLA Iα进入内质网腔 与钙连蛋白结合，使I类分子在内质网中维持部分折叠，继而与新 合成的β2-微球蛋白组装成完整的I类分子，此时B27分子才能被认 为是成熟的，转运至细胞表面。研究发现，HLA-B27折叠速度较其他 HLA分子（非HLA-B27分子）慢。导致内质网腔中出现大量的折叠不 良或部分折叠的HLA-B27重链部分，通常情况下，非折叠的重链在内 质网腔内能够被清除，但由于一些相关物质的缺乏或无效，所致非折 叠的重链堆积，形成了非折叠蛋白反应。有资料报道，AS的发生可能 与这些HLA-B27分子的未折叠有关。
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强直性脊柱炎（AS） 强直性脊柱炎（AS）
1973年Brewerton和schiosstein发现 强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis AS）与HLA-B27抗原有 非常强的相关,这是目前唯一有临床 价值的血型相关抗原,这在迄今已知 的HLA与疾病的关联中是最强和最典 型的。
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其它疾病
【Genetic markers linked to rheumatoid arthritis are also strongly associated with articular manifestations in ulcerative colitis patients】 【Flt3一ITD mutations can generate leukaemia specific neoepitopes： potential role for immunotherapeutic approaches】 【Ankylosing spondylitis is linked to Klebsiella—the evidence】 等三篇文献报道：HLA-B27抗原与白塞氏病也 等三篇文献报道： 有一定的相关性。
HLA_B_27高分辨等位基因在_省略_6例疑似强直性脊柱炎患者中的表达_肖露露
第36卷第4期广州医学院学报Vol.36No.4 2008年8月ACADEMIC JOURNAL OF GUANGZHOU MEDICAL COLLEGE Aug.2008基金项目：国家自然科学基金资助项目（30278367）。
作者简介：肖露露（1954.4-），女，教授，本科。
研究方向：移植免疫和输血免疫。
*通讯作者：Tel：020⁃61641721，E⁃mail：dadijin@ ·论著·HLA⁃B*27高分辨等位基因在1606例疑似强直性脊柱炎患者中的表达肖露露1罗敏1郭伟1张泓1阴继霞1张彦1张志梅1张忠民2金大地2*（1南方医科大学南方医院组织配型实验中心，广东广州510515；2南方医科大学南方医院脊柱骨科，广东广州510515）摘要目的：探讨HLA⁃B*27高分辨等位基因分析对强直性脊柱炎（AS）诊断和鉴别诊断的临床应用价值。
方法：采用PCR⁃SSP和PCR⁃SBT技术对2004年1月⁃2008年3月本院收治的广东地区1606例骨和关节疾病（OAP）患者（其中确诊AS患者1022例）进行了HLA⁃B*27低分辨和HLA⁃B*27高分辨的基因频率调查和分析。
结果：OAP患者中B*27高分辨基因频率（70.50%，141/200）高于B*27低分辨基因频率(41.82%，588/1406)(P<0.001）；1022例AS患者中高分辨的B*27基因频率（84.21%，121/133）也高于B*27低分辨基因频率(44.77%，398/889)（P<0.001）。
HLA⁃B*27阳性患者表达出的HLA⁃B*27等位基因为B*2704占88.44%（459/519），B*2705占9.83%（51/519），B*2702占1.73%（9/519）。
结论：高分辨技术能够准确检测HLA⁃B*27阳性患者，AS患者在不同地区或人群所表现出的HLA⁃B*27易感基因不同；应用高分辨技术进行HLA⁃B*27等位基因分型，将有益于提高AS早期诊断和鉴别诊断，发挥对AS预后预测和治疗选择的临床应用价值。
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HLA-B27抗原分子结构
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α 1区与α 2区的肽链折叠后共同构成一个抗原 结合凹槽，槽内形成A,B,C,D,E,F共6个袋状结 构，其中B袋在HLA-B27分子中是最保守的结构。 凹槽的作用是结合抗原肽，使抗原肽与HLA-B27 分子牢固的结合。
HLA-B27高分辨基因分型 的临床应用
天津秀鹏生物技术有限公司
1
HLA-B27分子及其等位基因
2
与HLA-B27相关的疾病
3
HLA-B27检测方法
4
本公司试剂盒简介
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1.HLA-B27抗原分子及其等位基因
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HLA-B27抗原分子结构及其特点
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强直性脊柱炎（AS）
1973年Brewerton和schiosstein发现 强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis AS）与HLA-B27抗原有 非常强的相关,这是目前唯一有临床 价值的血型相关抗原,这在迄今已知 的HLA与疾病的关联中是最强和最典 型的。
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HLA-B*2705基因分布最广，几乎见于所有人种。 甚至认为其它等位基因都是由HLA-B*2705基因发 生突变、移位形成的。 HLA-B*2705编码的蛋白最为显著的特点就是在B袋 上的45位发生氨基酸的突变，这一改变直接影响 HLA-B27分子在细胞表面的表达，影响HLA-B27分 子与抗原肽的结合，同时影响了HLA-B27分子对胞 内外抗原的递呈。
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HLA-B*27等位基因结构及其特点
2002年WHO正式命名的HLA—B*27 等位基因达到了24个，其中只有15个 有相对应的抗原表达。到2009年11月 WHO正式命名HLA—B*27等位基因 达到59个(B*2701一B*2759) 。 HLA—B*27等位基因呈多态性，主要 是因为个别的碱基突变造成的，编码蛋 白的差异主要集中在αl、α2结构区内。
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2.与HLA-B27相关的疾病
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强直性脊柱炎 （ankylosing spondylitis AS） 幼年类风湿关节炎 （juvenile rheumatoid arthritis JRA) 急性前葡萄膜炎 (acute anterior uveitis，AAU) 白血病等疾病
HLA-B27抗原分子是由位于人类第六号染色 体短臂上B*27等位基因编码的糖蛋白, 分子量 为56×103U。 由两条多肽链组成，一条为α链或重链，分子 量约为44×103U，包括胞外区，跨膜区，胞 内区三个结构域，其中胞外区又分为α 1，α 2， α 3三个结构区；另一条为β链或ห้องสมุดไป่ตู้链即β 2微 球蛋白，分子量约12×103U，二者结合共同 组成HLA-B27抗原分子。
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HLA-B27分子游离重链与AS
HLA-B27分子的主要功能是：识别和处理抗原肽，然后在 递呈给T淋巴细胞。HLA-B27分子具有特殊的生物学效应， 它在体外具有形成重链二聚体的能力，主要是通过B27分 子第67位氨基酸的残基半氨酸的二硫键结合形成稳定的二 聚体。通过认识HLA-B27分子结构的特异性，重要的是深 入研究游离重链的表达是否应该认为是导致AS的发病原因 之一。当HLA-B27分子适当的、正确的组装时，其递呈的 抗原肽通常被CD8 CTL识别；但当AS发生时，限制性的 CIM Th细胞却能识别非折叠、空载或缺失的B27分子。在 这种情况下，就是HLA II类分子递呈B27重链，降解后形 成的多肽被CD4 Th细胞识别后导致关节炎症。此研究目 前还存在争议。
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其中HLA-B*2701与HLA-B*2705编码的蛋白 在78-81范围内有2个氨基酸的不同； 其中HLA-B*2702与HLA-B*2705编码的蛋白 在78-81范围内有3个氨基酸的不同； 其中HLA-B*2703与HLA-B*2705编码的蛋白 仅有1个氨基酸的差别，即在59位前者 为组氨酸（His），后者为酪氨酸（Tyr）；
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HLA-B27与AS致病机制的研究
HLA-B27分子与非折叠蛋白理论假说 HLA-B27分子游离重链与AS 其它
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HLA-B27分子非折叠蛋白理论假说
HLA I类分子是在内质网成熟的，新合成的HLA Iα进入内质网腔 与钙连蛋白结合，使I类分子在内质网中维持部分折叠，继而与新 合成的β2-微球蛋白组装成完整的I类分子，此时B27分子才能被认 为是成熟的，转运至细胞表面。研究发现，HLA-B27折叠速度较其他 HLA分子（非HLA-B27分子）慢。导致内质网腔中出现大量的折叠不 良或部分折叠的HLA-B27重链部分，通常情况下，非折叠的重链在内 质网腔内能够被清除，但由于一些相关物质的缺乏或无效，所致非折 叠的重链堆积，形成了非折叠蛋白反应。有资料报道，AS的发生可能 与这些HLA-B27分子的未折叠有关。
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AS的抗原学检测
【HLA-B27与强直性脊柱炎的临床分析】报 道：HLA-B27抗原阳性率在AS患者高达96％ 以上，而正常群体中仅4%-7%,HLA-B27抗原 携带者发生AS的相对危险率高达70%。
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与AS相关的B*27等位基因
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AS的基因学检测
不同人群的AS患者涉及的B*27等位基因
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与AS相关的B*27等位基因
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不同人群AS患者的HLA-B*27等位基因频率
摘自【HLA—B*27高分辨等位基因在1 606例疑似强直性脊柱炎患者中的表达】