高分辨熔解曲线
SNP技术及发展和应用

谢
谢!
基本步骤
第1步:1个特异性的测序引物和单链DNA模板 结合,然后加入酶混合物(包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase 和Apyrase)和底物混合物(包括APS和 Luciferin)。
• 第2步:向反应体系中加入1种dNTP, 如果它刚好能和DNA模板的下一个碱 基配对,则会在DNA 聚合酶的作用 下,添加到测序引物的3‘末端,同 时释放出一个分子的焦磷(PPi)。
HRM的主要原理是根据DNA序列的长度,GC 含量以及碱基互补性差异,应用高分辨率的熔 解曲线对样品进行分析,极高的温度均一性和 温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的 区分 序列比对---引物设计--- DNA提取---荧光染料 (EvaGreen 或LC green)PCR ---结果分析。
• 第3步:在ATP硫酸化酶的作用下,生成 的PPi可以和APS结合形成ATP;在荧光 素酶的催化下,生成的ATP又可以和荧 光素结合形成氧化荧光素,同时产生可 见光。通过CCD光学系统即可获得一个 特异的检测峰,峰值的高低则和相匹配 的碱基数成正比。
• 第4步:反应体系中剩余的dNTP和残留的 少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。
SNP与耐药性
随着抗生素的广泛应用,耐药现象普遍发生, 院内感染发生率高,这为临床抗感染治疗带来 了极大的困惑,比如结核菌耐药现象、由于细 菌产生超广谱p.内酰胺酶(EsBLs)而对第三代 p内酰胺类抗生素的耐药现象。通过SNP方法, 可筛选到耐药基因,然后进行针对性的用药, 并由此开发出相应的新药,这对于提高疗效和 控制其耐药性的发展有重要意义。
焦磷酸测序法 (Pyrosequencinq )
【江苏省自然科学基金】_温度曲线_期刊发文热词逐年推荐_20140815

科研热词 推荐指数 反应堆压力容器 2 黄瓜 1 高灵敏度 1 高分辨熔解曲线分析 1 非调质钢 1 辐照脆化 1 辐热积 1 转染 1 试验 1 虫种鉴别 1 荧光定量pcr 1 色散 1 肠癌 1 综合数字滤波 1 管状阴极 1 磨削强化温度 1 瞬态失效机理 1 疟原虫子孢子 1 电池性能 1 热光系数 1 温度补偿 1 温度 1 水温控制 1 横向双扩散金属氧化物半导体器件1 模糊pid控制 1 模型 1 无线传感器网络 1 数据精简算法 1 数据插值 1 数值仿真 1 按蚊 1 急性髓细胞白血病 1 强化机理 1 强化效果 1 弓形梁 1 异型直接乙醇燃料电池 1 幼苗 1 壮苗指标 1 基因突变 1 回归分析 1 可溶性异柠檬酸脱氢酶2 1 双折射 1 压力温度限值曲线 1 功率密度 1 冷却速度 1 偶氮聚氨酯 1 toll样受体4 1 sw480细胞株 1 sirna 1 rccm规范 1 pt-sno2/c电催化剂 1 plc 1
推荐指数 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2011年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
推荐指数 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2014年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
PCR_CTPP_一种基于错配技术的SNP分型方法的改良_王柯

收稿日期 : 201008; 修回日期 : 20101005 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( 编号: 30872181, 81072360), 河南省高校科技创新人才支持计划 ( 编号: 2010HASTIT027) 和河南医学科技 攻关项目 (编号: 200903009)资助 作者简介 : 王柯 , 硕士研究生 , 专业方向:遗传学。 E-mail: wangke201984@ 通讯作者 : 代丽萍 , 教授 , 博士 , 研究方向:肿瘤流行病学。 Tel: 0371-67781454; E-mail: lpdai@
Abstract: To explore the technique principle of PCR with confronting two-pair primers (PCR-CTPP) and improve the accuracy of SNP genotyping by taking the 1298 locus of human gene MTHFR as an example, the reliability between conventional PCR-CTPP and improved PCR-CTPP was compared using reconstructed PCR-CTPP detecting system in terms of designing appropriate primers and optimizing annealing temperature and the final concentration of primers. The improved PCR-CTPP detection system proved to be more accurate, which supported the viewpoint on the theoretical defects of conventional PCR-CTPP. The large-scale study verified the reliability of the improved method. It is expected that this improved technique would be widely used in the field of medicine and molecular biology.
IlluminaEco荧光定量PCR讲课文档

Plate Layout
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Standard Curve
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Relative Quantification
用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序列 表达的相对变化。校正样本可以是一个未经处理的对照或者 是在一个过程研究中处于零时的样本。
DEL
TT
AA
Genotyping 5 distinct clusters observed
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产品优势
开放的平台:支持实时PCR的全部应用,包括最具挑战性的高分辨熔解(HRM
)曲线分析
性能卓越:灵敏的精密控制的光学技术;精准的温度控制技术和极佳的温度 均一性;Cq值重复性高,数据准确性高,
仪器20分钟左右开启,预热。 配制PCR体系时,加样一定要准确 加每个样品一定要更换枪头,防止交叉污染 样品板上的膜一定要封好 样品上机之前一定要离心,避免气泡影响实验结果
第26页,共38页。
问题……?
谢谢!
第27页,共38页。
厂家简介
Illumina公司是一家集开发,制造及销售用于分析遗传变异 和生物功能的综合系统的高科技公司。1998年成立,2005 年进入中国,并以惊人的速度不断发展,于2007和2009年 两次入选福布斯杂志评出的美国年度成长速度最快的高科技 公司,同时亚太地区也是Illumina全球增长最快的区域。
,通过饱和的插入染料监控DNA熔解曲线变化而进行分析的一种技术。
扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。只要一个碱基发生了突变, 就会改变DNA链的解链温度。HRM可以区分单碱基差异。
HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限,无需使用序列特异性探针,具有高灵 敏度、操作简单、高通量、成本低等优点
ICP-MS百问解答

ICP-MS百问解答一、请教各位检测比如检测完高浓度的Al中的杂质元素后,在做其它种类样品中的AL元素,除了更换炬管外,雾化器是否需更换?另外清洗时间大概要多久?有无其它办法?那具体要看你的高纯度AL是怎么做的了,如果基体很高,那么记忆效应就很强烈,炬管,舞化器,都要换,离子透镜什么的可能也要洗洗,清洗时间和你的仪器有关系,交叉的比同心的洗的时间要更长。
二、我知道AMU表示峰宽和峰宽有关,可它是峰宽的单位吗?中文是什么?峰宽的单位是原子质量单位三、请问在使用ICP-MS做元素分析时,内标元素的浓度如何确定。
一个样品中某元素要求定量分析,我们先做了一个全扫描的定量分析,发现样品中要求分析的元素含量很高,比如1000ppm,此时我们做定量分析时内标用10ppb这样低的浓度可以吗?1. 浓度应该没有硬性规定吧,但是不能太小,如果浓度太小,本身仪器的本底以及其他元素的干扰就会明显。
这样在校准别的数据就不准确了。
10ppb如何2. 内标主要用来校正仪器的漂移。
如果其它元素对内标基本上没有同质量的干扰,我想浓度差一些没什么问题。
其次,ICP-MS做痕量分析用,测量的元素浓度是有限度的,PPM级以上用其它仪器能更方便的测定。
3. 我们实验室配制的多元素标准液为1ppb, 添加之内标浓度为0.5ppb。
若待测物浓度太高可先将待测物稀释至适当浓度再添加内标进行分析, 但如果稀释倍数太高, 似乎添加内标就无意义4. 仪器检测的试样浓度是有限制的,太高了需要稀释。
内标我做是比检测限大,比推荐值小,只要没有什么明显的干扰就用了。
5. 加内标的浓度由仪器的内标读数的精密度决定。
四、请问ICP-MS选择是以质量数接近较好呢,还是以电离能接近较好?或者以其它做为选择依据?我用Sc做内标,发现在食品基体中,Sc的计数变化非常大,是否有多原子干扰?1. 应该选择质量数接近的吧2. 内标主要是为了检测信号随试验条件的变化而加入的。
整合高分辨熔解曲线和Sanger测序的MTHFR基因C677T多态性检测新方法及其应用

整合高分辨熔解曲线和Sanger测序的MTHFR基因C677T多态性检测新方法及其应用王榕;白慧丽;程伟;张玉洪【摘要】目的建立一种基于整合优化的高分辨熔解曲线(HRM)和Sanger测序的分子诊断新方法,并探索其亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T多态性(rs1801133)检测应用.方法针对MTHFR基因C677T设计一对带有M13接头的通用引物,通过优化HRM反应体系,提高HRM的分析性能;并利用M13接头作为测序引物直接对HRM产物进行Sanger测序验证.收集该院体检中心的外周血标本1 030份,应用所建立的新方法检测标本MTHFR基因C677T多态性.结果成功建立了基于整合优化的HRM和Sanger测序的新方法,并成功应用于临床标本MTHFR基因C677T多态性检测.1 030份标本中,CC基因型占39.13%,CT基因型占48.16%,TT基因型占12.71%.结论本研究成功建立了一种检测MTHFR基因C677T的新方法,该方法具有简便经济、快速准确和高通量的特点,适用于临床大规模检测.【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2019(048)001【总页数】3页(P161-163)【关键词】高分辨熔解曲线;亚甲基四氢叶酸还原酶(NADPH);多态性,单核苷酸;Sanger测序【作者】王榕;白慧丽;程伟;张玉洪【作者单位】重庆医科大学附属第一医院检验科 400016;重庆医科大学附属第一医院临床分子医学检测中心 400016;重庆医科大学附属第一医院临床分子医学检测中心 400016;重庆医科大学附属第一医院检验科 400016【正文语种】中文【中图分类】R446.9亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是人体叶酸代谢的关键酶,C677T是MTHFR基因最常见的多态性,会导致酶活性差异,影响机体叶酸代谢[1]。
QuantS studio3说明书

QuantS studio3说明书
热循环系统:珀耳帖效应系统
精确数码温控模块:3个独立的精确数码温控区域,既可以完成梯度PCR又可以同时设置3个不同的实验,优于传统的梯度PCR功能0.2ml模块型号同时支持标准和快速运行模式。
光学系统:高亮度白光半导体光源(工作寿命大于5年)
荧光通道数:4色激发光通道和4色检测光通道,可以同时检测4种目标基因。
反应体积:0.2ml模块型号:10-100uL;
支持耗材:0.2ml模块型号:常规96孔(0.2ML)反应板与光学盖膜;8连管(0.2mL)条带与光学平盖单管(0.2mL)与光学平盖温控模块最高升降温速率:6.4°每秒
温度范围:5°C到100°C
高分辨熔解曲线分辨率:小至0.02°C
支持HRM应用数据同时采集:所有反应孔同时采集荧光数据,不同孔之间不存在时间差被动参照染料:软件支持荧光校正去除移液误差内置互动触摸屏
支持云端服务器,可以用网络打开浏览器,使用云端服务器查看,分析,共享数据云端服务器支持10GB的免费存储空间。
PCR仪技术参数确认表

1.3
特殊功能需求
2
主要技术参数
2.1
★参数1
可从患者组织样本里同时检测结核分枝杆菌复合物(MTB complex)和利福平耐药基因(rpoB)
2.2
★参数2
在一个检测试剂盒中,可自动完成样品制备、纯化、基因提取、核酸扩增、荧光测定的全过程。
2.3
2.10
参数10
可以对双探针的SNPs研究提供散点图在内的完整的SNPs位点分析报告。
2.11
参数11
不依赖于计算机运行,电脑死机后仪器仍然能够按照已编程序正常运行,并导出实验数据,不需要重新做实验。
2.12
参数12
软件可在数秒内完成数据t-检验和方差统计学分析
2.13
参数13
可设置多变量实验及重复,实现1000个以上样品的同时分析,简化参考基因筛选。
提供耗材及主要零配件目录(含报价)
4.5
维修资料
提供详细操作手册、维修保养手册、安装手册等
4.6
维修工具
提供维修专用工具1套
4.7
预防性维修
/定期维护保养
保修期内提供定期维护保养服务
4.8
维修密码支持
开放
4.9
升级
终身免费软件升级
4.10
技术培训
支持
4.11
工程师培训
支持
3.梯度PCR仪技术参数确认表
终身免费软件升级
4.10
使用培训
支持
4.11
工程师培训
支持
4.荧光定量PCR仪技术参数确认表
序号
技术和性能参数名称
技术参数和性能要求
备注
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高分辨熔解曲线(high-resolution melt,HRM)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。
它是一种高效稳健的PCR 技术,不受突变碱基位点与类型局限,无需序列特异性探针,在PCR 结束后直接运行高分辨熔解,即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP 、甲基化、配型等的分析。
因操作简便快速,使用成本低,结果准确,实现了真正的闭管操作,HRM技术受到普遍关注。
HRM 原理
HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度,GC 含量以及碱基互补性差异,应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析,其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。
同许多荧光 PCR 技术一样,HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性,通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线,从而对样品进行检测。
如在SNP 的检测中,SNP 位点由于不匹配双链DNA 在升温过程中会先解开,荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放,从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP,而且不同SNP 位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形,因此HRM 分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。
随着高精度PCR 仪(LightCycler 480 和Rotor-Gene 6000)和饱和性染料(LC Green 、Eva Green 等)的出现为HRM 这一技术的普及使用成为可能。
HRM 特点
由于HRM 完全是基于核酸的物理性质进行分析,因而无需序列特异性探针。
基于这种检测原理,HRM 检测不受突变碱基位点和种类的局限,既可以对未知突变进行筛查、扫描,又可以对已知突变进行分析,亦可用于短片段重复序列的分析,所需要的只是在常规 PCR 基础上增加一个饱和染料。
所以,相比传统的SNP 或突变分析法和定量探针法,简化了操作时间和步骤,大大降低了使用成本,并且实现了闭管操作,使其用于临床常规化检测成为可能。
高分辨率熔解曲线分析可以鉴别出PCR 产物中杂合的单碱基突变
这种方法比起普通的技术来说有更好的灵敏性和特异性。
采用这种方法进行的突变的检测不依赖于突变在片段中所在的位置。
当片段的大小在400 bp 或者更小时,灵敏性最高。
除了能鉴定出未知的杂合突变,高分辨率熔解曲线还可以被用来鉴定特定位点的突变,在这种情况下,扫描未知突变和进行基因分型可以结合在一起,使得分析更为简单。
对于目前绝大多数的突变分析方法来说,都很难鉴定出纯合子序列突变。
在一些不同种类的小的扩增片段中,高分辨率熔解曲线则显示出了鉴定纯合子序列突变的能力,这种方法能鉴定出大多数的纯合突变。
HRM 技术在遗传学研究方面也带来很大便利,只需在PCR 反应体系中加入双链DNA 饱和荧光染料,在PCR 反应之后再花15 分钟,就可以完成96 或384 个样品的DNA 变异扫描。
HRM 在这些方面的优势使其具有极强的可操作性,成为近年来国外新兴的遗传学、方法学研究和应用热点。
HRM 技术优势
高通量:1 次可同时检测10-384 样本。
高敏度:HRM 检测灵敏度达1%-0.1% ,是传统“PCR+ 测序”方法25-250 倍。
特异性好:PCR 产物无需后续处理,特异性达100%。
重复性好:用HRM 方法进行分析时,样品经PCR 扩增后直接进行HRM,PCR 产物无需再转入其它分析装置,而直接在同一个PCR 管内进行分析,实现闭管操作,避免交叉污染。
操作简便:只需设计PCR 引物,进行PCR 反应,无需序列特异性探针,无需测序,也不受突变碱基位点与类型的局限,在Roche LlightCyclerTM 480 荧光定量PCR 仪器上直接获得高分辨率熔解曲线分析,即可完成对样品基因型的判断。
成本低:相比传统的SNP/突变分析法和定量探针法,简化了操作时间和步骤,大大降低了使用成本,并且拓展了其应用面。
适用范围广:可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手术标本,也可用于微量的穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本等非手术标本的检测。
传统“PCR+测序”方法难以检测大部分不能手术的患者。
其它:只检测PCR 样品中荧光强度的变化,不消耗任何PCR 样品,无污染,PCR 产物可以进行下游分析。
HRM 技术不损伤DNA ,分析之后可以直接纯化测序,这使得它非常适合于测序前的SNP 预扫描筛查。
HRM 的应用
1、基因的突变扫描:检测杂合子SNP、区段/碱基缺失、前后重复、杂合子缺失相关研究方向:样本中特定突变位点(SNP)的筛查;疾病相关基因(癌基因)特定区段突变位点的扫描,新突变的发现;遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现;植物抗逆性,突变与性状关联性的研究;动植物品质相关多态性位点的研究等。
2、基因组配型:器官移植的HLA 配型、同胞之间HLA 基因型确定应用举例:快速确定HLA 高度多态性位点的类型,及非亲源关系个体间异源造血干细胞移植前的HLA 基因型确认。
3、等位基因频率分析:SNP 频率分析等
4、物种鉴定、品种鉴定:微生物品种、物种快速鉴定;动植物品种鉴定应用举例:临床细菌的鉴定。
对临床细菌的培养物进行16SrRNA 的实时扩增,并进行HRM 分析,每个菌种的熔解曲线模式就如果该物种的分子指纹,从而可以根据HRM 的不同对细菌进行鉴定。
5、甲基化研究:甲基化位点的筛查;甲基化程度分析应用举例:用HRM 方法检测MGMT 启动子区域内的甲基化,可检测低达0.1% 的甲基化程度;并根据已知
甲基化程度的标准曲线对未知样品的甲基化百分比进行测定。
HRM 是一种高灵敏度的甲基化检测方法,并且其高度的重复性和低成本将对肿瘤的研究和临床应用有很大帮助。
6、法医学鉴定、亲子鉴定:检测单核苷酸多态性SNP 鉴定,插入/缺失多态性DIP 鉴定等应用举例:将HRM 用于法医学SNP、DIP 鉴定,协助犯罪鉴定,亲子鉴定。
相对于传统鉴定方法,HRM 是一种简单、便宜、高通量的二等位基因分子标记鉴定的方法。