高分辨率溶解曲线HRM
高分辨率溶解曲线简介资料
高分辨率溶解曲线简介(2011-09-01 11:30:50)转载▼标签：杂谈高分辨率熔解曲线分析技术（ High Resolution Melting ），简称 HRM ，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。
HRM 技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。
其中，主要的研究方向集中在： 1 、基因未知突变以及 SNP 的扫描； 2、已知突变及 SNP 的基因分型； 3、动植物、微生物等物种的物种鉴定以及品种鉴定； 4 、法医鉴定、亲子鉴定； 5 、HLA 的配型； 6 、甲基化的研究等。
一、HRM技术的基本原理：HRM 技术主要是基于核酸分子物理性质的不同。
不同核酸分子的片段长短、 GC 含量、 GC 分布等是不同的，因此任何双链 DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。
HRM 技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。
以二倍体细胞为例，当纯和子样品通过 PCR 扩增，经过变性复性后，仍然是纯合子，如图一 A 。
而杂合子 PCR 扩增完，经过变性复性后，样品中会形成部分的含有非沃森 - 克里克配对的双链分子存在。
图一： A ：纯合子样品 B ：杂合子样品如图一 B 所示，杂合子样品扩增后，经变性复性，会有非配对碱基的形成，而纯合子样品没有。
这样，杂合子样品相对纯合子样品来说，双链不够稳定，表现在解链温度上就会有微小的差别。
如果采用高分辨率的仪器进行检测，并用专门的软件进行分析，微小的差别就会被检测出来，从而成功的筛选出纯合子与杂合子。
下图是杂合子样品熔解曲线的的示意图：图二：杂合子样品的熔解曲线为四种不同双链的熔解曲线的叠加的结果。
以二倍体细胞为例，杂合子扩增后通过变性复性会形成二种同源双链和两种异源双链的混合物，在熔解过程中四种链会形成一条独特的溶解曲线，从而与纯合子的熔解曲线区分出来。
高分辨率溶解曲线
北京泰格瑞分子检验有限公司高分辨率熔解曲线高分辨率熔解（High-resolution melting，简称HRM）分析的主要原理是由于DNA序列的片段长短，GC含量、分布以及碱基互补性差异等的不同，在DNA 分子热变性时会使溶解曲线的形状和位置有所不同。
同许多荧光PCR技术一样，HRM 利用特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测温度变化过程中双链DNA 荧光染料与PCR扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测, 可以迅速的检测出核酸片段中 GC 含量和单碱基的突变。
高精度PCR 仪及饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现使HRM得到广泛的普及和应用。
项目：已知SNP位点检测；外显子突变位点筛查；物种鉴定、品种鉴定；甲基化研究；法医学鉴定、亲子鉴定。
样本要求：新鲜或异硫氰酸胍保存的细胞(﹥5×106)、组织(﹥50mg)、血液(﹥300μl)等样本原材料，或纯化好的DNA(OD260/OD280在 1.7-1.9之间)、总RNA(OD260/OD280在1.9-2.1之间，完整性好)，或反转录好的cDNA不少于30μl(纯度在1.9-2.1之间，及反转录好的cRNA完整性好)。
技术优势：高通量：1 次可同时检测多个样本。
高敏度：HRM 检测灵敏度达1%-0.1% ，是传统“PCR+ 测序”方法25-250 倍。
特异性好：PCR 产物无需后续处理，特异性强。
重复性好：样品经PCR 扩增后直接进行HRM，直接在同一个PCR 管内进行分析，实现闭管操作，避免交叉污染。
操作简便：只需设计PCR 引物，进行PCR 反应，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限。
成本低：相比传统的SNP/突变分析法和定量探针法，简化了操作步骤，缩短了实验时间，大大降低了使用成本。
高分辨熔解曲线分析技术临床应用研究进展
多症。李闪等［４］研究发现软骨发育不全与ＦＧＦＲ３
１ 高分辨熔解曲线分析技术概况
基因Ｇｌｙ３８０Ａｒｇ突变有关，软骨发育不良与ＦＧＦＲ３
Ｕｔａｈ大学的Ｗｉｔｔｗｅｒ实验室和Ｉｄａｈｏ公司在 基因Ａｓｎ５４０Ｌｙｓ突变有关，并针对两组基因突变建
１９９７年首次提出ＰＣＲ联合熔解曲线，由荧光信号 立了ＨＲＭ技术的快速筛查方法。角膜炎－鱼鳞病
监测扩增产物熔解曲线变化的新兴核酸分析技 带－３蛋白缺陷，何本进等［３］研究表明高效、准确、
术［１］。高分辨熔解曲线分析技术已经应用到临床的 低成本的分子诊断方法ＨＲＭ可以对ＳＬＣ４Ａ１基因
各个领域，对遗传病、肿瘤的诊断和细菌的鉴定及药 进行突变筛查，从而辅助诊断遗传性球形红细胞增
敏试验、药物的鉴定等发挥了重要作用。
有快速简便、成本低、灵活性高、敏感性高、特异性 关，叶军等［９］证实了ＭＥＤ１２基因突变与子宫肌瘤
高、闭管操作等优点。
有关，这两种基因突变都可以采用ＨＲＭ技术进行
２ 高分辨熔解曲线分析技术临床应用
检测，可用于高危人群的健康筛查和风险评估，为广
２．１ 遗传病
大妇女同志带来福音。ＨＲＭ技术在非小细胞肺癌
变化实时监控ＰＣＲ产物的技术，随后几年此方法不 －耳聋综合征的ＧＪＢ２基因［５］、原发性肥大性骨关
断改进，经历了ＨＲ－１，ＬｉｇｈｔＳｃａｎｎｅｒ和Ｒｏｔｏｒ－ 节病的ＨＰＧＤ基因［６］、原发性局限性皮肤淀粉样变
Ｇｅｎｅ６０００等，期间也不断有其他公司研制出用于 的ＯＳＭＲ基因［７］等都可以采用ＨＲＭ作为筛查方
Ｓｙｔｏ９，ＥｖａＧｒｅｅｎｓ等，不同染料对分析结果影响很 产生严重后果，因此肿瘤患者的早期诊断和治疗就
大，有的染料不适用于杂合子变异检测，有的不适用 显得尤为重要。乳腺癌和子宫肌瘤是困扰女性的两
hrm高分辨率溶解曲线实验流程
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高分辨率熔解HRM的应用前景
高分辨率熔解HRM的应用前景星期一, 三月1st, 2010 | HRM技术 | 苏州为真生物| 浏览:118摘要：高分辨率熔解（High-resolution melting，简称HRM）分析是一门新兴的技术。
它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、基因分型和甲基化分析等多个方面。
凭借其速度和简便性，高分辨率熔解这种方法正在迅速普及。
高分辨率熔解（High-resolution melting，简称HRM）分析是一门新兴的技术。
它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、序列配对和基因分型等多个方面。
凭借其速度和简便性，高分辨率熔解这种方法正在迅速普及。
其实双链DNA的熔解分析可追溯到上世纪六十年代，当时是通过紫外吸收来监测的。
分析需要几微克的DNA，而样品以0.1-1.0°C/分钟的速率缓慢加热，常常要花上几个小时才能完成。
后来，LightCycler定量PCR仪的出现，让荧光熔解分析变得流行。
样品量因毛细管而缩减至纳克级，且熔解速率更快，达0.1-1.0°C/秒，这样熔解时间缩短至几分钟。
当时使用的染料是SYBR® Green I。
然而，这种熔解分析只能区分在片段大小和GC含量上差别较显著的DNA序列，比如检查PCR扩增产物中是否存在引物二聚体及其他非特异性的扩增。
如果要区分SNP，分辨率还不够。
为什么呢？这里有必要先介绍一下饱和染料和非饱和染料。
SYBR Green I就属于非饱和性染料，由于它对PCR的抑制作用，在实验中的使用浓度很低，远未将DNA双螺旋结构中的小沟饱和。
这样，DNA双链高温变性时，单链部分的荧光染料分子发生重排，荧光染料分子重新结合到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此出现假阴性，特异性下降。
于是，饱和染料问世了。
为什么称为饱和染料呢？因为它们即便在饱和浓度（荧光最大）下，也不会抑制PCR。
高分辨溶解曲线突变检测
高分辨熔解曲线突变检测高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。
该方法与其他遗传分型技术相比具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点，是进行突变检测的迅速、廉价而有效的方法。
HRM原理HRM是在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线变化来检测突变的方法，溶解曲线的变化取决于DNA序列、长度、GC含量，因此，可以通过饱和燃料监控熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异，从而对样品进行分析。
在双链体的溶解曲线检测时需要添加合适的染料，饱和染料例如SYBR Green 在双链解链过程中会发生重排，无法真实反映DNA熔解情况。
不适用于需低温解链的样品而且不能检测异源双链体。
因此不能用于熔解曲线的检测。
而LC Green (Idaho)是一种与DNA有更强的结合位点，对PCR抑制作用很小的饱和染料，已成功的用于HRM检测中。
HRM操作简便，在PCR结束后添加合适的染料，通过监测升温过程中荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现的，在Lightscanner仪器（Idaho）升温过程中，双链解开，荧光染料从解链的分子上释放，同时荧光强度降低，所以通过荧光强度和曲线的变化上就可以判断是否存在突变。
HRM的特点和应用HRM应用：•检测人类疾病相关基因中常染色体的显隐性和X-连锁•鉴定人类肿瘤的体细胞突变，肿瘤样品中筛选体细胞突变•基因突变扫描：单碱基的改变、插入或缺失•特定突变、多态性位点的筛选•外显子和短扩增子基因型扫描HRM特点：•灵敏度高：杂合子突变体的检测的灵敏度可以达到100%，原则上数据分析时温度升高后纯合子或半合子的突变时检测不到的，但实际上，许多纯合子突变是可以检测到的。
如基因突变正好与x连锁，可以在PCR之前加入已知野生型样本来检测半合子或纯合子的突变。
hrm高分辨率溶解曲线
hrm高分辨率溶解曲线
HRM高分辨率溶解曲线是一种用于分析DNA序列变异的技术。
它通过在PCR反应中加入特异性引物和荧光染料，对PCR产物进行实时监测，从而获得高分辨率的溶解曲线。
HRM高分辨率溶解曲线具有高灵敏度、高分辨率和高通量等优点，可以用于检测DNA序列的变异、基因多态性、SNP等。
它不仅可以用于科研领域，还可以应用于临床诊断、生物信息学等领域。
HRM高分辨率溶解曲线的原理是利用PCR产物在变性过程中，双链DNA会逐渐解离成单链DNA，这个过程伴随着温度升高。
当温度升高到一定程度时，引物和模板之间的结合力会减弱，导致引物和模板之间的解离。
这个过程可以通过实时监测PCR产物的荧光信号变化来获得溶解曲线。
HRM高分辨率溶解曲线的应用非常广泛，例如在遗传疾病诊断、基因多态性分析、SNP筛查等领域都有应用。
在遗传疾病诊断中，HRM高分辨率溶解曲线可以用于检测基因突变或缺失，帮助医生更准确地诊断疾病。
在基因多态性分析中，HRM高分辨率溶解曲线可以用于研究不同人群或种群之间的基因变异情况。
在SNP筛查中，HRM高分辨率溶解曲线可以用于快速检测大量的SNP位点，帮助研究人员更全面地了解基因变异情况。
总之，HRM高分辨率溶解曲线是一种非常有用的技术，可以用于分析DNA序列变
异、基因多态性、SNP等。
它的应用非常广泛，可以为科研、临床诊断、生物信息学等领域提供有力的支持。
高分辨率溶解曲线HRM
软件自动基因分型，PCR产物不需要处理
谢谢！
25:67–90
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用
— 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping）
—小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
为何要使用温度内标
A>T SNP without Calibration – 72bp
Apply Temperature Calibration
A>T SNP with Calibration
Small Amplicon Genotyping
M.H.Ye等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为 56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线分别代表 纯合型CC和TT。
— 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping）
—小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
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• 第二类是酶切。步骤繁琐，费时，检测已 第二类是酶切。步骤繁琐，费时， 知SNP。结果不稳定。 。结果不稳定。 • 第三类方法中包括测序、Pyrosequencing 第三类方法中包括测序、 等技术。此外还有芯片等技术可用于SNP 等技术。此外还有芯片等技术可用于 分析； 分析；Pyrosequencing技术它既可进行 技术它既可进行 DNA序列分析，又可进行基于序列分析的 序列分析， 序列分析 SNP检测及表观遗传学甲基化的分析以及 检测及表观遗传学甲基化的分析以及 大规模的等位基因频率测定 。
• 条件要求
• 1、高分辨率：扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序 列。序列中如有一个碱基发生了突变，都会改变DNA链的 解链温度。但是这个差异极小，只有零点几摄氏度，如果 仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。那么什么样的分 辨率才是高分辨率呢？根据仪器现有的功能测试，在熔解 操作时每摄氏度至少要获得10个数据点，这是对仪器的最 低要求。此外，温度均一性也同样重要。如果两孔之间温 度相差0.1°C，就很可能导致最终的熔解温度相差0.1°C， 这样就无法保证HRM分析结果的准确性。 • 2、饱和染料：为什么要饱和染料呢？因为饱和染料饱和 了DNA双螺旋结构中的小沟，在DNA解链过程中就不会发 生重排，荧光信号能准确的反映DNA的解链。这样熔解曲 线才有了更高的分辨率。
• 方法
• 在PCR反应前将LC Green饱和荧光染料与 PCR反应体系 混合，然后将PCR产物直接放入LightScanner、HR-1或 Rotor-Gene 6000仪器中，在一定的温度范围内将PCR扩 增产物进行变性，就是对PCR的扩增子进行加热，温度从 50°C逐渐上升到95°C。在此过程中，扩增子逐渐解链。 在HRM分析的初期，荧光强度很高，随着温度升高，双 链DNA逐渐减少，荧光强度也就下降了。HRM仪器通过 照相机，记录下荧光变化的整个过程。通过对数据的作图， 就生成了熔解曲线 。
• 有些研究并不需要完全的基因型。而只需知道 有些研究并不需要完全的基因型。 DNA序列是否匹配，例如：组织移植、基因 序列是否匹配， 序列是否匹配 例如：组织移植、 表型的相关性和辩证性．在活器官移植中。 型．表型的相关性和辩证性．在活器官移植中。 需要对HLA进行基因分型．这个主要牵涉到 进行基因分型． 需要对 进行基因分型 这个主要牵涉到HLAA，B，C和DR等几个位点 A，B，C和DR等几个位点．当两个个体的熔解 等几个位点． 曲线完全相同时就说明HLA基因型完全匹配． 基因型完全匹配． 曲线完全相同时就说明 基因型完全匹配
Clinical Chemistry 54:10 1648–1656 (2008）
•
Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮 测序反应中，只加入一种dNTP（脱氧核糖核苷酸） ，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可 以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。 PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反 应中掺入的核苷酸数目成正比
• 突变扫描
• 目前应用 目前应用HRM进行突变扫描的基因有：C进行突变扫描的基因有： 进行突变扫描的基因有 kit、乙酰辅酶 脱酶的中链、原肉毒碱缺乏 脱酶的中链、 、乙酰辅酶A脱酶的中链 症、RET、表皮生长因子受体 、表皮生长因子受体EGFR、K— 、 ras、苯丙氨酸羟化酶、p53、HER2、囊肿 、苯丙氨酸羟化酶、 、 、 性纤维化基因的几个外显子等等． 性纤维化基因的几个外显子等等．
HRM在分子诊断中的应用
• • • • 基因分型 突变扫描 甲基化分析 序列配对
• 基因分型 • 传统的基因分型方法或者耗时费力，或者需要购 买价格不菲的探针。HRM分析无需制备探针；有 了饱和染料，PCR产物全程被标记，因此所有的 熔解区域都能检测到。对于同一扩增子内的不同 杂合体，通过曲线形状的差异也能区分开。
• HRM新技术的介绍 • 1、未标记探针HRM • 在HMR的基础上发明一种不带荧光标记的探针，由原来 的单一扩增产物的熔解曲线模式转变为由扩增产物与探针 两部分组成的模式。 • 2、弹回探针 • 弹回探针(snapback primer)是在引物末端加一个与靶片段 (snapback primer) 的突变区域互补的尾巴序列，反应体系是不对称 PCR(asymmetric PCR)，带有弹回探针的引物为过剩引 物(excess primer，EP)，另一条引物为限制引物(1imiting primer，LP)。扩增反应前几个循环为双链扩增，15个循 环左右后为单链扩增。熔解曲线区域包括PCR产物区与探 针区，通过对探针区的熔解曲线进行基因分型、突变等分 析
• 甲基化分析 • HRM分析还为DNA甲基化状态的检测另辟 蹊径。DNA样品通过亚硫酸氢盐的处理， 将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶。这样， 原先未甲基化模板所产生的PCR产物比甲 基化模板的Tm要低。
Nucleic Acids Research,2009,Vol.37,No.12
Hale Waihona Puke • 序列配对• 目前突变 目前突变/SNP的研究手段大致有三大类， 的研究手段大致有三大类， 的研究手段大致有三大类 • 一类是以荧光共振能量传递为基础的检测方法，比如Taqman探 一类是以荧光共振能量传递为基础的检测方法，比如 探 针法。显著特点是速度快，通量大。缺点是只能检测已知SNP， 针法。显著特点是速度快，通量大。缺点是只能检测已知 ， 昂贵。 昂贵。
HRM
_____一种用于突变扫描和基因分型的遗传学分析方法
• 高分辨率熔解曲线(high resolution melting)是在 实时荧光PCR基础上发展起来的一种新的实时定 量新技术。 • 常规Real-time PCR利用SYBR Green染料标记 DNA双链，但是SYBR Green是一种大分子即不 饱和染料，不能保证PCR产物全部的小沟都嵌合 上SYBRGreen，并且嵌合到产物中的染料如果在 扩增过程中不能及时脱落，还会抑制PCR反应。 • HRM采用新型的饱和染料如LC Green， SYTO 9 等。不仅没有不饱和染料的缺点，而且更易于检 测单碱基突变、小片段插入或缺失。
HRM主要特点
• 高分辨率溶解曲线（高分辨溶解曲线突变检测）是理想的 SNP检测手段： 快速、高通量—LightScanner 5分钟完成96/384孔板的 PCR产物检测， 20000个SNP/天 准确、灵敏度高、特异性好—LightScanner100%准确性 、特异性（<400bp）；准确性96.4%和特异性99.1%（ 400~1kb） 重复性好—LightScanner重复性100% 费用低—LightScanner检测SNP每个样品的成本为1RMB 操作简便—LightScanner只需将PCR产物（96/384孔板） 放入仪器内便可，软件自动基因分型
• 原理
• HRM是通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与 PCR产物的结合情况。SNP位点碱基不同会使双链 位点碱基不同 DNA的TM值发生变化从而双链DNA在升温过程中先 值发生变化 后解开，形成不同的融解曲线形状，荧光染料从 局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就 可以判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、杂合子与纯 合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有 效区分不同SNP位点与不同基因型。
•
THANKS !
• HRM已经在人类(双倍体)和微生物(单倍体)的基因分型中 得到应用．人类疾病基因包括球蛋白、囊肿性纤维化、V 因子、凝血素、血色沉着病蛋白、血小板抗原、乳糖分解 酵素和MGMT启动子区域的甲基化．微生物基冈有： hsp65、16s rRNA基因、gyrA等．
• SNP相关研究方法比较： 相关研究方法比较： 相关研究方法比较